包含棉酚和苯乙双胍作为活性成分的用于癌症治疗的药物组合物

摘要

本发明涉及包含棉酚和苯乙双胍作为活性成分的用于癌症治疗的药物组合物。具体而言，与单独使用棉酚和苯乙双胍的单一处理相比，棉酚和苯乙双胍的联合处理经证实具有显著更高的抗癌活性。因此，可将包含棉酚和苯乙双胍的具有协同抗癌活性的本发明药物组合物有利地用于癌症治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及用于癌症治疗的药物组合物，该药物组合物包含棉酚和苯乙双胍作为活性成分，并由此显示协同抗癌活性；使用该药物组合物治疗癌症的方法；以及用于癌症治疗的试剂盒。

背景技术

侵袭性癌细胞表型(aggressive cancer cell phenotype)是导致细胞内信号传导通路反常(deregulation)的多种遗传改变和表观遗传改变的结果(Ponder，Nature 411:336(2001))。然而，所有癌细胞的共同点是它们不能执行凋亡程序，由于正常凋亡机制缺陷而引起的适当凋亡的缺乏是癌症的标志(Lowe等，Carcinogenesis 21:485(2000))。涵盖化学疗法、放射疗法和免疫疗法的大部分现有癌症疗法均间接地诱导癌细胞凋亡。因此，由于正常凋亡机制缺陷而引起的癌细胞不能执行凋亡程序通常与对化学疗法、放射疗法或免疫疗法诱导的凋亡的抵抗增加有关。由于凋亡缺陷而引起的不同起源的人类癌症对目前治疗方案的原发性抵抗或获得性抵抗是目前癌症疗法的主要问题(Lowe等，Carcinogenesis 21:485(2000)；Nicholson，Nature 407:810(2000))。因此，为了改善癌症患者的存活率和生活质量，目前和将来对设计和开发新型分子靶标特异性的抗癌疗法所作的努力必须包括特异性靶向对凋亡具有抵抗性的癌细胞的策略。在这一方面，以在直接抑制癌细胞凋亡中发挥重要作用的关键负调节因子(negative regulator)为靶标代表了用于新型抗癌药物设计的极有希望的治疗策略。

尽管对多种癌症靶向物质的研究正在向对抗癌症的方面发展，在癌症晚期的情况中，大部分靶向疗法被用于延长寿命，而不是对抗癌症。这些研究中的一项显示多种癌症代谢调节因子有助于抗癌治疗。以对癌症而言特异性的通用代谢特点为靶标是这一研究的基础。例如，如同沃伯格效应(Warburg effect)一样，这意味着癌细胞倾向于乳酸发酵而不是将葡萄糖分解成二氧化碳和水。由于该原因，当将糖酵解中断以降低沃伯格效应时，癌细胞因饥饿而更难生长或死亡。

已知Bcl-2家族蛋白是凋亡中一类重要的负调节因子(Adams等，Science281:1322(1998)；Reed，Adv.Pharmacol.41:501(1997)；Reed等，J.Cell.Biochem.60:23(1996))。Bcl-2是该家族的基本成员，并且作为致癌基因的产物被首次分离。目前，Bcl-2家族涵盖抗凋亡分子(如Bcl-2和Bcl-XL)和促凋亡分子(如Bax、Bak、Bid和Bad)两者。Bcl-2和Bcl-XL在由诱导Bcl-2过表达的染色体易位(t14，18)所引起的包括非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)在内的多种类型的人类癌症(如乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌等)中过表达。这表明多种癌细胞类型依赖于Bcl-2和/或Bcl-XL增加的水平而保持其它细胞紊乱(cellular derangement)，使得癌细胞被定义为癌细胞或癌前细胞(pre-cancer cells)，并试图进行凋亡通路。另外，Bcl-2家族蛋白的表达增加被认为是对在肿瘤细胞中通过多种途径诱导细胞死亡的辐射和癌症治疗药物产生抵抗这一发现的基础。认为Bcl-2和Bcl-XL在肿瘤细胞的迁移、侵袭以及由此的转移中发挥作用(Amberger等，Cancer Res.58:149(1998)；Wick等，FEBS Lett，440:419(1998)；Mohanam等，Cancer Res.53:143(1993)；Pedersen等，Cancer Res.，53:5158(1993))。Bcl-2家族蛋白似乎提供了具有在新的非复制性环境(如转移区域)中存在的机制的肿瘤细胞，并有助于临床转移性癌症散播的有机特异性模式(Rubio，La Invest.81:725(2001)；Fernandez等，Cell Death Differ.7:350(2000))。进一步认为抗凋亡蛋白(如Bcl-2和/或Bcl-XL)通过例如调节细胞表面整合素来调节细胞-细胞相互作用(Reed，Nature 387:773(1997)；Frisch等，Curr.Opin.Cell Biol.9:701(1997)；Del Bufalo等，FASEB J.11:947(1997))。由于该原因，已对在细胞中以Bcl-2和Bcl-XL为靶标的治疗策略进行了广泛研究，以恢复癌细胞的敏感性并克服癌细胞对凋亡的抵抗(Adams等，Science 281:1322(1998)；Reed，Adv.Pharmacol.41:501(1997)；Reed等，J.Cell.Biochem.60:23(1996))。目前，存在进行中的Bcl-2反义疗法，该疗法是治疗实体肿瘤和非实体肿瘤的若干III期临床试验。

棉酚是天然源自于棉籽原油(Gossypium sp.，棉属)的双酚化合物。棉酚作为男性避孕药的临床试验显示出这一化合物在长期给药中的安全性(Wu，Drugs 38:333(1989))。此外，最近已知棉酚具有抗增殖作用(Flack等，J.Clin.Endocrinol.Metab.76:1019(1993)；Bushunow等，J.Neuro-Oncol.，43:79(1999)；Van Poznak等，Breast Cancer Res.Treat.66:239(2001))。最近显示(-)-棉酚及其衍生物是Bcl-2和Bcl-XL的有效抑制剂，并且具有强大的抗癌活性(美国专利申请No.2003/0008924)。

苯乙双胍，一种基于双胍的药物(如二甲双胍)，已知为抗糖尿病药剂。然而，由于已知基于双胍的药物(包括苯乙双胍)通过活化AMP-活化的蛋白激酶(AMPK，其为用于在生理上调节碳水化合物代谢和脂质代谢的关键酶)而对治疗p53基因缺陷型癌症有效，因此对苯乙双胍药物的抗癌作用进行研究以证明苯乙双胍抗癌作用的可能性(Effect of phenformin on the proliferation of human tumor cell lines.Life Sciences，2003Dec 19:vol.74(issue 5):643-650.；Potentiation of antitumor effect of cyclophosphamide and hydrazine sulfate by treatment with the antidiabetic agent,1-phenylethylbiguanide(phenformin)，Cancer Let.1979 Oct；7(6):357-61.)。尽管苯乙双胍和棉酚各自的抗癌作用是已知的，但这些药物的作用的协同抗癌作用尚是未知的。

因此，基于对显示更有效抗癌作用的物质进行开发的研究结果，本发明人证明，与其它物质不同，作为ALDH抑制剂的棉酚和基于双胍的苯乙双胍的组合显示显著的协同抗癌作用，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供包含棉酚和苯乙双胍作为活性成分的用于癌症治疗的药物组合物。

本发明的另一目的是提供棉酚和苯乙双胍或它们的可接受的盐用于制备抗癌药物的用途。

本发明的又一目的是提供治疗癌症的方法，该方法包括向受试者给予治疗有效量的棉酚和苯乙双胍或它们的可接受的盐。

本发明的再一目的是提供用于癌症治疗的药物试剂盒。

技术方案

为了达到上述目的，本发明提供了包含棉酚和苯乙双胍或它们的可接受的盐作为有效组分的用于癌症治疗的药物组合物。

本发明进一步提供了棉酚和苯乙双胍或它们的可接受的盐用于制备抗癌药物的用途。

本发明进一步提供了治疗癌症的方法，该方法包括向受试者给予治疗有效量的棉酚和苯乙双胍或它们的可接受的盐。

本发明进一步提供了用于癌症治疗的药物试剂盒，该药物试剂盒包含如下两种单独组分：

a)棉酚或其可接受的盐；以及

b)苯乙双胍或其可接受的盐。

有益效果

根据本发明，相较于单一处理，棉酚(对癌细胞系没有凋亡作用或对ALDH(乙醛脱氢酶)具有弱抑制作用)和苯乙双胍(降低线粒体氧化磷酸化)的联合处理显示显著的抗癌作用，因此，本发明的包含棉酚和苯乙双胍作为活性成分的药物组合物可在癌症治疗中有用。

附图说明

图1示出了棉酚处理对癌细胞中ATP生成的抑制：

原代小气道上皮细胞：正常肺上皮细胞(对照)。

图2示出了0μM、0.1μM或1μM的棉酚处理对癌细胞中ATP生成的抑制。

图3示出了9种类型的肺癌细胞系的SRB测试结果：

0：未经棉酚处理的对照；

-7：10^-7M(0.1μM)棉酚的处理；

-6：10^-6M(1μM)棉酚的处理；

-5：10^-5M(10μM)棉酚的处理；以及

-4：10^-4M(100μM)棉酚的处理。

图4示出了在A549肺癌细胞系中，棉酚随时间或浓度对AMPK的磷酸化：

p-AMPK(T172)：磷酸化的AMPK；

AMPK：AMPK的总量；以及

β-肌动蛋白：对照。

图5示出了在以10μM、50μM或100μM苯乙双胍分别进行处理的同时，以0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM或50μM棉酚分别进行处理的癌细胞系的生长：

实线：经苯乙双胍单一处理的A549/ATCC细胞系的癌细胞生长曲线；

虚线：经苯乙双胍和棉酚联合处理的A549/ATCC细胞系的癌细胞生长曲线；以及

对照：既未经棉酚处理也未经苯乙双胍处理的癌细胞。

图6示出了在以10μM、50μM或100μM苯乙双胍分别进行处理的同时，以0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM或50μM棉酚分别进行处理的癌细胞系的生长：

实线：经苯乙双胍单一处理的NCI-H460细胞系的癌细胞生长曲线；

虚线：经苯乙双胍和棉酚联合处理的NCI-H460细胞系的癌细胞生长曲线；以及

对照：既未经棉酚处理也未经苯乙双胍处理的癌细胞。

图7示出了在以100μM二甲双胍进行处理的同时，以0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM或50μM棉酚分别进行处理的癌细胞系的生长：

左图，实线：经二甲双胍单一处理的A549/ATCC细胞系的癌细胞生长曲线；

左图，虚线：经二甲双胍和棉酚联合处理的A549/ATCC细胞系的癌细胞生长曲线；

右图，实线：经二甲双胍单一处理的NCI-H460细胞系的癌细胞生长曲线；

右图，虚线：经二甲双胍和棉酚联合处理的NCI-H460细胞系的癌细胞生长曲线；以及

对照：既未经棉酚处理也未经二甲双胍处理的癌细胞。

图8示出了在以1μM、10μM或50μM顺铂分别进行处理的同时，以0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM或50μM棉酚分别进行处理的癌细胞系的生长：

实线：经顺铂单一处理的A549/ATCC细胞系的癌细胞生长曲线；

虚线：经顺铂和棉酚联合处理的A549/ATCC细胞系的癌细胞生长曲线；以及

对照：既未经棉酚处理也未经顺铂处理的癌细胞。

图9示出了在以1μM、10μM或50μM顺铂分别进行处理的同时，以0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM或50μM棉酚分别进行处理的癌细胞系的生长：

实线：经顺铂单一处理的NCI-H460细胞系的癌细胞生长曲线；

虚线：经顺铂和棉酚联合处理的NCI-H460细胞系的癌细胞生长曲线；以及

对照：既未经棉酚处理也未经顺铂处理的癌细胞。

图10示出了在向其给予棉酚和/或苯乙双胍的荷瘤小鼠中评价的肿瘤大小和肿瘤减少作用。

图11示出了经100mg/kg苯乙双胍和10mg/kg棉酚联合处理的小鼠组以及对照的肿瘤大小。

具体实施方式

在下文中，对本发明进行详细描述。

本发明提供了包含棉酚和苯乙双胍作为活性成分的用于癌症治疗的药物组合物。

棉酚可以是式1的化合物或其衍生物，但本发明不限于此：

[式1]

苯乙双胍可以是式2的化合物或其衍生物，但本发明不限于此：

[式2]

所述药物组合物可包含棉酚和苯乙双胍或它们的可接受的盐，但本发明不限于此。

棉酚的浓度可以是但不限于0.1nM至100μM。

苯乙双胍的浓度可以是但不限于1μM至200μM。

所述癌症可以是选自于由以下癌症所组成的组中的任一者：子宫癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、直肠癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、血液癌(hematological cancer)和肝癌，优选肺癌，最优选小细胞肺癌。然而，由于本发明的药物组合物以癌细胞的特异性代谢为靶标，可将其应用于任何类型的癌症，因此，本发明不限于以上所列实例。

所述用于癌症治疗的药物组合物可同时释放苯乙双胍和棉酚，或可优先释放苯乙双胍或棉酚的任一者。

在整个说明书中，除非另有特别定义，术语“药物组合物”应解释为不仅涵盖诸如一次摄取或一次给予的口服药物或注射剂的单剂类型，还涵盖在给予时被分成两次以上给予的多种单位剂型。例如，术语“包含棉酚和苯乙双胍的药物组合物”应解释为不仅涵盖包含两种活性成分的单一单位剂型，还涵盖分别包含各活性成分的两种单位剂型。此外，术语“包含棉酚和苯乙双胍的药物组合物”可涵盖单一单位剂型或两种单位剂型，即使当将包含两种活性成分的单一单位剂型制备成延时释放并同时给予时，或者当将两种单位剂型同时给予或以预定的时间间隔或更短的时间间隔给予时，在活体中共同包含在各自单位剂型中的两种活性成分之间产生协同行为，并因此被包括在“包含棉酚和苯乙双胍作为活性成分的用于癌症治疗的药物组合物”的范围内。可以同时或延时释放或处理(或给予)两种活性成分。因此，包含棉酚和苯乙双胍或它们的药学上可接受的盐作为活性成分的用于癌症治疗的药物组合物可以是实现同时联合处理(或释放)的简单组合的药物组合物，或者是实现延时联合处理(或释放)的药物组合物。

在整个说明书中，术语“延时(time-lag)释放或延时给予”是指使分别摄取或给予的活性成分非同时地而是顺序地被吸收的药物释放或给予。此类“延时释放或延时给予”可通过两种成分包含在同一剂型中的组合制剂来实现，或者即使当将各活性成分制备成各自的单一制剂时，可通过经设计以使至少一种成分能够延迟释放的制剂或剂量单位来实现，从而通过同时摄取或给予的成分显示延时作用。此外，“延时给予”还可包括以固定时间间隔给予两种活性成分的方法。

在整个说明书中，术语“可接受的盐”意在指保留了特定化合物的生物学效应的盐，药学上可接受的盐是本领域普通技术人员公知的。

在所述药物组合物中，棉酚和苯乙双胍可以按其原样使用，但考虑到溶解度和稳定性，可对它们的衍生物进行制备。

本发明的药物组合物可进一步包含抗癌剂，但本发明不限于此。

所述抗癌剂可以是但不限于选自于以下药物中的至少一种药物：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼、司马沙尼(semaxanib)、博舒替尼、阿西替尼、西地尼布、来他替尼、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生(Viscum album)、门冬酰胺酶、维甲酸(tretinoin)、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀(estramustine)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、庚铂(heptaplatin)、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗(alemtuzumab)、甲基苄肼、前列地尔、硝酸钬·壳聚糖、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟(tegafur)、卡培他滨、吉莫斯特(gimeracil)、奥替拉西(oteracil)、阿扎胞苷、氨甲喋呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、依诺他滨、氟他胺、地西他滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫氟、雷替曲塞、多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、伊立替康、贝洛替康、拓扑替康(topotecan)、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、替尼泊苷、阿霉素、去甲氧柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、放线菌素、吡喃阿霉素、阿克拉霉素、培洛霉素(peplomycin)、替西罗莫司(temsirolimus)、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺、达卡巴嗪、塞替派、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、瘤可维(leucovorin)、维甲酸、依西美坦、氨鲁米特、阿那格雷、诺维本(navelbine)、法倔唑(fadrozole)、他莫昔芬、托瑞米芬、睾内酯(testolactone)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑、伏氯唑、比卡鲁胺、洛莫司汀和卡莫司汀。

同时，除上述活性成分以外，本发明的药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”是指如下的药物添加剂：所述药物添加剂在将用于给药的药物组合物配制为合适的剂型中有用，且在使用条件下无毒且不敏感，可根据标准药学实践以及活性成分的溶解度、化学性质或选定的给药途径来确定此类载体的特定含量比例。此外，本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的添加剂，所述药学上可接受的添加剂的实例可包括淀粉、胶凝淀粉(gelatinized starch)、微晶纤维素、乳糖、聚维酮(povidone)、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、太妃糖(taffy)、阿拉伯树胶、预胶凝淀粉、玉米淀粉、粉末纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、羟乙酸淀粉钠、巴西棕榈蜡、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、蔗糖、右旋糖、山梨醇和滑石。相对于所述组合物，本发明所述的药学上可接受的添加剂可包含0.1重量份-90重量份，但本发明不限于此。

本发明的药物组合物可在实际临床给药中以多种口服形式和胃肠外形式给予，而且在制备中可利用通常使用的稀释剂或赋形剂来配制，例如填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、表面活性剂等。固体口服制剂的实例可包括片剂、丸剂、散剂(powder)、颗粒剂和胶囊剂，此类固体制剂可通过使至少一种赋形剂(如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶)与葛根(Pueraria)提取物混合来配制。此外，可以使用诸如硬脂酸镁、滑石的润滑剂，而不是简单的赋形剂。液体口服制剂可以是混悬剂、内用液体剂、乳剂和糖浆剂，除经常使用的简单稀释剂(如水或液体石蜡)之外，还包含多种赋形剂(例如润湿剂、甜味剂、调味剂和防腐剂)。胃肠外制剂的实例可包括灭菌水溶液剂、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂和栓剂。作为非水溶剂或混悬剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)或可注射的酯(如油酸乙酯)。作为栓剂的基础，可使用Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂酸甘油酯脂肪或甘油明胶。

本发明的药物组合物可根据期望的方法口服给予或胃肠外给予，对于胃肠外给予而言，可使用皮肤局部使用、腹膜内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内注射、肌内注射或心内注射。本发明的药物组合物的剂量可取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和疾病严重程度而变化。

本发明的药物组合物的剂量可取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和疾病严重程度而变化，并可基于葛根提取物的量以0.0001mg/kg-100mg/kg、优选0.001mg/kg-10mg/kg每天给予1～6次。

对于治疗癌症患者而言，本发明的药物组合物可单独使用或与手术、激素治疗、药物治疗和生物反应调节剂联合使用。

适用于本发明的受试者可以是哺乳动物、优选人或非人哺乳动物、最优选人。

此外，本发明提供了棉酚和苯乙双胍或它们的可接受的盐用于制备抗癌药物的用途。

所述癌症可以是选自于由以下癌症所组成的组中的任一者：子宫癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、直肠癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、血液癌和肝癌，优选肺癌，最优选小细胞肺癌。然而，由于本发明的药物组合物以癌细胞的特异性代谢为靶标，可将其应用于任何类型的癌症，因此，本发明不限于以上所列实例。

此外，本发明提供了治疗癌症的方法，该方法包括向受试者给予治疗有效量的棉酚和苯乙双胍或它们的可接受的盐。

本文所使用的术语“治疗有效量”是指足以抑制癌细胞的量。

所述受试者可以是患有待治疗癌症的患者、优选人，但本发明不限于此。

所述癌症可以是选自于由以下癌症所组成的组中的任一者：子宫癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、直肠癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、血液癌和肝癌，优选肺癌，最优选小细胞肺癌。然而，由于本发明的药物组合物以癌细胞的特异性代谢为靶标，可将其应用于任何类型的癌症，因此，本发明不限于以上所列实例。

在整个说明书中，本文所使用的术语“癌症治疗”是指减缓或中断癌症发展。癌症治疗包括癌症症状的治疗和/或缓解。

在整个说明书中，本文所使用的术语“治疗有效量”是指足以向受试者提供治疗作用的量。因此，当向患有癌症的受试者给予时，治疗有效量的棉酚和苯乙双胍或它们的可接受的盐可以是足以治疗癌症的量。

在整个说明书中，本文所使用的术语“受试者”或“患者”可以是哺乳动物、优选人或非人哺乳动物、最优选人。

此外，本发明提供了用于癌症治疗的药物试剂盒，所述药物试剂盒包含由以下组分所组成的两种单独成分：

a)棉酚或其可接受的盐；以及

b)苯乙双胍或其可接受的盐。

所述癌症可以是选自于由以下癌症所组成的组中的任一者：子宫癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、直肠癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、血液癌和肝癌，优选肺癌，最优选小细胞肺癌。然而，由于本发明的药物组合物以癌细胞的特异性代谢为靶标，可将其应用于任何类型的癌症，因此，本发明不限于以上所列实例。

可将试剂盒部分的组分a)和组分b)包装在一个或多个容器中，将包含在试剂盒中的各个组分包装在各个容器中。可随试剂盒提供合适的包装和说明书。

所述试剂盒可在第一单位剂型中包含棉酚或其可接受的盐，并在第二单位剂型中包含苯乙双胍或其可接受的盐。

实施例

在下文中，为了帮助理解本发明，将参照实施例和比较例对本发明进行详细描述。然而，提供以下实施例和比较例仅是为了对本发明的说明进行示例，因此本发明的范围并不受其限制。提供本发明的实施例和比较例以向本领域普通技术人员更充分地解释本发明。

<实施例1>棉酚抗癌活性的检验

<1-1>在癌细胞中抑制能量产生的检验

为了检验棉酚(其为ALDH)是否抑制癌细胞中能量的产生，用1μM棉酚对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(如A549细胞系、H460细胞系、Hop-92细胞系和H23细胞系)进行处理1小时，随后使用ATP分析试剂盒(Biovision；#K354-100)来测量ATP水平。使用正常肺上皮细胞作为对照。

此外，为了调查ATP水平根据棉酚浓度的变化，用0μM、0.1μM或1μM棉酚对A549细胞系进行处理1小时，随后测量ATP水平。

作为结果，可看出棉酚抑制了癌细胞系中增加的ATP生成水平(每1×10⁶个细胞1nmol-6nmol)(图1)，并且ATP生成的抑制取决于棉酚的浓度(图2)。

<1-2>癌细胞生长抑制的检验

进行SRB分析来检验棉酚对癌细胞系生长的抑制作用。具体而言，根据肺癌细胞系(如A549/ATCC、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H460或NCI-H522细胞系)的倍增时间，每孔接种5000至40000个细胞，并使其在96孔微量滴定板中生长。24小时后，将细胞用每孔100ml的0μM、0.1μM、1μM、10μM或100μM棉酚处理，并在37℃孵育48小时。随后，将50ml的50％冷(4℃)三氯乙酸(TCA)加至各贴壁细胞系，将50ml的80％TCA加至各悬浮细胞系，以将细胞固定。在4℃将板孵育1至3小时后，将板中的TCA溶液弃去，然后将板用蒸馏水漂洗五次。将板在室温下干燥约12至24小时，然后用100ml磺酰罗丹明B(SRB)将固定的细胞在室温下染色5分钟。染色后，将板用1％冰醋酸洗涤三次，并在室温下干燥约12至24小时。用10mM Trizma碱将SRB染料溶解，并在515nm对光密度进行测量。将棉酚对癌细胞的抑制作用表示为50％生长抑制(GI50)。

作为结果，可看出棉酚抑制肺癌细胞系生长的GI50浓度是5μM(图3)。

<1-3>根据棉酚处理时间或浓度的棉酚对癌细胞增殖的抑制作用

为了检验根据棉酚处理时间或浓度的抗癌作用，用1μM棉酚对A549肺癌细胞系进行处理0小时、8小时、16小时或24小时，然后通过western印迹对AMP活化的蛋白激酶(AMPK，其为癌细胞分裂的关键蛋白质)的磷酸化进行分析。

此外，在用0μM、0.1μM、0.5μM或1μM棉酚分别处理24小时后，也通过western印迹对AMPK磷酸化进行分析。

作为结果，可看出取决于棉酚的处理时间和浓度，AMPK磷酸化增加(图4)。因此，可看出棉酚抑制了对于癌细胞分裂而言必不可少的生物合成，这是显示棉酚抑制癌细胞增殖的关键证据。

<实施例2>根据棉酚和苯乙双胍的共同处理的抗癌作用的检验

将癌细胞系A549/ATCC和NCI-H460分别用0.1μM、0.5μM、1.0μM、5μM、10μM或50μM棉酚进行单一处理，并用10μM、50μM或100μM苯乙双胍进行联合处理，随后以与实施例<1-2>相同的方式进行SRB分析。

作为结果，可看出在棉酚的单一处理中，难以抑制癌细胞生长，但在苯乙双胍和棉酚的联合处理中，以大大低于5μM(该浓度是在棉酚单一处理中抑制癌细胞生长的浓度(GI50))的浓度抑制了癌细胞生长(图5和图6)。因此，苯乙双胍和棉酚的联合处理对抑制癌细胞生长的协同作用得到了证实。

<实施例3>在动物模型中棉酚和苯乙双胍的联合处理的抗癌作用的检验

将A549-萤光素酶细胞用0.12％胰蛋白酶和0.008％EDTA(T/E)处理，从板上脱离，用冷PBS洗涤，然后以2×10⁶个细胞/头/100μl>3时，将小鼠分组(每组五只小鼠)，然后每周五次口服给予100mg/kg/100μl>

作为结果，可看出相较于用棉酚和苯乙双胍各自处理的小鼠，用棉酚和苯乙双胍共同处理的小鼠显示出肿瘤大小显著减小(图10和图11)。

<对比例1>棉酚和基于双胍的不同化合物的联合处理的抗癌作用的检验

为了检验协同抗癌作用是否仅由棉酚和苯乙双胍的联合处理引起，将癌细胞系A549/ATCC和NCI-H460分别用0.1μM、0.5μM、1.0μM、5μM、10μM或50μM棉酚进行单一处理，并用100μM二甲双胍(在线粒体氧化磷酸化抑制剂中，二甲双胍处于包括苯乙双胍在内的基于双胍的组中并已知具有抗癌作用)进行联合处理，然后通过与上述方法相同的方法对各个试样中抑制癌细胞生长的作用进行检验。

作为结果，可看出100μM二甲双胍和棉酚的联合处理与棉酚的单一处理没有显著差异，而且与棉酚和苯乙双胍的联合处理不同，不具有协同作用(图7)。因此，认为与棉酚联合具有协同抗癌作用的物质是基于苯乙双胍的物质。

<比较例2>棉酚和常规抗癌剂的联合处理的抗癌作用的检验

在用顺铂(在诊所中用作商业抗癌药物)进行单独处理或与棉酚进行联合处理之后，对协同抗癌作用进行检验。

作为结果，虽然用1μM、10μM或50μM顺铂与棉酚进行了联合处理，但抗癌活性与棉酚的单一处理没有显著差异，因此可看出未显示协同作用(图8和图9)。