蛋白质N末端肽段的在线分离装置及使用方法

摘要

本发明属于生物分析和检测技术领域，具体为一种蛋白质N末端肽段的在线分离装置及使用方法。该装置包括：两台高压泵、六通阀、四通阀、三通阀、C18柱和巯基肽段捕集柱以及相关连接部件。本发明中，蛋白质固定于填充C18疏水性填料的毛细管柱中，进而进行柱上氨基封闭，柱上酶解，酶解肽段固相巯基衍生，巯基肽段捕集柱捕集非N末端肽段，实现N末端肽段的在线分离。固相的蛋白封闭反应可以减少除盐过程中的损失，简化实验步骤，缩短样品反应时间；同时，可以通过采用过量的衍生试剂，实现肽段高效快速的巯基衍生。本发明通过在线装置，使得反应时间缩短，减少样品转移，减少样品损失，缩短除盐等预处理步骤的耗时，提高蛋白质N末端肽段鉴定效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物分析和检测技术领域，具体涉及一种蛋白质N末端肽段的在线分离装置及使用方法。

背景技术

设计联用在线装置，减少样品在转移过程中的污染和损失，在蛋白质组学研究中被大量应用,比如应用于磷酸化肽的研究，通过直接上样，减少了转移过程中样品的吸附，使得最终鉴定到的磷酸化肽数目约提高至原来的4倍；通过构建在线平台，与离线方法相比，可以缩短样品前处理时间，可以进一步降低样品的蛋白起始量，被应用于少量细胞的蛋白鉴定中。

鉴定蛋白质N末端序列及其翻译后修饰，以期修正基因组翻译的蛋白质序列，同时探索相关的蛋白质功能。而在目前的实验路线中，多采用离线的模式，需要对样品进行还原烷基化，蛋白层面的氨基封闭、酶解等，涉及多次的溶剂交换和样品转移；同时，实验过程耗时长，容易造成样品中的蛋白发生降解等问题。

基于以上两点考虑，本发明通过设计蛋白质N末端肽段的在线分离装置，实现蛋白质N末端的高效分离和鉴定。首先，将蛋白固定，进行固相的氨基封闭，该反应可以通过加大封闭试剂的浓度减少反应时间；同时，固定化的蛋白，可以简单地通过清洗的方式除去多余的盐分，减少了样品转移过程和溶剂交换的损失；结合固定化蛋白酶解等，搭建起蛋白质N末端肽段的在线分离系统，使得N末端肽段鉴定数目进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白质N末端肽段的在线分离装置及使用方法。

本发明提供的蛋白质N末端肽段的在线分离装置，该装置包括：两台高压泵、一个六通阀、一个四通阀、一个三通阀、一个C18柱和一个巯基肽段捕集柱以及相关连接部件。其中，六通阀有6个接口，高压泵1和六通阀的6号口相连，六通阀的3号口为进样口，进样环连接于六通阀的1号口和4号口之间，C18柱连接于六通阀的5号口和四通阀的2号口之间，六通阀的3号口和四通阀的1号口连接废液瓶子，高压泵2、四通阀的3号口和巯基肽段捕集柱用三通阀相连。其中，高压泵1有A、B、C和D共4个相位，分别对应于A、B、C和D 4个相：A相为去离子水；B相为氨基封闭试剂，由甲醛和氰基硼氢化钠新鲜配制而成，甲醛浓度为0.2-3 M，氰基硼氢化钠浓度为0.1-1.5 M；C相为三乙基碳酸氢铵溶液,浓度为20 mM-1 M；D相为含0.1%三氟乙酸的乙腈。如图1所示。

本发明中，蛋白质固定于填充C18疏水性填料的毛细管柱中，进而进行柱上氨基封闭，柱上酶解，酶解肽段固相巯基衍生，巯基肽段捕集柱捕集非N末端肽段，实现N末端肽段的在线分离。

本发明利用六通阀的切换实现蛋白质进样，酶解，和酶解肽段的巯基衍生；利用装填有金修饰填料的巯基肽段捕集柱，实现含巯基肽段的在线捕集。在该分离过程中，固相的蛋白封闭反应可以减少除盐过程中的损失，简化实验步骤，缩短样品反应时间；同时，固相的衍生反应中，可以通过采用过量的衍生试剂，实现肽段高效快速的巯基衍生。本发明通过在线化装置，使得反应时间缩短，减少样品转移，减少样品损失，缩短除盐等预处理步骤的耗时，可以方便高效地去除非N末端肽段，提高蛋白质N末端肽段鉴定效果。

本发明提供的蛋白质N末端肽段的在线分离装置的使用方法，其基本步骤为：

（1）将六通阀和四通阀都保持在A位，用进样针将蛋白样品注射入进样环；

（2）将六通阀切换至B位，用A相将进样环中的样品以0.01-0.4μL/min的流速通过C18柱；

（3）将六通阀切换至A位，以0.01-0.4μL/min的流速，依次往C18柱中通入B相，反应0.2-4小时，继而通入A相，冲洗C18柱，于此同时，用进样针将胰蛋白酶溶液注射入进样环；

（4）将六通阀切换至B位，用C相将进样环中的胰蛋白酶溶液以0.01-0.4μL/min的流速通过C18柱；

（5）将六通阀切换至A位，用进样针将特劳特试剂注射入进样环，同时，用A相冲洗C18柱；

（6）将六通阀切换至B位，用C相将进样环中的特劳特试剂以0.01-0.4μL/min的流速通过C18柱；

（7）将六通阀切换至A位，将四通阀切换至B位，以0.01-0.4μL/min的流速用D相洗脱C18柱，同时，泵2以0.2-4倍流速通入A相，混合液进入巯基肽段捕集柱，流出液进入液相色谱质谱联用仪进行检测。

以上步骤如图2所示。

本发明中，C18柱的制备方法如下：将C18填料分散于乙腈中，利用气压，将填料填入毛细管中。巯基肽段捕集柱的制备方法如下：首先，将含有三氟乙磺酸基高聚物材料与半胱氨酸混合，置于碱性的缓冲体系中孵育；第二，通过离心得到半胱氨酸修饰的聚合物材料；经过几次水洗后，将该材料与预先合成好的纳米金胶孵育，离心，得到纳米金修饰的高聚物填料；第三，将该填料烘干，并分散于无水乙醇中，利用气压将填料填入毛细管中。

利用本发明设计的蛋白质N末端肽段的在线分离装置，可以在3小时内完成全部实验步骤，包括：蛋白的氨基封闭、酶解、巯基衍生和巯基肽段捕集等，具有相当的应用潜力。

附图说明

图1为本发明的一体化装置图。

图2为N末端肽段在线分离流程图。其中，A相为去离子水；B相为氨基封闭试剂，由甲醛和氰基硼氢化钠新鲜配制而成，甲醛浓度为0.2-3 M，氰基硼氢化钠浓度为0.1-1.5 M；C相为三乙基碳酸氢铵溶液,浓度为20 mM-1 M；D相为含0.1%三氟乙酸的乙腈。

具体实施方式

实施例1：蛋白质在C18柱上氨基封闭和酶解

将还原烷基化后的牛血清白蛋白取10 μg经六通阀切换负载在C18柱中；将六通阀切换至A位，泵1的B相以2 μL/min通过C18柱，反应1小时后；接着，再用A相清洗C18柱子；同时，在进样环中注入30 μL胰蛋白酶溶液，泵1的C相以2 μL/min的流速推动进样环中的酶溶液通过C18柱；反应半小时后，利用C相将C18柱上的肽段洗脱，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定。结果表明牛血清白蛋白能的氨基能被成功封闭，随之被有效地酶解。

实施例2：C18柱上巯基衍生和巯基肽段捕集柱的捕集效果

将乙酰化肽段GR（1021.5 Da)和氨基游离肽段ER（1282.6 Da)注入C18柱后，再进样120 μL 2 M特劳特试剂，用泵1的C相将该试剂以2 μL/min通过C18柱，接着，再用D相将巯基衍生后的肽段洗脱。此时，将四通阀切换至B位，泵2以相同流速注入去离子水，洗脱和去离子水经三通阀进入巯基肽段捕集柱。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定，流出液中仅检测到肽段GR的信号，证明了C18柱子上巯基衍生效果良好，且含巯基肽段被成功地捕集，N末端肽段可以得到有效分离。