从生产类胡萝卜素的生物有机体分离类胡萝卜素的方法

摘要

本发明涉及经改良的从生产类胡萝卜素的生物有机体分离类胡萝卜素的方法，还涉及包含这种类胡萝卜素的制剂，以及这种固体制剂在饲料产品(或预混物)中的用途。

说明书

本发明涉及经改良的从生产类胡萝卜素的生物有机体分离类胡萝卜素的方法，还涉及包含这种类胡萝卜素的制剂，以及这种固体制剂在饲料产品(或预混物)中的用途。

类胡萝卜素是由某些生物有机体天然产生的、颜色在黄色至红色范围内的有机色素，上述生物有机体包括光合有机体(例如，植物、藻类、蓝藻)和一些真菌。类胡萝卜素是使胡萝卜呈橙色的原因，同时也是使火烈鸟和鲑鱼呈粉红色和龙虾与小虾呈红色的原因。然而，动物无法产生类胡萝卜素并且必须通过它们的饮食来接收类胡萝卜素。

工业上将类胡萝卜素色素(例如β-胡萝卜素和虾青素)用作食品和饲料原料的成分，从而起到营养功能和增强消费者的可接受性两种作用。例如，虾青素广泛用于鲑鱼水产养殖中以使其具有其野生对应物的粉/红色着色特征。一些类胡萝卜素还提供潜在的健康益处，例如作为维生素A前体或抗氧化剂(参见例如Jyonouchi等,Nutr,Cancer 16:93,1991；Giovannucci等,/.Natl.Cancer Inst.87:1767,1995；Miki,Pure Appl.Chem 63:141,1991；Chew等,Anticancer Res.19:1849,1999；Wang等,Antimicrob.Agents Chemother.44:2452,2000)。一些类胡萝卜素(例如虾青素、β-胡萝卜素、番茄红素、黄体素(lutein)和玉米黄质)目前作为营养补充剂出售。

天然类胡萝卜素可以通过提取植物材料或者通过微生物合成来获得；但是只有少数植物被广泛用于类胡萝卜素商业生产，并且这些植物中类胡萝卜素合成的生产率相对较低。类胡萝卜素的微生物生产是更具有吸引力的生产路线。生产类胡萝卜素的微生物(＝生物有机体)的例子包括：藻类(Haematococcus pluvialis，由夏威夷州Kailua-Kona的Cyanotech Corp.以商品名NatuRose(TM)出售；Dunaliella sp.；Thraus-tochytrium sp.)，酵母(Phaffia rhodozyma，近来重新命名为Xanthophyllomyces den-drorhous；Labyrinthula sp.；Saccharomyces cerevisiae和Yarrowia lipolytica)，和细菌(Paracoccus marcusii,Bradyrhizobium,Rhodobacter sp.,Brevibacterium,Escherichia coli和Methylomonas sp.)。此外，也可以重组生产类胡萝卜素，因为类胡萝卜素生物合成中所涉及的基因是公知的并且已经在各种宿主细胞(例如E.coli、Candida utilis、Saccharomyces cerevisiae、Methylomonas sp.)中被异源表达。迄今为止，这些示范中几乎没有谁适合用于工业用途中以较高的成本效率以相当大的量生产类胡萝卜素产品。

本发明涉及经改良的从生产类胡萝卜素的生物有机体分离类胡萝卜素的方法，还涉及包含这种类胡萝卜素的制剂，以及这种固体制剂在饲料产品(或预混物)中的用途。

通常，这些生物有机体产生类胡萝卜素、视黄醇类化合物或其他小分子亲脂性试剂，并且积累所产生的化合物至大于或等于其干细胞重的1％。

目前，类胡萝卜素是如下获得的：

在生物有机体已经完成类胡萝卜素的生产后，将类胡萝卜素分离、洗涤并进一步配制成所期望的应用形式。

我们惊讶地发现：当使用布朗斯台德酸(acid)水溶液利用洗涤步骤处理经分离的类胡萝卜素至少一次时，所获得的类胡萝卜素具有更好的性质(例如，晶型的纯度，其导致更好的制剂(稳定的乳剂)，因为来自所述方法的不期望的亲脂性残渣较少)。

因此，本发明涉及从生产类胡萝卜素的生物有机体分离类胡萝卜素的方法(P)，所述方法包括以下步骤：

(i)利用至少一种溶剂(I)从生物质提取类胡萝卜素，和

(ii)任选地，使用至少一种与溶剂(I)不混溶的溶剂(II)进行至少一个洗涤步骤，和

(iii)任选地，干燥包含类胡萝卜素的所获得溶液，

其特征在于：在步骤(i)之后，使用布朗斯台德酸水溶液进行至少一个洗涤步骤(步骤(i’))。

优选的是这样的方法，其中布朗斯台德酸选自磷酸和有机酸。

更优选地，布朗斯台德酸是有机酸。

更优选地，布朗斯台德酸选自柠檬酸、酒石酸和马来酸。

因此，本发明涉及方法(P₁)，其是方法(P)，其中布朗斯台德酸选自磷酸和有机酸。

因此，本发明涉及方法(P₂)，其是方法(P)，其中布朗斯台德酸是有机酸。

因此，本发明涉及方法(P₃)，其是方法(P)，其中布朗斯台德酸选自柠檬酸、酒石酸和马来酸。

根据本发明的方法中布朗斯台德酸水溶液的浓度可变化。布朗斯台德酸水溶液的浓度通常为至多10重量％(wt-％)，以所述水溶液的总重量为基础。布朗斯台德酸的浓度通常为至少0.01重量％，优选地布朗斯台德酸的浓度为0.01-10重量％、更优选地1-5重量％，以所述水溶液的总重量为基础。

因此，本发明涉及方法(P₄)，其是方法(P)、(P₁)、(P₂)或(P₃)，其中布朗斯台德酸水溶液的浓度为0.01-10重量％(wt-％)，以所述水溶液的总重量为基础，优选地1-5重量％，以所述水溶液的总重量为基础。

根据本发明的方法可以分批进行，也可以连续进行。这种灵活性也是巨大的优势。

所获得的晶体相较于通过根据现有技术方法所获得那些具有更好的性质。

通常在环境温度(20-25℃)下进行提取(步骤(i))。但也可以在更高或更低的温度下(任选地在压力下)进行该方法。优选地，在低于用于提取的溶剂的沸点的温度下进行该方法。

优选地，在至少一种溶剂中进行从生物质提取类胡萝卜素(步骤(i))。这种溶剂或溶剂混合物优选地与水不混溶。步骤(i)的合适溶剂有例如CH₂Cl₂、氯仿、正庚烷和正己烷。

因此，本发明涉及方法(P₅)，其是方法(P)、(P₁)、(P₂)、(P₃)或(P₄)，其中在至少一种与水不混溶的溶剂中进行从生物质提取类胡萝卜素(步骤(i))。

因此，本发明涉及方法(P₆)，其是方法(P)、(P₁)、(P₂)、(P₃)、(P₄)或(P₅)，其中在至少一种溶剂中进行从生物质提取类胡萝卜素(步骤(i))，所述溶剂选自CH₂Cl₂、氯仿、正庚烷和正己烷。

通常在环境温度(20-25℃)下进行提取(步骤(i))。但也可以在更高或更低的温度下(任选地在压力下)进行该方法。优选地，在低于用于提取的溶剂的沸点的温度下进行该方法(以避免需要使用压力)。

可对生物质进行原样提取；或者可首先研磨(并任选地干燥)生物质，然后进行提取；可以干燥(并任选地研磨)生物质，然后进行提取；或者可同时研磨和提取生物质。还可以组合这些程序中的任何。

根据本发明的方法还可包括一个或更多个另外的洗涤步骤。这不是本发明的必要特征，但其可进一步改善所获得类胡萝卜素的品质。

在步骤(i)之后且在步骤(i’)之前和/或之后进行这种洗涤步骤(步骤(ii))。

利用至少一种与步骤(i)中所用溶剂(I)不混溶的溶剂(II)进行洗涤步骤。

因此，本发明涉及方法(P₇)，其是方法(P)、(P₁)、(P₂)、(P₃)、(P₄)、(P₅)或(P₆)，其中在步骤(i)之后且在步骤(i’)之前和/或之后进行一个或多个洗涤步骤(步骤(ii))。

最后，在步骤(iii)中，可以对制剂进行干燥以获得干燥形式的类胡萝卜素。但也可以使用在溶剂中的(或分散在提取溶剂中的)类胡萝卜素。

还可以在提取步骤(步骤(i))之后，在额外步骤中除去溶剂。这在下列情况下可能是有用的：整个分离过程例如在两个不同位置进行且/或为了在下一步之前储存经提取的材料。没有任何溶剂时运输和储存更加简单。

生物有机体产生类胡萝卜素(或也产生视黄醇类化合物或其他小分子亲脂性试剂)并且积累所产生的化合物至大于或等于其干细胞重的1％。

在本文中使用时，术语“生物有机体”包括例如，动物、哺乳动物、昆虫、植物、真菌、酵母、藻类、细菌、蓝藻、古细菌和原生动物生物有机体。

产生类胡萝卜素的生物有机体可以是天然的(以自然界中发现的形式)，或者其可以是经修饰的。

合适的生物有机体是现有技术中已知的，例如从WO2006102342中可获知。

在本领域中，术语“类胡萝卜素”被理解为指的是由类异戊二烯通路的中间体得到的一类结构多样的色素。类胡萝卜素生物合成中的关键(commitment)步骤为由香叶基香叶基焦磷酸形成八氢番茄红素(phytoene)。类胡萝卜素可以是无环或环状的，并且可以包含氧或可以不含氧，因此术语“类胡萝卜素”既包括胡萝卜素又包括叶黄素(xanthophylls)。总的来说，类胡萝卜素为具有形式上衍生自五碳化合物IPP的共轭多烯碳骨架的烃化合物，包括三萜(C₃₀双阿朴类胡萝卜素(diapocarotenoids))和四萜(C₄₀类胡萝卜素)，以及其氧化衍生物和例如长度为C₃₅、C₅₀、C₆₀、C₇₀、C₈₀或其它长度的其它化合物。许多类胡萝卜素具有强的吸光性质，并且其长度可在超过C₂₀₀的范围内。C₃₀双阿朴类胡萝卜素通常由6个类异戊二烯单元组成，所述类异戊二烯单元以使类异戊二烯单元的排列在分子中心处倒转从而使两个中心甲基呈1,6位关系而剩余非末端甲基呈1,5位关系的方式连接。在形式上，这类C₃₀类胡萝卜素可通过以下方法从具有共轭双键长中心链的无环C₃₀H₄₂结构获得：(i)氢化；(ii)脱氢；(iii)环化；(iv)氧化；(v)酯化/糖基化；或这些方法的任何组合。C₄₀类胡萝卜素通常由八个类异戊二烯单元组成，所述类异戊二烯单元以使类异戊二烯单元的排列在分子中心处倒转从而使两个中心甲基呈1,6位关系而剩余非末端甲基呈1,5位关系的方式连接。在形式上，这类C₄₀类胡萝卜素可通过以下方法从具有共轭双键长中心链的无环C₄₀H₅₆结构获得：(i)氢化；(ii)脱氢；(iii)环化；(iv)氧化；(v)酯化/糖基化；或这些方法的任何组合。这类C₄₀类胡萝卜素还包括由碳骨架重排或通过(形式上)移除部分这种结构而产生的某些化合物。自然界中已鉴别出超过600种不同的类胡萝卜素。

类胡萝卜素包括但不限于：表氧化玉米黄质(antheraxanthin)、金盏花红素(adonirubin)、金盏花黄质(adonixanthin)、虾青素(astaxanthin)、角黄素(canthaxanthin)、辣椒红素(capsorubrin)、β-隐黄素(β-cryptoxanthin)、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、海胆酮(echinenone)、3-羟基海胆酮、3'-羟基海胆酮、γ-胡萝卜素、ψ-胡萝卜素、4-酮-γ-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、α-隐黄素、脱氧屈曲黄素(deoxyflexixanthin)、硅藻黄质(diatoxanthin)、7,8-二脱氢虾青素、二脱氢番茄红素、岩藻黄质(fucoxanthin)、岩藻黄醇(fucoxanthinol)、异胡萝卜素(isorenieratene)、β-异胡萝卜素、莴苣黄素(lactucaxanthin)、黄体素(lutein)、番茄红素(lycopene)、myxobactone、mimulaxanthin、新黄质(neoxanthin)、链孢红素(neurosporene)、羟基链孢红素、多甲藻素(peridinin)、八氢番茄红素(phytoene)、视紫红质(rhodopin)、视紫红质葡糖苷(glucoside)、玫红黄质(rhodoxanthin)、4-酮玉红黄质、管藻黄质(siphonaxanthin)、球形(红极毛杆菌)烯(spheroidene)、球形(红极毛杆菌)酮(spheroidenone)、螺菌黄质(spirilloxanthin)、红酵母烯(torulene)、4-酮-红酵母烯、3-羟基-4-酮-红酵母烯、尿酸醋(uriolide)、尿酸醋酸酯、紫黄质(violaxanthin)、玉米黄质-β-二葡糖苷、玉米黄质以及C₃₀类胡萝卜素。此外，类胡萝卜素化合物包括这些分子的衍生物，其可包含羟基官能团、甲氧基官能团、氧基官能团、环氧基官能团、羧基官能团或醛官能团。另外，所包括的类胡萝卜素化合物包括酯(例如，糖苷酯、脂肪酸酯、乙酰化)和硫酸酯衍生物(例如经酯化的叶黄素)。优选地，类胡萝卜素选自虾青素、虾青素衍生物(例如，经酯化的虾青素)、玉米黄质以及玉米黄质衍生物(例如，经酯化的玉米黄质)。

根据本发明产生的类胡萝卜素可以被用于多种应用中的任一种中，例如开发利用其生物性质或营养性质(例如，抗氧化剂等)和/或其色素性质。举例来说，类胡萝卜素可用于药物(参见，例如，Bertram,Nutr.Rev.57:182,1999；Singh等,Oncology 12:1643,1998；Rock,Pharmacol.Titer.75:185,1997；Edge等,J.Photochem Photobiol 41:189,1997；美国专利申请2004/0116514；美国专利申请2004/0259959)，食物补充剂(参见，例如,Koyama等,J.Photochem Photobiol 9:265,1991；Bauernfeind,Carotenoids as colorants and vitamin A precursors,Academic Press,NY,1981；美国专利申请2004/0115309；美国专利申请2004/0234579)，电光应用、动物饲料添加剂(参见，例如,Krinski,Pure Appl.Chem.66:1003,1994；Polazza等,Meth.Enzymol.213:403,1992)，化妆品(作为抗氧化剂和/或作为化妆品，包括芳香剂；参见例如美国专利申请2004/0127554)等。根据本发明产生的类胡萝卜素还可用作制备其它化合物(例如类固醇等)的中间体。

例如在医药应用和/或健康应用中，虾青素和/或其酯可用于治疗炎性疾病，哮喘，特应性皮炎，变态反应，多发性骨髓瘤，动脉硬化，心血管疾病，肝病，脑血管疾病，血栓症，新血管生成相关疾病，包括癌症、风湿病、糖尿病视网膜病变；黄斑变性和脑部病症、高脂血症、肾缺血、糖尿病、高血压、肿瘤增生和转移；以及代谢病症。此外，类胡萝卜素和虾青素可用于预防和治疗疲劳，在由炎性疾病引起的肾病中改善肾功能，以及预防和治疗其它与生活习惯相关的疾病。另外，已发现虾青素作为多种生物学过程的抑制剂发挥作用，包括白细胞介素抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、磷酸酯酶A2抑制剂、环氧化酶-2抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、毛细管内皮细胞增生抑制剂、脂肪氧化酶抑制剂。参见，例如公布于2006年01月26日的日本公开No.2006022121(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301156)；公布于2006年01月19日的日本公开No.2006016408(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301155)；公布于2006年01月19日的日本公开No.2006016409(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301157)；公布于2006年01月19日的日本公开No.2006016407(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301153)；公布于2006年01月12日的日本公开No.2006008717(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301151)；公布于2006年01月12日的日本公开No.2006008716(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301150)；公布于2006年01月12日的日本公开No.2006008720(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301158)；公布于2006年01月12日的日本公开No.2006008719(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301154)；公布于2006年01月12日的日本公开No.2006008718(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301152)；公布于2006年01月12日的日本公开No.2006008713(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301147)；公布于2006年01月12日的日本公开No.2006008715(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301149)；公布于2006年01月12日的日本公开No.2006008714(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301148)；以及公布于2006年01月12日的日本公开No.2006008712(2005年10月17日提交的日本申请No.2005-301146)。

通过根据本发明的方法获得的结晶形式的类胡萝卜素可通过通常应用于类胡萝卜素的方法进行进一步配制。例如，它们可被用在液体制剂、类凝胶制剂或固体制剂中。它们可被配制为乳剂/分散体或任何其它通常已知的形式。

因此，本发明还涉及通过上文所述根据本发明的方法获得的类胡萝卜素在生产食品、饲料产品、药品和/或个人护理产品中的用途。

此外，本发明还涉及至少一种上文所述固体制剂在生产食品、饲料产品、药品和/或个人护理产品的预混物中的用途。

此外，本发明还涉及食品、饲料产品、药品和/或个人护理产品，其包含至少一种上文所述固体制剂。

此外，本发明还涉及(用于食品、饲料产品、药品和/或个人护理产品的)预混物，其包含至少一种上文所述固体制剂。

下文的实例用于阐释本发明。

所有份数和百分数均是重量相关的。

实施例

已经如说明书中所描述来制备如下实例。

实施例1：经乙酰化的虾青素

利用CH₂Cl₂提取生物质(Yarrowia>

实施例2：经乙酰化的虾青素

利用CH₂Cl₂提取生物质(Yarrowia>

实例3(对比例)：经乙酰化的虾青素

利用CH₂Cl₂提取生物质(Yarrowia>