一种用于检测终极腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测终极腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法，该引物组合物包含：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和正向环引物LF。以待检微生物的基因组DNA为模板，以所述的LAMP引物组合物为引物进行LAMP反应；然后观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为天蓝色，表示待检物中存在终极腐霉菌，如果颜色没有变化仍是紫色，表示待检物中不存在终极腐霉菌。与传统的依据形态特征来鉴定终极腐霉菌的检测技术相比，本发明具备更高的准确性、灵敏度和实效性，而且操作方便、实用性好，为终极腐霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于终极腐霉菌的高灵敏度快速检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测终极腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

终极腐霉菌(Pythium ultimum)是在蔬菜的腐霉病害中比较常见的一种致病性腐霉，它属于卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Perenosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、腐霉属(Pythium)。终极腐霉菌具有广泛的寄主范围，能侵染多种菊科、豆科、葫芦科、茄科植物及少数蔷薇科植物，已成为许多农作物苗期病害的重要致病菌之一。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫、防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低终极腐霉菌引起的损失。

目前，针对终极腐霉菌的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法和诱饵法，依据终极腐霉菌的形态学进行鉴定。由于腐霉生长受温度影响形态不稳定，给检测带来了巨大困难。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到终极腐霉菌的检测中，包括Real-time PCR技术。虽然Real-time PCR技术在特异性和灵敏度上有了较大的提高，但是检测时间仍然比较长，同时依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物白色焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道很少，终极腐霉的检测国内外均未见报道。

本发明通过序列比对分析终极腐霉菌和其它腐霉菌在基因组序列上的差异，设计了终极腐霉菌特异性的LAMP引物组合物，在此基础上建立了终极腐霉菌的LAMP快速检测方法。

发明内容

针对现有技术中终极腐霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种用于检测终极腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种用于检测终极腐霉菌的LAMP引物组合物，该LAMP引物组合物包含：如SEQIDNO.1所示的正向内引物FIP，如SEQ ID NO.2所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO.3所示的正向外引物F3，如SEQ ID NO.4所示的反向外引物B3，如SEQ ID NO.5所示的正向环引物LF。

上述的LAMP检测引物组合物在检测终极腐霉菌中的应用。

一种检测终极腐霉菌的LAMP试剂盒，该试剂盒中包含上述的LAMP引物组合物。

上述的检测终极腐霉菌的LAMP试剂盒，其在于该试剂盒中还包含有金属离子指示剂和PCR技术常用的试剂。所述的金属离子指示剂优选为HNB。

作为一种优选技术方案，所述的试剂盒中各试剂浓度为：1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.8μM正向环引物LF、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTPs、20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、8mM>4、0.1％TritonX-100、Bst>

上述的检测终极腐霉菌的LAMP试剂盒在检测终极腐霉菌中的应用。

一种终极腐霉菌的LAMP检测方法，以待检微生物的基因组DNA为模板，以上述的LAMP引物组合物为引物进行LAMP反应；然后观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为天蓝色，表示待检物中存在终极腐霉菌，如果颜色没有变化仍是紫色，表示待检物中不存在终极腐霉菌。

所述LAMP反应的反应体系为：1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.8μM正向环引物LF、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTPs、20mMTris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、8mM>4、0.1％Triton>

LAMP反应程序为：64℃反应扩增60min。

本发明的检测终极腐霉菌的方法，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP反应；Hydroxylnaphthol blue(HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg²⁺的滴定剂，其颜色随溶液PH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg²⁺浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg²⁺与LAMP反应的副产物P₂O₇^4-结合产生大量沉淀，溶液中Mg²⁺浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断终极腐霉菌的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在终极腐霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在终极腐霉菌。

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

(1)操作方便：本发明提供的检测终极腐霉菌的LAMP方法克服了现有技术中终极腐霉菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测终极腐霉菌的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，只需60min就能准确、快速、高效地检测到终极腐霉菌，对实验场所的要求简单，不需要其它复杂仪器，能较好满足对终极腐霉菌的现场检测，适合在基层和进出口检验检疫部门推广使用。

(2)准确性高：由于传统终极腐霉菌检测方法只是依据形态特征来进行鉴定，而终极腐霉菌的生长受温度影响形态不稳定，同时受到相近种的影响，很难准确鉴定出来。而本发明根据终极腐霉菌的基因组序列，利用Blast软件将终极腐霉菌的基因组序列与其它腐霉的基因组序列进行比较，选取了终极腐霉菌特有的一端序列并设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物(FIP、BIP、F3、B3)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性比较高。此外，反向环引物LB能够提高反应速率，和其它四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行终极腐霉菌检测。

(3)灵敏度高：本发明建立的终极腐霉菌的LAMP检测方法，灵敏度非常高，可以达到100pg DNA，表明该检测方法足以在DNA浓度较低情况下准确快速地检测出终极腐霉菌。

附图说明

图1为终极腐霉菌LAMP引物的特异性验证：

使用终极腐霉菌的LAMP特异性引物对不同病原菌进行LAMP检测，在64℃水浴恒温扩增60min后观察反应溶液的颜色变化，结果显示：只有以终极腐霉菌为模板的反应管中溶液的颜色由紫色变成天蓝色(图1A，1)，而瓜果腐霉(图1A，2)、辣椒疫霉(图1A，3)和阴性对照(图1A，4)的反应管中溶液颜色都没有发生变化，仍为紫色。进一步通过琼脂糖凝胶电泳观察发现，以终极腐霉菌为模板可以扩增出一系列梯度条带(图1B，1)，而瓜果腐霉(图1B，2)、辣椒疫霉(图1B，3)和阴性对照(图1B，4)都没有扩增出条带。

图2为终极腐霉菌LAMP检测方法的灵敏度验证：

基于反应溶液的颜色变化检测LAMP方法的灵敏度，设置终极腐霉菌的模板浓度范围为100ng-10fg。结果显示：当终极腐霉菌的模板浓度分别为100ng、10ng、1ng、100pg时，其对应的反应管中溶液颜色变成天蓝色(图2A)，呈阳性反应；而当终极腐霉菌的模板浓度分别为10pg、1pg、100fg、10fg时，其对应的反应管中溶液颜色仍为紫色(图2A)，呈阴性反应，并进一步通过琼脂糖凝胶电泳检测验证了上述结果(图2B)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用具体实例做进一步的说明，但并非仅限用于这些例子。

实施例1：利用LAMP方法检测终极腐霉菌

用于检测终极腐霉菌的LAMP引物组合物：正向内引物FIP如SEQ ID NO.1所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.2所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.3所示，反向外引物B3如SEQID NO.4所示，正向环引物LF如SEQ ID NO.5所示。

检测终极腐霉菌的LAMP试剂盒中各试剂浓度为：1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.8μM正向环引物LF、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTPs、20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、8mM>4、0.1％Triton X-100、Bst>

LAMP检测方法：提取待检微生物的DNA，取2μL DNA溶液作为反应模板，加入23μLLAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为：64℃反应扩增60min，然后观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为天蓝色，表示待检物中存在终极腐霉菌，如果颜色没有变化仍是紫色，表示待检物中不存在终极腐霉菌。

为了验证LAMP方法的特异性，以终极腐霉菌、瓜果腐霉菌、辣椒疫霉菌为供试材料，LAMP检测结果显示终极腐霉菌可观察到天蓝色的阳性反应或者琼脂糖凝胶电泳出现LAMP阶梯状的条带，而瓜果腐霉菌、辣椒疫霉菌显色结果为紫色的阴性反应或者琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带(图1)。

实施例2：终极腐霉菌LAMP反应的灵敏度试验

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的终极腐霉菌的DNA用分光光度计测定浓度后进行10倍比稀释，设置DNA浓度范围为100ng-10fg，分别取稀释后的各浓度DNA稀释液2μL作为模板，加入23μL试剂盒溶液进行LAMP反应，反应程序为：64℃反应扩增60min。HNB显色反应表明：当终极腐霉菌的DNA浓度达到100pg时，反应管中的溶液就能变成天蓝色，进一步通过琼脂糖凝胶电泳得到了与HNB显色反应一致的结果(图2)。