一种含烯丙基取代的单羰基姜黄素类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了一种含烯丙基取代的单羰基姜黄素类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的单羰基姜黄素类化合物为结构如式(Ⅰ)所示的化合物或其药用盐；式(I)中，A为C、S、O或‑NR1，其中R1独立地选自H、C1～C5烷基、苯砜基、苄基中的一种或者多种；n为0或1；R独立地选自一个或者多个H、羟基、烯丙基、C1～C4烷氧基、吡咯烷基、吗啉基或N‑甲基哌嗪基。试验结果表明，这类单羰基姜黄素类化合物具有较好的稳定性和抗肿瘤活性，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物。

说明书

技术领域

本发明属药物化学领域，具体涉及一类含烯丙基取代的单羰基姜黄素类抗肿瘤药物及其在制备抗肿瘤药物及与肿瘤相关疾病的治疗药物中的应用。

背景技术

癌症是严重威胁人类生命和健康的重大疾病。2013年，据报道全球约有790万人死于癌症，其中肺癌死亡约130万，胃癌死亡约80.3万，结直肠癌死亡约63.9万，肝癌死亡约61万，乳腺癌死亡约51.9万。因此，寻找新的抗肿瘤药物一直是科学工作者关注的问题。

姜黄素是中药姜黄发挥药理作用的主要活性成分，在印度、巴西、菲律宾、日本、韩国等地都有上千年的食用和药用记载。近年来，药物化学和药理学研究发现姜黄素具有抗肿瘤、抗血管生成、抗突变、抗菌、抗病毒、抗氧化和神经保护等多种药理作用，其在抗肿瘤方面具有：抗肿瘤谱广、多靶点、逆转肿瘤多药耐药等优点，引起了人们的广泛关注。姜黄素在美国已经进入I期临床实验阶段。正是因为多生物活性，以及低分子量、无毒等特点，姜黄素曾被认为是理想的化学治疗药物之一。然而，进一步的研究发现姜黄素在体内的活性偏低、体内吸收少、代谢过快和生物利用度低，极大地限制了它的应用。但是，考虑到它确切的生物活性、相对简单的分子结构，姜黄素仍不失为一种优秀的结构修饰和抗肿瘤药物筛选的先导化合物。

目前，以保留其药物安全性、增加抗肿瘤活性和水溶性为目的的姜黄素类似物设计、合成、评估和筛选研究吸引了很多药物研发机构和药物公司。通过大量的文献和专利查阅，我们发现，虽然目前普遍认为姜黄素结构中的活性基团是其酚羟基和β-二酮基团，但在不含有这两个活性基团的姜黄素类似物研究方面，也发现有时候也表现出更强的活性，这对于β-二酮基团是姜黄素的活性必需基团提出了质疑。而且，由于β-二酮结构的存在，姜黄素的稳定性较弱，只有在pH＜6.5时才具有较好的稳定性。

发明内容

本发明提供了一种含烯丙基取代的单羰基姜黄素类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，该类单羰基姜黄素类化合物避免了β-二酮结构带来的不稳定性，同时具有较高的抗肿瘤活性。

一种含烯丙基取代的单羰基姜黄素类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的单羰基姜黄素类化合物为结构如式(Ⅰ)所示的化合物或其药用盐；

式(I)中，A为CH₂、S或-NR¹，其中R¹独立地选自H、C₁～C₅烷基、苯砜基、苄基中的一种或者多种；

n为0或1；

R独立地选自一个或者多个H、羟基、烯丙基、C₁～C₄烷氧基、吡咯烷基、吗啉基或N-甲基哌嗪基。

式(I)中，所述的C₁～C₅烷基包括C₁～C₅链烷基和C₁～C₅环烷基，例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基或者环丙基。

式(I)中，当n为0时，中间环为五元环，例如此时A为CH₂时，中间环为环戊酮基；当n为1时，中间环为六元环。

式(I)中，R表示的取代基的个数可以为多个，分别取代苯环的不同位置，例如同时在3位含有一个烯丙基，并在2位含有一个羟基。

作为优选，所述的单羰基姜黄素类化合物为以下化合物或其药用盐中的一种或者几种：

(3E,5E)-3,5-双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)哌啶-4-酮(L1)；

(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(L2)；

(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮(L3)；

(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮(L4)；

(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-异丙基哌啶-4-酮(L5)；

(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基哌啶-4-酮(L6)；

(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-(苯磺酰基)哌啶-4-酮(L7)；

(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-苄基哌啶-4-酮(L8)；

(2E,5E)-2,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)环戊酮(L9)；

(2E,6E)-2,6双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(L10)；

(3Z,5Z)-3,5-双(3-烯丙基-4-羟基苯甲氧基)二氢-2H-噻喃-4(3H)-酮(L11)；

(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(2,4,5-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(L12)；

(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(3,4-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(L13)；

(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(2,4,6-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(L14)；

(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(2,4-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(L15)；

(3E,5E)-3-(3-烯丙基l-4-羟基苯亚甲基)-5-(4-(叔丁氧基)苯亚甲基)-1-环丙基哌啶-4-酮(L16)；

(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯亚甲基)哌啶-4-酮(L17)；

(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(4-吗啉苯亚甲基)哌啶-4-酮(L18)；

(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(4-(吡咯烷-1-基)苯亚甲基)哌啶-4-酮(L19)。

其中，(3E,5E)-3,5-双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)哌啶-4-酮(3E,5E)-3,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)piperidin-4-one的结构式如下所示，记为L1：

其中，(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(3E,5E)-3,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-methylpiperidin-4-one的结构式如下所示，记为L2：

其中，(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮(3E,5E)-3,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-ethylpiperidin-4-one的结构式如下所示，记为L3：

其中，(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮(3E,5E)-3,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-propylpiperidin-4-one的结构式如下所示，记为L4：

其中，(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-异丙基哌啶-4-酮(3E,5E)-3,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-isopropylpiperidin-4-one的结构式如下所示，记为L5：

其中，(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基哌啶-4-酮(3E,5E)-3,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-cyclopropylpiperidin-4-one的结构式如下所示，记为L6：

其中，(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-(苯磺酰基)哌啶-4-酮(3E,E)-3,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-(phenylsulfonyl)piperidin-4-one的结构式如下所示，记为L7：

其中，(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-苄基哌啶-4-酮(3E,5E)-3,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-benzylpiperidin-4-one的结构式如下所示，记为L8：

其中，(2E,5E)-2,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)环戊酮(2E,5E)-2,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)cyclopentanone的结构式如下所示，记为L9：

其中，(2E,6E)-2,6双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(2E,6E)-2,6-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)cyclohexanone的结构式如下所示，记为L10：

其中，(3Z,5Z)-3,5-双(3-烯丙基-4-羟基苯甲氧基)二氢-2H-噻喃-4(3H)-酮(3Z,5Z)-3,5-Bis(3-allyl-4-hydroxybenzylidene)dihydro-2H-thiopyran-4(3H)-one的结构式如下所示，记为L11：

其中，(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(2,4,5-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(3E,5E)-3-(3-Allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-cyclopropyl-5-(2,4,5-trimethoxybenz ylidene)piperidin-4-one的结构式如下所示，记为L12：

其中，(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(3,4-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(3E,5E)-3-(3-Allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-cyclopropyl-5-(3,4-dimethoxybenzyli dene)piperidin-4-one的结构式如下所示，记为L13：

其中，(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(2,4,6-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(3E,5E)-3-(3-Allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-cyclopropyl-5-(2,4,6-trimethoxybenz ylidene)piperidin-4-one的结构式如下所示，记为L14：

其中，(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(2,4-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(3E,5E)-3-(3-Allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-cyclopropyl-5-(2,4-dimethoxybenzyli dene)piperidin-4-one的结构式如下所示，记为L15：

其中，(3E,5E)-3-(3-烯丙基l-4-羟基苯亚甲基)-5-(4-(叔丁氧基)苯亚甲基)-1-环丙基哌啶-4-酮(3E,5E)-3-(3-Allyl-4-hydroxybenzylidene)-5-(4-(tert-butoxy)benzylidene)-1-cyclo propylpiperidin-4-one的结构式如下所示，记为L16：

其中，(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯亚甲基)哌啶-4-酮(3E,5E)-3-(3-Allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-cyclopropyl-5-(4-(4-methylpiperazin-1-yl)benzylidene)piperidin-4-one的结构式如下所示，记为L17：

其中，(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(4-吗啉苯亚甲基)哌啶-4-酮(3E,5E)-3-(3-Allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-cyclopropyl-5-(4-morpholinobenzyli dene)piperidin-4-one的结构式如下所示，记为L18：

其中，(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(4-(吡咯烷-1-基)苯亚甲基)哌啶-4-酮(3E,5E)-3-(3-Allyl-4-hydroxybenzylidene)-1-cyclopropyl-5-(4-(pyrrolidin-1-yl)be nzylidene)piperidin-4-one的结构式如下所示，记为L19：

作为优选，所述的抗肿瘤药物用于治疗肿瘤或与肿瘤相关的疾病。这19种化合物抗肿瘤谱较广，可以治疗的癌症的例子包括，但是不局限于，皮肤癌、肺癌、睾丸癌、淋巴癌、白血病、食道癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、中枢神经系统癌、肝癌和前列腺癌。

作为优选，所述的抗肿瘤药物包括治疗有效量的活性成分和药用辅料，其中，活性成分为所述单羰基姜黄素类化合物。

所述的药用辅料指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

作为优选，所述的抗肿瘤药物的活性成分由所述的单羰基姜黄素类化合物和其他抗肿瘤药物组成，所述的其他抗肿瘤药物包括各种生物烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素及分子靶向药物等。

本发明抗肿瘤药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：所述的单羰基姜黄素类化合物具有更好的稳定性，同时具有较好的抗肿瘤性能，可以用于制备治疗肿瘤和与肿瘤相关疾病的药物。

附图说明

图1为本发明代表性化合物L9、L10、L11和姜黄素(Curcumin)的稳定性检测图。

图2(A)所示为本发明19个化合物(L1-L19)对人胆管癌RBE细胞的存活率曲线图；(B)为本发明活性化合物L6、L9、L11对人胆管癌RBE细胞的IC₅₀值；(C)为本发明活性化合物L11对人胆管癌RBE细胞、HUCCA细胞和QBC-939细胞的IC₅₀值；(D)为本发明活性化合物L11对人正常肝HL-7702细胞人肝内胆管上皮HIBEC细胞的IC₅₀值。

图3(A)和(B)分别为本发明化合物L11诱导人胆管癌RBE细胞、HUCCA细胞和QBC-939细胞G2/M周期阻滞图；(C)为Western Blotting方法检测本发明化合物L11对人胆管癌RBE细胞、HUCCA细胞和QBC-939细胞的周期相关p53蛋白和Cdc2蛋白表达情况。

图4(A)和(B)为本发明化合物L11诱导人胆管癌RBE细胞、HUCCA细胞和QBC-939细胞凋亡检测图；(C)为Western Blotting方法检测本发明化合物L11对人胆管癌RBE细胞、HUCCA细胞和QBC-939细胞的凋亡相关BAX蛋白、Bcl-2蛋白和cle-PARP蛋白表达情况。

具体实施方式

下文将结合具体实施例详细描述本发明的内容。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

实施例1

化合物L1～L19的结构如表1所示。

表1

制备上述的含烯丙基取代的单羰基姜黄素类似物的方法，包括如下步骤：

类型I中的化合物(L1-L11)的合成步骤(步骤a-步骤c)：

步骤a：合成4-(烯丙氧基)苯甲醛(2)：将烯丙基溴(14.0ml,163.7mmol)和无水碳酸钾(5.6g,40.9mmol)加入到4-羟基苯甲醛(1)(10.0g,81.9mmol)的丙酮(40ml)溶液中，反应液在65℃下搅拌回流过夜。反应结束后减压蒸馏除去溶剂丙酮。残留物溶解在乙酸乙酯(30mL)和蒸馏水(30mL)中萃取三次,有机层用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除掉乙酸乙酯。残留物用硅胶柱层析方法得到中间体苯甲醛2(9.96g,产率75％，无色液体)。

步骤b合成3-烯丙基-4-羟基苯甲醛(3)：取4-(烯丙氧基)苯甲醛(2)(2.3g,18.5mmol)加入到反应瓶中，之后在N₂保护下逐滴加入N,N-二乙基苯胺(8.0ml)。反应瓶置于200℃沙浴条件下搅拌回流5个小时。反应结束后，反应瓶冷却至室温，利用硅胶柱层析法可直接得到重排后的中间体3-烯丙基-4-羟基苯甲醛(3)(996mg,产率33.2％，棕色液体)。

步骤c合成终产物L1-L11的通用步骤：将3-烯丙基-4-羟基苯甲醛(3)(1.0mmol)溶解在冰醋酸(10ml)溶液中，哌啶酮或取代哌啶酮(0.5mmol)也溶解在冰醋酸(4.0ml)溶液中。两种反应物分别用HCl气体饱和。接着在搅拌的条件下，将饱和后的哌啶酮或者取代哌啶酮溶液逐滴加入到含有中间体3的反应瓶中。加完后反应置于室温反应48个小时。反应结束后用饱和碳酸氢钠条件溶液的PH值为7.0。之后用乙酸乙酯(3×20ml)萃取三次。乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去乙酸乙酯。残留物用硅胶柱层析方法纯化可得到类型I中的终产物L1-L11(总产率20-30％)。

类型II中的化合物(L12-L19)的合成(步骤d-步骤f)：

步骤d合成OH保护的苯甲醛(5)：将3-烯丙基-4-羟基苯甲醛(3)(1.0g,6.17mmol)溶解于无水二氯甲烷(10mL)中，之后分批加入3,4-二氢-2H-吡喃(2.59g,30.83mmol)，接着加入催化剂PPTS(200mg,0.617mmol)。反应混合物在40℃下搅拌回流过夜。反应结束后将反应液用蒸馏水(40mL)和二氯甲烷(3×50mL)萃取。得到的二氯甲烷层用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后利用硅胶柱层析方法纯化得到中间体苯甲醛5(1.29g,产率85％，黄色液体)。

步骤e合成α,β-不饱和酮(6)：将羟基保后的苯甲醛中间体5(500mg,2.03mmol)溶解于无水二氯甲烷(15ml)中，加入1-环丙基哌啶-4-酮(310.83mg,2.33mmol)和吡咯烷(433.13mg,6.09mmol)。反应瓶置于40℃条件下搅拌回流4个小时。减压蒸馏除去溶剂二氯甲烷，直接用硅胶柱层析法纯化得到α,β-不饱和酮中间体6(5.26g,产率40％，棕色液体)。

步骤f合成L12-L19的通用方法：在无水乙醇(10ml)溶液中加入α,β-不饱和酮中间体6(0.544mmol)和不同取代的苯甲醛(0.544mmol)，反应置于室温条件下搅拌，之后逐滴加入20％(w/v)NaOH水溶液(0.8ml)，反应混合物与室温条件下搅拌过夜。反应结束后用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)和乙酸乙酯(3×20mL)萃取。合并的有机层用饱和氯化钠溶液(40mL)洗3次，无水硫酸镁干燥过滤，减压蒸馏除去乙酸乙酯。残留物接着溶解于无水乙醇(5mL)中，逐滴加入1M HCl(1ml)。反应瓶置于室温条件下搅拌5个小时。反应结束后用饱和氯化铵溶液(5mL)和乙酸乙酯溶液(3×10mL)萃取。合并的有机层用饱和氯化钠溶液(20mL)洗3次，无水硫酸镁干燥过滤，减压蒸馏除去乙酸乙酯。残留物利用硅胶柱层析方法可纯化得到类型II中的化合物L12-L19(总产率20％-40％)。

以下为制得化合物L1～L19的核磁共振谱图数据：

化合物(L1)：(3E,5E)-3,5-双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:25％.m.p:196.2-198.3℃.¹H>6)δ(ppm):9.96(2H,s,Ar-OH),7.46(2H,s,H-β,H-β'),7.19(2H,d,J＝8.4Hz,H-6,H-6'),7.18(2H,s,H-2,H-2'),6.88(2H,d,J＝8.4Hz,H-5,H-5'),6.01-5.94(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.07-5.02(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.94(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.31(4H,s,A,B-ArCH₂CH＝CH₂).¹³C>6)δ(ppm):186.8,156.2×2,136.7×2,134.1×2,132.7×2,132.6×2,130.3×2,126.4×2,126.0×2,115.6×2,115.2×2,47.5×2,33.5×2.ESI-MS,m/z:385.9[M-H]^-.

化合物(L2)：(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:30％.m.p:185.9-187.6℃.¹H>6)δ(ppm):10.00(2H,s,Ar-OH),7.48(2H,s,H-β,H-β'),7.20(2H,d,J＝8.4Hz,H-6,H-6'),7.19(2H,s,H-2,H-2'),6.89(2H,d,J＝8.4Hz,H-5,H-5'),6.01-5.94(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.07-5.02(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.66(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.31(4H,s,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),2.38(3H,s,N-CH₃).¹³C>6)δ(ppm):185.8,156.4×2,136.7×2,134.7×2,132.8×2,130.6×2,130.1×2,126.5×2,125.8×2,115.6×2,115.2×2,56.6×2,45.4,33.5×2.ESI-MS,m/z:400.0[M-H]^-.

化合物(L3)：(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:30％.m.p:181.3-183.2℃.¹H>6)δ(ppm):10.00(2H,s,Ar-OH),7.49(2H,s,H-β,H-β'),7.22(2H,d,J＝8.4Hz,H-6,H-6'),7.20(2H,s,H-2,H-2'),6.90(2H,d,J＝8.4Hz,H-5,H-5'),6.01-5.94(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.03(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.71(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.31(4H,d,J＝6.6Hz,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),2.56(2H,q,J＝7.2Hz,N-CH₂CH₃),0.98(3H,t,J＝7.2Hz,N-CH₂CH₃).¹³C>6)δ(ppm):186.2,156.4×2,136.7×2,134.8×2,132.7×2,130.7×2,130.2×2,126.5×2,125.8×2,115.6×2,115.3×2,53.9×2,50.6,33.4×2,12.1.ESI-MS,m/z:414.1[M-H]^-.

化合物(L4)：(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:30％.m.p:172.9-175.2℃.¹H>6)δ(ppm):10.01(2H,s,Ar-OH),7.49(2H,s,H-β,H-β'),7.21(2H,d,J＝8.4Hz,H-6,H-6'),7.20(2H,s,H-2,H-2'),6.89(2H,d,J＝8.4Hz,H-5,H-5'),6.01-5.94(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.07-5.02(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.71(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.31(4H,d,J＝6.6Hz,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),2.46(2H,t,J＝7.2Hz,N-CH₂CH₂CH₃),1.43-1.37(2H,m,N-CH₂CH₂CH₃),0.80(3H,t,J＝7.2Hz,N-CH₂CH₂CH₃).¹³C>6)δ(ppm):186.2,156.4×2,136.7×2,134.8×2,132.7×2,130.8×2,130.2×2,126.5×2,125.8×2,115.6×2,115.3×2,58.6,54.3×2,33.4×2,19.7,11.6.ESI-MS,m/z:428.3[M-H]^-.

化合物(L5)：(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-异丙基哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:30％.m.p:205.3-207.2℃.¹H>6)δ(ppm):9.99(2H,s,Ar-OH),7.46(2H,s,H-β,H-β'),7.22(2H,d,J＝8.4Hz,H-6,H-6'),7.20(2H,s,H-2,H-2'),6.90(2H,d,J＝7.8Hz,H-5,H-5'),6.01-5.95(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.09-5.04(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.75(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.31(4H,s,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),2.91-2.87(1H,m,N-CH(CH₃)₂),1.01(6H,d,J＝6.6Hz,N-CH(CH₃)₂).¹³C>6)δ(ppm):186.6,156.2×2,136.7×2,134.2×2,132.5×2,131.4×2,130.2×2,126.4×2,125.9×2,115.7×2,115.3×2,53.1,50.1×2,33.3×2,18.0×2.ESI-MS,m/z:428.1[M-H]^-.

化合物(L6)：(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:40％.m.p:82.5-85.1℃.¹H>6)δ(ppm):10.01(2H,s,Ar-OH),7.49(2H,s,H-β,H-β'),7.22(2H,d,J＝7.8Hz,H-6,H-6'),7.21(2H,s,H-2,H-2'),6.91(2H,d,J＝8.4Hz,H-5,H-5'),6.01-5.94(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.03(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.89(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.31(4H,s,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),1.98-1.95(1H,m,-N-CH-(CH₂)₂),0.46-0.43(2H,m,-N-CH-(CH₂)₂),0.26-0.25(2H,m,-N-CH-(CH₂)₂).¹³C>6)δ(ppm):186.1,156.4×2,136.7×2,134.9×2,132.8×2,130.7×2,130.0×2,126.5×2,125.8×2,115.6×2,115.3×2,54.5×2,37.5,33.4×2,6.3×2.ESI-MS,m/z:426.1[M-H]^-.

化合物(L7)：(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-(苯磺酰基)哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:35％.m.p:84.7-87.0℃.¹H>6)δ(ppm):10.17(2H,s,Ar-OH),7.74-7.71(1H,m,-N-SO₂-Ar-H-4),7.59-7.57(4H,m,N-SO₄-Ar-H-2,3,5,6),7.47(2H,s,H-β,H-β'),7.21(2H,dd,J₁＝8.4Hz,J₂＝1.8Hz,H-6,H-6'),7.14(2H,s,H-2,H-2'),6.95(2H,d,J＝7.8Hz,H-5,H-5'),6.04-5.97(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.13-5.07(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),4.49(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.35(4H,d,J＝6.6Hz,A,B-ArCH₂CH＝CH₂).¹³C>6)δ(ppm):183.7,156.9×2,137.2×2,136.8,136.6×2,133.5,132.5×2,130.6×2,129.4×2,127.5×2,127.2×2,126.7×2,125.2×2,115.8×2,115.5×2,46.9×2,33.4×2.ESI-MS,m/z:526.3[M-H]^-.

化合物(L8)：(3E,5E)-3,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-苄基哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:35％.m.p:135.9-137.8℃.¹H>6)δ(ppm):10.16(2H,s,Ar-OH),7.74-7.71(1H,m,N-CH₂-Benzene-4),7.60-7.59(4H,m,N-CH₂-Benzene-2,3,5,6),7.47(2H,s,H-β,H-β'),7.21(2H,dd,J₁＝8.4Hz,J₂＝1.8Hz,H-6,H-6'),7.14(2H,s,H-2,H-2'),6.95(2H,d,J＝8.4Hz,H-5,H-5'),6.05-5.98(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.13-5.08(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),4.49(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.35(4H,d,J＝6.6Hz,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.35(2H,s,N-CH₂-Benzene).¹³C>6)δ(ppm):186.1,156.4×2,136.6×2,134.9×2,132.4×2,130.6×2,130.4×2,129.0×2,128.2,128.1×2,127.1,126.5×2,125.7×2,115.7×2,115.2×2,61.2,54.2×2,33.4×2.ESI-MS,m/z:476.0[M-H]^-.

化合物(L9)：(2E,5E)-2,5双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)环戊酮：

Yellow power.Yield:60％.m.p:119.5-122.3℃.¹H>6)δ(ppm):10.04(2H,s,Ar-OH),7.39(2H,d,J＝8.4Hz,H-6,H-6’),7.39(2H,s,H-β,H-β’),7.30(2H,s,H-2,H-2’),6.91(2H,d,J＝7.8Hz,H-5,H-5’),6.02-5.95(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.03(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.32(4H,s,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.00(4H,s,cyclopentanone-CH₂-CH₂).¹³C>6)δ(ppm):194.7,156.7×2,136.6×2,134.4×2,132.6×2,132.4×2,130.5×2,126.7×2,126.7×2,115.6×2,115.4×2,33.6×2,25.9×2.ESI-MS,m/z:371.0[M-H]^-.calcd>25H₂₄O₃:372.17

化合物(L10)：(2E,6E)-2,6双(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)环己酮：

Yellow power.Yield:45％.m.p:140.3-142.1℃.¹H>6)δ(ppm):9.91(2H,s,Ar-OH),7.51(2H,s,H-β,H-β'),7.27(2H,d,J＝8.4Hz,H-6,H-6'),7.25(2H,s,H-2,H-2'),6.87(2H,d,J＝8.4Hz,H-5,H-5'),6.00-5.93(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.07-5.01(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.31(4H,d,J＝6.6Hz,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),2.84(4H,t,J＝4.8Hz,cyclohexanone-CH₂-CH₂-CH₂),1.71-1.69(2H,m,cyclohexanone-CH₂-CH₂-CH₂).¹³C>3OD)δ(ppm):192.3,157.5×2,138.7×2,138.0×2,134.7×2,134.0×2,131.5×2,128.6×2,128.1×2,115.9×2,115.7×2,35.0×2,29.5×2,24.2.ESI-MS,m/z:385.3[M-H]^-.calcd>26H₂₆O₃:386.18

化合物(L11)：(3Z,5Z)-3,5-双(3-烯丙基-4-羟基苯甲氧基)二氢-2H-噻喃-4(3H)-酮：

Yellow power.Yield:40％.m.p:152.4-154.1℃.¹H>6)δ(ppm):9.96(2H,s,Ar-OH),7.50(2H,s,H-β,H-β'),7.25(2H,d,J＝8.4Hz,H-6,H-6'),7.23(2H,s,H-2,H-2'),6.88(2H,d,J＝7.8Hz,H-5,H-5'),6.00-5.94(2H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),5.07-5.01(4H,m,A,B-ArCH₂CH＝CH₂),3.94(4H,s,CH₂-S-CH₂),3.31(4H,d,J＝6.6Hz,A,B-ArCH₂CH＝CH₂).¹³C>6)δ(ppm):187.5,156.3×2,136.7×2,135.6×2,132.5×2,131.2×2,130.1×2,126.5×2,125.6×2,115.6×2,115.2×2,33.5×2,29.4×2.ESI-MS,m/z:402.9[M-H]^-.calcd>25H₂₄O₃S:404.14

化合物(L12)：(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(2,4,5-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:25％.m.p:138.2-140.5℃.¹H>6)δ(ppm):10.05(1H,s,Ar-OH),7.79(1H,s,H-β'),7.50(1H,s,H-β),7.22(1H,d,J＝8.4Hz,H-6),7.22(1H,s,H-2),6.91(1H,d,J＝8.4Hz,H-5),6.85(1H,s,H-6'),6.76(1H,s,H-3'),6.01-5.94(1H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.03(2H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.86(6H,s,4',5'-OCH₃),3.85(3H,s,2'-OCH₃),3.74(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.31(2H,s,A-ArCH₂CH＝CH₂),1.98-1.93(1H,m,-N-CH-Cyclopropyl),0.43-0.42(2H,m,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl),0.25-0.24(2H,m,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl).¹³C>6)δ(ppm):186.1,153.7,151.4,142.1,137.4,136.7,135.3,133.0,131.3,130.7,130.1,130.0,126.6,125.9,115.7,115.3,114.5,114.3,97.7,56.5,56.2,56.0×3,37.4,33.5,6.3×2.ESI-MS,m/z:462.3[M+H]⁺.calcd>28H₃₁NO₅:461.21

化合物(L13)：(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(3,4-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:28％.m.p:143.8-145.9℃.¹H>6)δ(ppm):7.54(1H,s,H-β'),7.50(1H,s,H-β),7.17(1H,d,J＝8.4Hz,H-6),7.17(1H,s,H-2),7.09(1H,s,H-2'),7.07(1H,d,J＝8.4Hz,H-6'),7.04(1H,d,J＝8.4Hz,H-5),6.80(1H,d,J＝8.4Hz,H-5'),6.03-5.96(1H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.02(2H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.92(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.90(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.81(3H,s,3'-OCH₃),3.80(3H,s,4'-OCH₃),3.30(2H,d,J＝6.0Hz,A-ArCH₂CH＝CH₂),1.99-1.96(1H,m,-N-CH-Cyclopropyl),0.46-0.45(2H,m,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl),0.26(2H,s,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl).¹³C>6)δ(ppm):185.7,149.6,148.5×2,137.2×2,136.1,134.0,133.0,132.2,130.6,127.7,127.1,123.3,116.1,115.2,114.3,111.7×2,55.5×2,54.8,54.4,37.5,33.7,6.3×2.ESI-MS,m/z:431.9[M+H]⁺.calcd>27H₂₉NO₄:431.21

化合物(L14)：(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(2,4,6-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:25％.m.p:195.3-198.2℃.¹H>6)δ(ppm):10.02(1H,s,Ar-OH),7.50(1H,s,H-β'),7.44(1H,s,H-β),7.23(1H,d,J＝8.4Hz,H-6),7.22(1H,s,H-2),6.91(1H,d,J＝8.4Hz,H-5),6.29(2H,s,H-5',H-3'),6.01-5.95(1H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.04(2H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.86(3H,s,4'-OCH₃),3.83(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.79(6H,s,2',6'-OCH₃),3.38(2H,s,A-ArCH₂CH＝CH₂),1.86-1.83(1H,m,-N-CH-Cyclopropyl),0.39-0.38(2H,m,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl),0.19-0.18(2H,m,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl).¹³C>6)δ(ppm):185.5,162.0,158.7×3,137.3×2,136.5×2,133.9,133.0,130.7,127.2×2,115.2,115.2,105.0,90.7×2,55.6×2,55.5,55.3,54.9,37.5,33.8,6.2×2.ESI-MS,m/z:462.0[M+H]⁺.calcd>28H₃₁NO₅:461.21

化合物(L15)：(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(2,4-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:25％.m.p:182.6-184.5℃.¹H>6)δ(ppm):10.02(1H,s,Ar-OH),7.79(1H,s,H-β'),7.49(1H,s,H-β),7.24(1H,d,J＝6.0Hz,H-6'),7.22(1H,d,J＝7.8Hz,H-6),7.22(1H,s,H-2),6.69(1H,s,H-3'),6.91(1H,d,J＝7.8Hz,H-5),6.64(1H,d,J＝6.0Hz,H-5'),6.01-5.95(1H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.03(2H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.89(2H,s,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.85(4H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.82(6H,s,2',4'-OCH₃),1.97-1.93(1H,m,-N-CH-Cyclopropyl),0.45-0.42(2H,m,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl),0.26-0.23(2H,m,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl).¹³C>6)δ(ppm):186.0,159.6,156.4,136.7,135.2,131.3,131.1×2,130.7,130.1,129.8,129.6,126.5,125.8,115.6,115.3,105.2×2,98.4,55.4×2,54.8,54.5,37.5,33.4,6.3×2.ESI-MS,m/z:431.9[M+H]⁺.calcd>27H₂₉NO₄:431.21

化合物(L16)：(3E,5E)-3-(3-烯丙基l-4-羟基苯亚甲基)-5-(4-(叔丁氧基)苯亚甲基)-1-环丙基哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:25％.m.p:163.2-165.1℃.¹H>6)δ(ppm):10.04(1H,s,Ar-OH),7.53(1H,s,H-β'),7.50(1H,s,H-β),7.43(2H,d,J＝8.4Hz,H-6',H-2'),7.23(1H,s,J＝8.4Hz,H-6),7.22(1H,s,H-2),7.08(1H,d,J＝8.4Hz,H-5),6.92(2H,d,J＝7.8Hz,H-5',H-3'),6.01-5.95(1H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.03(2H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.93(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.91(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.46-3.42(2H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),1.99-1.98(1H,m,-N-CH-Cyclopropyl),1.36(9H,s,-OC(CH3)₃),0.46-0.45(2H,m,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl),0.27(2H,m,N-CH₂-CH₂-Cyclopropyl).¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):186.2,156.5,156.3,136.6×2,135.2,133.9,132.9,132.4,131.7×2,130.6,130.1,129.1,126.6,122.8×2,115.6,115.3,78.7,56.0,54.6,37.5,33.4,28.5×3,6.4×2.ESI-MS,m/z:444.5[M+H]⁺.calcd>29H₃₃NO₃:443.51

化合物(L17)：(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯亚甲基)哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:20％.m.p:210.3-213.1℃.¹H>6)δ(ppm):7.47(2H,s,H-β',H-β),7.34(2H,d,J＝9.0Hz,H-6',H-2'),7.15(2H,s,H-6,H-2),7.00(2H,d,J＝9.0Hz,H-5',H-3'),6.77(1H,d,J＝7.2Hz,H-5),6.02-5.96(1H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.01(2H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.89(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.88(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.29(2H,d,J＝6.6Hz,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.26(4H,t,J＝4.8Hz,-N-(CH₂CH₂)₂-N-CH₃),2.43(4H,t,J＝4.8Hz,-N-(CH₂CH₂)₂-N-CH₃),2.21(3H,s,-N-CH₃),1.99-1.96(1H,m,-N-CH-(CH₂)₂),0.45-0.44(2H,m,-N-CH-(CH₂)₂),0.27-0.25(2H,m,-N-CH-(CH₂)₂).¹³C>6)δ(ppm):185.5,151.0,137.3×2,135.7,134.2,132.9,132.0×4,130.6,130.5,127.2,124.6,116.2,115.2,114.3×2,54.8,54.7,54.3×2,46.8×2,45.7,37.6,33.8,6.3×2.ESI-MS,m/z:470.4[M+H]⁺.

化合物(L18)：(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(4-吗啉苯亚甲基)哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:28％.m.p:196.5-198.7℃.¹H>6)δ(ppm):10.00(1H,s,Ar-OH),7.51(1H,s,H-β'),7.48(1H,s,H-β),7.39(2H,d,J＝9.0Hz,H-6',H-2'),7.22(1H,d,J＝7.8Hz,H-6),7.19(1H,s,H-2),7.03(2H,d,J＝9.0Hz,H-5',H-3'),6.91(1H,d,J＝7.8Hz,H-5),6.01-5.95(1H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.03(2H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.92(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.89(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.74(4H,t,J＝4.8Hz,-N-(CH₂CH₂)₂-O),3.27(2H,d,J＝6.6Hz,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.24(4H,t,J＝4.8Hz,-N-(CH₂CH₂)₂-O),2.00-1.96(1H,m,-N-CH-(CH₂)₂),0.47-0.46(2H,m,-N-CH-(CH₂)₂),0.27-0.26(2H,m,-N-CH-(CH₂)₂).¹³C>6)δ(ppm):185.9,156.4,151.2,136.7,134.8,134.7,132.8,132.1×2,130.8,130.4,130.0,126.5,125.8,124.9,115.6,115.3,114.1×2,65.9×2,54.7,54.5,47.1×2,37.6,33.4,6.4×2.ESI-MS,m/z:457.3[M+H]⁺.

化合物(L19)：(3E,5E)-3-(3-烯丙基-4-羟基苯亚甲基)-1-环丙基-5-(4-(吡咯烷-1-基)苯亚甲基)哌啶-4-酮：

Yellow power.Yield:25％.m.p:186.8-188.5℃.¹H>6)δ(ppm):7.50(1H,s,H-β'),7.46(1H,s,H-β),7.34(2H,d,J＝9.0Hz,H-6',H-2'),7.17(1H,d,J＝5.4Hz,H-6),7.17(1H,s,H-2),6.85(1H,d,J＝8.4Hz,H-5),6.62(2H,d,J＝8.4Hz,H-5',H-3'),6.02-5.95(1H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),5.08-5.04(2H,m,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.90(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.87(2H,s,piperidone-CH₂-N-CH₂),3.30(2H,d,J＝6.6Hz,A-ArCH₂CH＝CH₂),3.30(4H,s,-N-(CH₂-CH₂)₂),1.99-1.95(5H,m,-N-CH-(CH₂)₂,-N-(CH₂-CH₂)₂),0.47-0.45(2H,m,-N-CH-(CH₂)₂),0.27-0.25(2H,m,-N-CH-(CH₂)₂).¹³C>6)δ(ppm):185.5,148.0,137.0×2,135.5,134.7,132.7×2,132.5,130.5,130.1,130.0,128.5,126.7,121.7,115.4×2,111.7×2,54.9,54.7,47.1×2,37.7,33.6,24.9×2,6.3×2.ESI-MS,m/z:441.4[M+H]⁺.

实施例2化合物L9、L10、L11和姜黄素的稳定性测试

稳定性测试条件：25℃条件下，将各个化合物分别溶解于PH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，形成20uMol/mL的溶液。用酶标仪测定250-600纳米处的OD值，时间点设定为0-25分钟，每隔5分钟采集一次，最后形成降解曲线，评估化合物的稳定性，得到的结果见图1。

实施例3化合物L1-L19的体外抗肿瘤活性检测

细胞系和试剂：人正常肝细胞，包括HL-7702、HIBEC和NRK-602E细胞购于American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA。胎牛血清购于HyClone,Logan,UT,USA，并在65℃下热灭活30分钟。脂多糖(LPS)和试剂购于Sigma–Aldrich,St Louis,MO,USA。一抗，包括anti-Bcl-2,anti-Bax,anti-Cdc2,anti-Cyclin B1,anti-GAPDH和二抗购于Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA。

细胞培养和给药：在含5％CO₂的37℃环境下，细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI>

实施例4化合物抗人胆管癌细胞增殖测定

细胞培养于包含10％FBS的RPMI 1640培养基的96孔板(5000个细胞/孔)中，在细胞生长24小时后给予不同浓度的化合物。PBS配制的新鲜的MTT(5mg/ml)溶液加入到每个孔内。甲瓒晶体在活细胞内形成，用150μL的DMSO溶液溶解后，化合物的吸光度在490nm下用酶标仪测定。化合物的IC₅₀值可用Graphpad>

实施例5细胞周期测定

利用碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术确定细胞周期状态和核DNA内容物。人胆管癌细胞系包括QBC-939、RBE和HUCCA细胞用两毫升培养基铺于六孔板(3×10⁵细胞/孔)内。孵化过夜后，分别用化合物L11(5,7.5,10μM)和姜黄素(20μM)处理无血清培养基中的细胞，作用24小时。之后收集细胞并且加入70％冰乙醇。PBS清洗后，细胞于4℃下用PI染色。细胞在不同的G1、S和G2/M周期的百分率可通过Cell-Quest>

实施例6流式细胞术(Annexin V-FITC染色)测定人胆管癌细胞凋亡率

采用Annexin V-FITC/PI染色测定凋亡情况。人胆管癌细胞系，包括QBC-939、RBE、HUCCA铺于60-mm板中，孵化24小时，之后化合物L11(5,7.5,10μM)和姜黄素(20μM)分别处理24小时。给药后，收集细胞，用冰冷的PBS清洗两次。FITC conjugated Annexin V和碘化丙啶(PI)在结合缓冲液中作用30分后双染，利用FACSCalibur flow cytometer(BDBiosciences,CA)测定细胞凋亡情况。采用不同的化合物进行检测，得到的结果如图3(A)、图3(B)、图4(A)和图4(B)所示。

实施例7蛋白质印迹(Western Blotting)测定

处理之后，收集细胞，用蛋白裂解缓冲液裂解细胞，之后4℃下12000rpm转速离心10分钟除去杂质。Bradford protein assay kit(Bio-Rad,Hercules,CA)方法测定所有样品的蛋白浓度。加入样品上样缓冲液后，蛋白样品经电泳后转移到多聚亚乙烯基二氟化物转移膜。2小时后，于室温下用TBST新鲜配制的5％脱脂牛奶终止印迹，之后于4℃在TBST中用特异性的一抗孵化过夜。接下来用TBST清洗3次，用辣根过氧化物酶结合的二抗孵化1小时，通过ECL kit(Bio-Rad,Hercules,CA)可视化免疫反应带状物。免疫反应带状物的密度用Image J computer software(National Institute of Health,MD)分析而得。采用不同的化合物进行检测，得到的结果如图3(C)和图4(C)所示。

统计学分析

所有的实验独立重复三次，结果用平均值±标准误差(SD)呈现。实验结果的统计学意义用Student's T-test评价。P<0.05认为有统计学意义。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。