快速制备海洋珍稀鱼类或贝类中期分裂相染色体的方法

摘要

快速制备海洋珍稀鱼类或贝类中期分裂相染色体的方法，属于海洋生物技术领域，所述方法包括：1)试验鱼或贝的暂养及载玻片的清洗；2)在确保试验动物存活状态良好后选取鳍条或鳃部有伤口的鱼或贝类单独饲养；3)取试验动物创口处的愈合增生组织进行染色体制备；本发明制备中期分裂相染色体的方法简单快捷，便于操作，充分利用愈合增生组织旺盛的分裂增生能力，制备染色体后基本保证试验动物仍能健康存活，可重复多次制备，所需试验动物可少至1个个体，适用于各种海洋珍稀鱼类和贝类。本发明可保证实验样品新鲜，细胞活性好，克服珍稀鱼类或贝类大多属于成熟或衰老状态、细胞分裂不旺盛的困难，制备的中期分裂相染色体形态好，分散度好，便于观察和计数。

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体的涉及一种快速制备海洋珍稀鱼类或贝类中期分裂相染色体的方法。

背景技术

染色体是遗传物质的载体，研究物种染色体，不仅可以探讨其分类地位和系统演化，也有助于近缘物种的鉴定和群落分析，对资源的开发利用和遗传育种都有重要的意义。海洋是生物多样性的宝库，海洋生物资源具有潜在或现实的价值，是人类重要的食物来源，每年为全球人类提供了22％的动物蛋白，许多海洋动物还具有重要的药用和工业价值，在动物界所记录的24个门中，超过2500种的有软体动物、脊索动物和节肢动物等3个门，其中海洋鱼类和头足类各占世界总数的14％(王斌，中国海洋生物多样性的保护和管理对策，生物多样性，1999，7(4)：347-350)。然而由于人类对海洋资源的开发利用强度日益加剧，世界海洋生物多样性受到各种威胁，如过度捕捞、生境丧失、环境污染、生态入侵和海水养殖品种单一化，致使许多珍稀海洋生物被毒死或受到伤害，有的则导致其基因突变或因被排挤而消失，我国海洋珍稀鱼类和贝类有很多种。贝类的染色体研究可追溯到1900年前后，但水生动物染色体制备方法一直少有重大突破，鱼类染色体一般形态偏小数目偏多，所以有关这两类物种的染色体研究长期进展缓慢，至2005年前后，已有染色体研究报道的鱼类和贝类总数与丰富的种群相比还有很大的差距。

1966年，Ojima等(Ojima Y S，Hitotsumachi S,Makino.Cytogentic studies inlower vertebrates.Proc Jap Acad,1966,42(1):62-66)首次采用低渗处理和空气干燥法制片取得成功，目前的染色体制片都采用这种方法，但采用这种方法很难制得大量中期分裂相且染色体图像清晰的片子，不能满足染色体相关分析的要求。人们普遍认为辅助使用PHA(植物血球凝集素)(Yamamoto K,Ojima Y.A PHA-culture method for cells fromtissue of teleosts.Japan J Genet,1973,48(3):235-238)能促进细胞分裂，增加分裂相，但这种染色体制备方法因多了PHA的处理程序，对试验动物多造成一次伤害，而且注射PHA和秋水仙素的方法所需时间较长，有些长达30多个小时，常因试验动物死亡而告失败。不同动物的不同组织细胞分裂相指数不尽相同，在大多数鱼类中，造血器官是肾脏(头肾)，尤其淡水鱼类在制作染色体制片时都采用肾脏组织。按照习惯用肾脏组织制片，有的鱼类的肾脏组织却不是很发达，得不到足够的分裂相(毛连菊，李雅娟.5种海水鱼类染色体的组型分析，大连水产学院学报，2002,17(2)：108-113)。也有取鱼类鳃组织和脾脏来制作染色体制片的，但制片成功的报道也只有绒杜父鱼和绵鳚的脾脏，而脾脏只在高等类群的鱼类中才比较发达。为了制备贝类大量的中期分裂相染色体，一般选用细胞分裂旺盛的材料，如胚胎、幼虫、幼贝和成贝的鳃、生殖腺、肾脏等(吴宝玲，国家攀登计划B类项目海水增养殖生物优良种质和抗病力的基础研究贝类繁殖附着变态生物学，山东科学技术出版社，1999)，这些操作都需要解剖杀死试验动物作为代价。

染色体制备需充分考虑实验目的和试验材料本身的特性，海洋鱼类和贝类从两极到赤道，从海岸到大洋，从表层到万米左右的深渊都有分布。生活环境的多样性，促成了海洋鱼类和贝类的多样性。尽管生活方式不尽相同，千姿百态的海洋鱼类和贝类都有两个的共同特点：具有呼吸水中溶解氧的鳃，鱼有便于水中运动的鳍，贝有保护内脏团的外套膜。海洋环境又是处处暗藏危机的，鱼体和贝体受到伤害是不可避免的，但鱼类和贝类都有伤口修复能力，伤口的修复过程实际上就是细胞分裂增生的过程。要制备珍稀物种大量分裂相染色体，必须保证试验动物的所取组织细胞大量处于分裂增生的状态，还要保证实验动物仍能健康存活。

鱼类和贝类的育种工作有不少种类都涉及到染色体组操作，如雌核发育和多倍体诱导等。育种初期获得的试验鱼都非常珍贵，科研人员想检测他们的染色体组成却又不舍得杀死试验动物。加上有很多的海洋鱼类和贝类都属于珍稀物种，如采用传统方法来制备染色体，不仅耗时长，还必须处死试验对象，代价极其惨重。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种快速制备海洋珍稀鱼类或贝类中期分裂相染色体的方法，所述方法通过对现有海水鱼类和贝类染色体制备方法的改进，以最少量的试验动物体表组织的愈合增生组织制备出大量的分散较好的中期分裂相染色体。利用本发明方法能快速制备出大量的中期分裂相染色体以满足各种海洋珍稀鱼类或贝类种质鉴定、倍性分析、原位杂交分析等有关染色体研究的需求。能克服试验鱼数量少、珍稀珍贵物种的限制，从取组织开始到观察结果，仅需4～5小时，操作简单便捷，可灵活调整制备步骤和处理强度，可在养殖育苗基地或生产单位随时开展，制备染色体后基本保证试验动物仍能健康存活。

本发明是按照以下操作方法完成的：

快速制备海洋珍稀鱼类或贝类中期分裂相染色体的方法，所述方法包括：1)试验鱼或贝的暂养及载玻片的清洗；2)在确保试验动物存活状态良好后选取鳍条或鳃部有伤口的鱼或贝类单独饲养；3)取试验动物创口处的愈合增生组织进行染色体制备。

所述的试验鱼或贝的暂养及玻片的清洗：为增加实验动物体表鳍条或鳃组织细胞分裂增生能力，将试验动物进行单独饲养，饲养的水体温度较其原养殖水体温度提高或降低2-3℃，以刺激试验动物体表组织细胞的分裂增生能力，精心饲养1-2天；染色体制片的载玻片要求干净无油污，不挂水，在染色体制备前清洗干净。

进一步，所述载玻片的清洗方法为先用中浓度重铬酸钾洗液浸泡24小时以上，所述的重铬酸钾洗液的配制方法为400ml溶液中由200ml的浓硫酸、200ml的蒸馏水、20g重铬酸钾组成，纯净水反复冲洗至洗液完全冲尽后控干水分，浸泡到无水乙醇中12小时，取出后酒精灯烧制，冷却后装盒备用，切勿用手碰触载玻片表面造成油渍污染。

所述的在确保试验动物存活状态良好后选取鳍条或鳃部本身有伤口的试验动物取其创面新长出的愈合组织供染色体制备；

所述的取试验动物创口处的愈合增生组织进行染色体制备：将所取的愈合增生组织1-8mm³，所取组织在过滤海水中漂洗后放入含有质量比为0.04％秋水仙素的50％海水中处理30-45分钟，然后放入0.0375M、0.05M或0.075M>

进一步，所述卡诺氏固定液为甲醇与冰醋酸的体积比为3:1的混合液。

进一步，所述50％的海水配制方法为纯净水与海水的体积比为1:1混合。

本发明与已有技术相比的有益效果：

1.本发明制备中期分裂相染色体的方法简单快捷，便于操作，充分利用愈合增生组织旺盛的分裂增生能力，制备染色体后基本保证试验动物仍能健康存活，可重复多次制备，所需试验动物可少至1个个体，适用于各种海洋珍稀鱼类和贝类。

2.采用本方法可保证实验样品新鲜，细胞活性好，克服珍稀鱼类或贝类大多属于成熟或衰老状态、细胞分裂不旺盛的困难，制备的中期分裂相染色体形态好，分散度好，便于观察和计数。

附图说明

图1波纹唇鱼中期分裂相染色体；

图2栉江珧中期分裂相染色体a、雄性栉江珧染色体，b、雌性栉江珧染色体。

具体实施方式

下面通过具体实施例结合附图对本发明进行详细说明，以下是最佳实施例具体操作工艺过程，本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1：

2010年4月，实验室50L水箱暂养1龄波纹唇鱼雌鱼1尾30天左右，体长23cm。波纹唇鱼是一种高级观赏鱼类，也是一种高级食用鱼类，由于过度捕捞，仅仅几年的时间，世界自然基金会将其列为10种濒临灭绝的生物物种之一(百科知识，十大濒临灭绝生物名单，2005，(6)：2,67；Donaldson T.J.，Sadovy Y.2001，Threatened fishes of the world:Cheilinus undulates Ruppell,1835(Labridae).Environ.Biol.Fish.62:428)，近年来，人们才开始关注该物种的人工繁殖、养殖、遗传分析。取其鳍条边缘一个微小创面愈合增生组织，经秋水仙素处理、KCL溶液低渗、carnoy氏液固定后，热滴片制片，制备的中期分裂相染色体形态好，分裂相数目多。

完成上述操作过程具体操作如下：

快速制备波纹唇鱼中期分裂相染色体的方法，其步骤包括：1)波纹唇鱼的暂养及玻片的清洗；2)在确保该波纹唇鱼存活状态良好后选其鳍条边缘处有一个微小伤口的波纹唇鱼单独饲养；3)取少量创面愈合增生组织进行染色体制备。

把波纹唇鱼放到提高2-3℃的水体中精养1-2天。提前准备好染色体制片的载玻片，要求干净无油污，不挂水，在染色体制备前就要清洗干净。先用中浓度重铬酸钾洗液浸泡24小时以上，所述的重铬酸钾洗液的配制方法为400ml溶液中由200ml的浓硫酸、200ml的蒸馏水、20g重铬酸钾组成，纯净水反复冲洗至洗液完全冲尽后控干水分，浸泡到无水乙醇中12小时左右，取出后酒精灯烧制，冷却后装盒备用，切勿用手碰触载玻片表面造成油渍污染。

如果在暂养过程中波纹唇鱼的鳍条有自然创伤，则取其创口处的愈合增生组织，如果没有自然创伤，可以在鳍条处人工制造一个微小创面，在制造人工创伤过程中，由于波纹唇鱼性烈，剪鳍容易受到惊吓致死，应该用海水浸湿的毛巾轻轻包裹其头部，沿尾鳍边界取0.1cm宽，0.5cm长的尾鳍组织，制造微小创面，把鱼放回水体中精养2-3天后，再取该创面愈合增生组织。所取愈合增生组织在过滤海水中漂洗后放入含有0.04％秋水仙素的50％海水(纯净水与海水以体积比1:1的比例混合)中处理30分钟，也可以是30-45分钟任一时间，用0.0375mol/L的KCL溶液低渗50分钟，KCL的浓度根据所取愈合增生组织的情况来选择，如果所取愈合增生组织中脂肪含量较高则选择0.05M或0.0375M的KCL作为低渗液，脂肪含量偏低的选择0.075M的KCL作为低渗液，再用预冷的新鲜配制的卡诺氏(Carnoy)液(甲醇与冰醋酸的体积比为3:1)充分固定。

然后采用热滴片法制片，制片时先用50％的冰醋酸溶液解离愈合增生组织成细胞悬液，通过弹壁或吸管吹打的方式，使细胞从组织团块中解离出来，放在4℃冰箱中预冷，载玻片放在光滑石板上或金属面上预热，石板或金属面可用电炉加热至55-60℃，吸取解离的细胞悬液，从50cm到1m的高处滴2滴至预热的载玻片上，用剪成的3层滤纸碎片的尖角快速吸干滴液，并把滴片移至旁边晾干。市售吉姆萨工作液染色30分钟，自来水流水冲洗载玻片表面多余的染色液约10秒钟，晾干后即可镜检，观察染色体形态。中期分裂相多，染色体形态和分散度均很好，见图1。

实施例2

2016年6月，从日照水产研究所取2枚性腺发育较好地栉江珧，雄性壳绞合部长约17.8cm，体重273.17g，雌性壳绞合部长19.5cm，体重291.31g。栉江珧在我国分布范围广泛，我国沿海省份几乎都有分布，肉味鲜美，营养丰富，经济价值很高，但针对栉江珧的研究相对较少，有关栉江珧性腺、人工催产和幼虫培育条件的研究报道不多，由于其繁殖生物学的特殊性，人工苗种生产仍未达到规模化生产水平，近年来日益增长的市场需求导致滥捕滥采，栉江珧的自然资源大幅减少，栉江珧的保护和遗传多样性研究亟待加强。通过直接在鳃边缘制造一个微小伤口后取创面愈合增生组织，经秋水仙素处理、KCL溶液低渗、carnoy氏液固定后，热滴片制片，制备的中期分裂相染色体形态好，分裂相数目多。

完成上述操作过程具体操作如下：

快速制备栉江珧中期分裂相染色体的方法，其步骤包括：1)栉江珧成贝的暂养及玻片的清洗；2)在确保试验栉江珧存活状态良好后在鳃丝边缘制造一个微小伤口后单独饲养；3)用所取少量创口愈合增生组织进行染色体制备。

把栉江珧放到提高2-3℃的水体中精养1-2天。提前准备好染色体制片的载玻片，要求干净无油污，不挂水，在染色体制备前就要清洗干净。先用中浓度重铬酸钾洗液(浓硫酸200ml，蒸馏水200ml，重铬酸钾20g)浸泡24小时以上，纯净水反复冲洗至洗液完全冲尽后控干水分，浸泡到无水乙醇中12小时左右，取出后酒精灯烧制，冷却后装盒备用，切勿用手碰触载玻片表面造成油渍污染。把栉江珧拿出水体阴干，约半小时后，栉江珧会自己张开双壳，用一个约1cm厚的软塑料板塞在壳腹缘处使双壳无法闭合，迅速沿鳃丝边界取0.2cm宽，0.3cm长的鳃丝，制造微小创面，把栉江珧放回水体中精养2-3天后，再取该创面愈合增生组织。如果有栉江珧鳃丝边缘有自然的创伤则可以直接取创伤口处的愈合增生组织。所取愈合增生组织在过滤海水中漂洗后放入含有0.04％秋水仙素的50％海水(纯净水与海水以体积比1:1混合)中处理30-45分钟，用0.075mol/L的KCL溶液低渗30-45分钟，再用预冷的新鲜配制的卡诺氏(Carnoy)液(甲醇：冰醋酸＝3:1)充分固定。

然后采用热滴片法制片，制片时先用50％的冰醋酸溶液解离鳃组织或愈合增生组织成细胞悬液，通过弹壁或吸管吹打的方式，使细胞从组织团块中解离出来，放在4℃冰箱中预冷，载玻片放在光滑石板上或金属面上预热，石板或金属面可用电炉加热至55-60℃，吸取解离的细胞悬液，从70cm的高处滴3滴至预热的载玻片上，用剪成的4层滤纸碎片的尖角快速吸干滴液，并把滴片移至旁边晾干。市售10％吉姆萨(Giemsa)工作液染色30分钟，自来水流水冲洗载玻片表面多余的染色液约10秒钟，晾干后即可镜检，观察染色体形态。中期分裂相多，染色体形态和分散度均很好，见图2。

我们发明的这种快速制备海洋珍稀鱼类和贝类中期分裂相染色体的方法，还适用于制备其他海洋鱼类和贝类的中期分裂相染色体，为这些物种的保护、种质鉴定、遗传育种、性别控制等研究提供遗传依据。