一种金针菇单细胞选育优良菌株的方法

摘要

本发明公开了一种金针菇单细胞选育优良菌株的方法，该方法包括接种培养、分离单细胞、接种培养单细胞、培养发菌、出菇和筛选；金针菇品种选育是金针菇产业发展关键之一，而传统金针菇菌种在长期保存过程中，用于菌丝细胞内细胞核分离不一致，造成菌种活力下降，本发明通过单细胞分离可获得细胞核分裂同步的菌种，淘汰细胞核分裂不同步、退化的菌种，从而获得更优良菌种；利用本发明方法筛选出菌株的产量较杂交种高32.9%～39.3%，生育期和产品质量与原菌种一致；本发明方法操作简单、成本低、周期短、适用于工业化大规模生产。

说明书

技术领域

本发明属于真菌育种领域，具体涉及一种金针菇单细胞选育优良菌株的方法。

背景技术

金针菇学名为毛柄金钱菌(Flammulina velutiper(Fr.)Sing)，它既是一种美味食品，又是较好的保健食品。金针菇性寒，味甘、咸，具有补肝、益肠胃、抗癌的功效，主治肝病、胃肠道炎症、溃疡、肿瘤等病症。金针菇中锌含量较高，对预防男性前列腺疾病较有帮助。而且金针菇还是高钾低钠食品，可预防高血压，对老年人也有益。金针菇氨基酸的含量也非常丰富，高于一般菇类，尤其是赖氨酸的含量特别高，赖氨酸具有促进儿童智力发育的功能。最近有研究表明，金针菇还具有很好的抗癌作用。

金针菇是我国工厂化生产发展最快的食用菌种类。几十年来，为了跟上产业发展的要求，国内同行一直致力于金针菇新品种的选育。品种选育必然需要进行栽培出菇试验，以确定其子实体形状的优劣，进而选择优质的菌种。金针菇品种选育方法主要有杂交育种、诱变育种和基因工程育种等，然而，这些方法的缺点在于：育种周期长、选育1个新品种需要3-5年，需要大量的原材料和设施设备。对于能源的消耗非常大，而且人力方面的需求也很大，另外也比较容易造成不同菌株孢子间的相互附着，造成菌种遗传表现的不稳地。这些缺点会导致资源方面的浪费，及研究经费的约束，大大降低了育种效率。且金针菇菌种在长期保存过程中，用于菌丝细胞内细胞核分离不一致，造成菌种活力下降。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种金针菇单细胞选育优良菌株的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种金针菇单细胞选育优良菌株的方法，它包括以下步骤：

S1.接种培养：在无菌环境下，取出发菌种块，接种于菌丝体培养基中，在20～25℃静置培养5～7d；

S2.分离单细胞：取接种培养后的菌丝体3～5g放入容器中，加入细胞壁溶解酶制剂，在28～34℃下震荡3～4h，过滤收集滤液用硫酸镁溶液稀释至单细胞浓度为1×10³个/ml，得原生质体悬浮液；

S3.接种培养单细胞：取原生质体悬浮液0.1ml涂抹接种于单细胞培养基表面，置于20～25℃的培养箱中培养8～10d，待单细胞培养基表面生长出白色菌落后，选取单个菌落接种于新的单细胞培养基中，在20～25℃下继续培养，选取具有双核单细胞菌株进行筛选试验；

S4.培养发菌：于无菌环境下在出菇培养基中接种双核单细胞菌株，在20～25℃培养25～30d，长满菌丝体；

S5.出菇：将培养发菌后的菌袋移至出菇房内，去除表面菌种，控制出菇房温度为7～15℃、空气相对湿度为90～95％，光照强度为5～10Lx，待子实体生长至3～4cm时，子实体上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直径为2～3cm的透气孔，子实体生长长度至20～22cm时采收；

S6.筛选：对单细胞菌种和出发菌种进行菌丝体的生长速度、生育期、产量和产品质量进行比较，筛选出产量高于出发菌种10％以上的单细胞菌种为优良菌种。

进一步地，步骤S1所述菌丝体培养基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：5～6g、葡萄糖：20～22g、加水定容至1000ml。

进一步地，步骤S2中所述分离酶制剂为溶壁酶溶于0.6mol的MgSO₄溶液。

进一步地，步骤S3中所述单细胞培养基每1000ml含有下述重量的原料：马铃薯：180～200g、蔗糖：100～110g、琼脂：20g、加水定容至1000ml。

进一步地，步骤S4中所述出菇培养基由下述重量份的原料组成：棉籽壳70～90、麸皮15～22、石膏0.5～2、石灰0.5～2。

所述培养基的含水量为60～70％。

本发明具有以下优点：金针菇品种选育是金针菇产业发展关键之一，而传统金针菇菌种在长期保存过程中，用于菌丝细胞内细胞核分离不一致，造成菌种活力下降，本发明通过单细胞分离可获得细胞核分裂同步的菌种，淘汰细胞核分裂不同步、退化的菌种，从而获得更优良菌种；利用本发明方法筛选出菌株的产量较杂交种高32.9％～39.3％，生育期和产品质量与原菌种一致；本发明方法操作简单、成本低、周期短、适用于工业化大规模生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1：一种金针菇单细胞选育优良菌株的方法，它包括以下步骤：

S1.接种培养：在无菌环境下，取出发菌种块，接种于菌丝体培养基中，在20℃静置培养5d；所述菌丝体培养基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：5g、葡萄糖：20g、加水定容至1000ml；制备方法为：在锅内装入1000ml水，加入酵母粉和葡萄糖，使其完全融化，然后加水定容至1000ml，将培养基装入体积为300ml三角瓶内，装量为50ml，瓶口用透气膜封口，在高压灭菌锅内121℃下灭菌处理30分钟；

S2.分离单细胞：取接种培养后的菌丝体3g放入容器中，加入细胞壁溶解酶制剂，分离酶制剂为溶壁酶溶于0.6mol的MgSO₄溶液，在28℃下震荡3h，过滤收集滤液用硫酸镁溶液稀释至单细胞浓度为1×10³个/ml，得原生质体悬浮液；

S3.接种培养单细胞：取原生质体悬浮液0.1ml涂抹接种于单细胞培养基表面，置于20℃的培养箱中培养8d，待单细胞培养基表面生长出白色菌落后，选取单个菌落接种于新的单细胞培养基中，在20℃下继续培养，选取具有双核单细胞菌株进行筛选试验；所述单细胞培养基每1000ml含有下述重量的原料：马铃薯：180g、蔗糖：100g、琼脂：20g、加水定容至1000ml；制备方法为：将马铃薯去皮切成片，放入锅内，加入水1000ml，加热煮沸30分钟，用4层纱布过滤，在滤液中加入琼脂，继续加热煮沸至琼脂完全融化为止，加入蔗糖加热搅拌至蔗糖完全融化，加入水定容至1000ml，取培养基200ml装入300ml的三角瓶内，用封口膜封口，在121℃灭菌处理30min，将无菌培养基倒入无菌培养皿内，培养皿内培养基为20ml，冷却后即可；

S4.培养发菌：于无菌环境下在出菇培养基中接种双核单细胞菌株，在20℃培养25d，长满菌丝体；所述出菇培养基由下述重量份的原料组成：棉籽壳70、麸皮15、石膏0.5、石灰0.5；

S5.出菇：将培养发菌后的菌袋移至出菇房内，去除表面菌种，控制出菇房温度为7℃、空气相对湿度为90％，光照强度为5Lx，待子实体生长至3cm时，子实体上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直径为2cm的透气孔，子实体生长长度至20cm时采收；

S6.筛选：对单细胞菌种和出发菌种进行菌丝体的生长速度、生育期、产量和产品质量进行比较，筛选出产量高于出发菌种10％以上的单细胞菌种为优良菌种。

实施例2：一种金针菇单细胞选育优良菌株的方法，它包括以下步骤：

S1.接种培养：在无菌环境下，取出发菌种块，接种于菌丝体培养基中，在25℃静置培养7d；所述菌丝体培养基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：6g、葡萄糖：22g、加水定容至1000ml；制备方法为：在锅内装入1000ml水，加入酵母粉和葡萄糖，使其完全融化，然后加水定容至1000ml，将培养基装入体积为300ml三角瓶内，装量为50ml，瓶口用透气膜封口，在高压灭菌锅内121℃下灭菌处理30分钟；

S2.分离单细胞：取接种培养后的菌丝体5g放入容器中，加入细胞壁溶解酶制剂，分离酶制剂为溶壁酶溶于0.6mol的MgSO₄溶液，在34℃下震荡4h，过滤收集滤液用硫酸镁溶液稀释至单细胞浓度为1×10³个/ml，得原生质体悬浮液；

S3.接种培养单细胞：取原生质体悬浮液0.1ml涂抹接种于单细胞培养基表面，置于25℃的培养箱中培养10d，待单细胞培养基表面生长出白色菌落后，选取单个菌落接种于新的单细胞培养基中，在25℃下继续培养，选取具有双核单细胞菌株进行筛选试验；所述单细胞培养基每1000ml含有下述重量的原料：马铃薯：200g、蔗糖：110g、琼脂：20g、加水定容至1000ml；制备方法为：将马铃薯去皮切成片，放入锅内，加入水1000ml，加热煮沸30分钟，用4层纱布过滤，在滤液中加入琼脂，继续加热煮沸至琼脂完全融化为止，加入蔗糖加热搅拌至蔗糖完全融化，加入水定容至1000ml，取培养基200ml装入300ml的三角瓶内，用封口膜封口，在121℃灭菌处理30min，将无菌培养基倒入无菌培养皿内，培养皿内培养基为25ml，冷却后即可；

S4.培养发菌：于无菌环境下在出菇培养基中接种双核单细胞菌株，在25℃培养30d，长满菌丝体；所述出菇培养基由下述重量份的原料组成：棉籽壳90、麸皮22、石膏2、石灰2；

S5.出菇：将培养发菌后的菌袋移至出菇房内，去除表面菌种，控制出菇房温度为15℃、空气相对湿度为95％，光照强度为10Lx，待子实体生长至4cm时，子实体上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直径为3cm的透气孔，子实体生长长度至22cm时采收；

S6.筛选：对单细胞菌种和出发菌种进行菌丝体的生长速度、生育期、产量和产品质量进行比较，筛选出产量高于出发菌种10％以上的单细胞菌种为优良菌种。

实施例3：一种金针菇单细胞选育优良菌株的方法，它包括以下步骤：

S1.接种培养：在无菌环境下，取出发菌种块，接种于菌丝体培养基中，在22℃静置培养6d；所述菌丝体培养基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：5.3g、葡萄糖：21g、加水定容至1000ml；制备方法为：在锅内装入1000ml水，加入酵母粉和葡萄糖，使其完全融化，然后加水定容至1000ml，将培养基装入体积为300ml三角瓶内，装量为50ml，瓶口用透气膜封口，在高压灭菌锅内121℃下灭菌处理30分钟；

S2.分离单细胞：取接种培养后的菌丝体3.5g放入容器中，加入细胞壁溶解酶制剂，分离酶制剂为溶壁酶溶于0.6mol的MgSO₄溶液，在30℃下震荡3.5h，过滤收集滤液用硫酸镁溶液稀释至单细胞浓度为1×10³个/ml，得原生质体悬浮液；

S3.接种培养单细胞：取原生质体悬浮液0.1ml涂抹接种于单细胞培养基表面，置于22℃的培养箱中培养9d，待单细胞培养基表面生长出白色菌落后，选取单个菌落接种于新的单细胞培养基中，在22℃下继续培养，选取具有双核单细胞菌株进行筛选试验；所述单细胞培养基每1000ml含有下述重量的原料：马铃薯：190g、蔗糖：105g、琼脂：20g、加水定容至1000ml；制备方法为：将马铃薯去皮切成片，放入锅内，加入水1000ml，加热煮沸30分钟，用4层纱布过滤，在滤液中加入琼脂，继续加热煮沸至琼脂完全融化为止，加入蔗糖加热搅拌至蔗糖完全融化，加入水定容至1000ml，取培养基200ml装入300ml的三角瓶内，用封口膜封口，在121℃灭菌处理30min，将无菌培养基倒入无菌培养皿内，培养皿内培养基为22ml，冷却后即可；

S4.培养发菌：于无菌环境下在出菇培养基中接种双核单细胞菌株，在22℃培养26d，长满菌丝体；所述出菇培养基由下述重量份的原料组成：棉籽壳75、麸皮18、石膏1、石灰1；

S5.出菇：将培养发菌后的菌袋移至出菇房内，去除表面菌种，控制出菇房温度为10℃、空气相对湿度为92％，光照强度为7Lx，待子实体生长至3.5cm时，子实体上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直径为2.5cm的透气孔，子实体生长长度至21cm时采收；

S6.筛选：对单细胞菌种和出发菌种进行菌丝体的生长速度、生育期、产量和产品质量进行比较，筛选出产量高于出发菌种10％以上的单细胞菌种为优良菌种。

实施例4：一种金针菇单细胞选育优良菌株的方法，它包括以下步骤：

S1.接种培养：在无菌环境下，取出发菌种块，接种于菌丝体培养基中，在24℃静置培养6.5d；所述菌丝体培养基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：5.8g、葡萄糖：21g、加水定容至1000ml；制备方法为：在锅内装入1000ml水，加入酵母粉和葡萄糖，使其完全融化，然后加水定容至1000ml，将培养基装入体积为300ml三角瓶内，装量为50ml，瓶口用透气膜封口，在高压灭菌锅内121℃下灭菌处理30分钟；

S2.分离单细胞：取接种培养后的菌丝体4.5g放入容器中，加入细胞壁溶解酶制剂，分离酶制剂为溶壁酶溶于0.6mol的MgSO₄溶液，在32℃下震荡3.5h，过滤收集滤液用硫酸镁溶液稀释至单细胞浓度为1×10³个/ml，得原生质体悬浮液；

S3.接种培养单细胞：取原生质体悬浮液0.1ml涂抹接种于单细胞培养基表面，置于24℃的培养箱中培养9.5d，待单细胞培养基表面生长出白色菌落后，选取单个菌落接种于新的单细胞培养基中，在24℃下继续培养，选取具有双核单细胞菌株进行筛选试验；所述单细胞培养基每1000ml含有下述重量的原料：马铃薯：195g、蔗糖：108g、琼脂：20g、加水定容至1000ml；制备方法为：将马铃薯去皮切成片，放入锅内，加入水1000ml，加热煮沸30分钟，用4层纱布过滤，在滤液中加入琼脂，继续加热煮沸至琼脂完全融化为止，加入蔗糖加热搅拌至蔗糖完全融化，加入水定容至1000ml，取培养基200ml装入300ml的三角瓶内，用封口膜封口，在121℃灭菌处理30min，将无菌培养基倒入无菌培养皿内，培养皿内培养基为24ml，冷却后即可；

S4.培养发菌：于无菌环境下在出菇培养基中接种双核单细胞菌株，在24℃培养28d，长满菌丝体；所述出菇培养基由下述重量份的原料组成：棉籽壳85、麸皮20、石膏1.5、石灰1.5；

S5.出菇：将培养发菌后的菌袋移至出菇房内，去除表面菌种，控制出菇房温度为14℃、空气相对湿度为94％，光照强度为9Lx，待子实体生长至4cm时，子实体上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直径为2cm的透气孔，子实体生长长度至22cm时采收；

S6.筛选：对单细胞菌种和出发菌种进行菌丝体的生长速度、生育期、产量和产品质量进行比较，筛选出产量高于出发菌种10％以上的单细胞菌种为优良菌种。

对实施例1、2的出发菌株和筛选出的单细胞菌株的平均产量进行对比，结果如表1所示。

表1：实施例1、2金针菇单细胞菌株和出发菌株产量比较结果

名称出发菌株产量(g/袋)单细胞菌株(g/袋)实施例1467.1650.9实施例2187.4249.1