一种功能性红曲中是否添加洛伐他汀的鉴别方法

摘要

本发明涉及红曲成分鉴定领域，公开了一种功能性红曲中是否添加洛伐他汀的鉴别方法，包括：（1）标准曲线的制定：以莫纳可林K、洛伐他汀为原料，配制n个检测样，测定检测样中δ

说明书

技术领域

本发明涉及红曲成分鉴定领域，尤其涉及一种功能性红曲中是否添加洛伐他汀的鉴别方法。

背景技术

红曲，是食疗两用的传统中药保健品。始用于唐代，已有一千多年历史，明朝李时珍在<<本草纲目>>中早有记载：红曲主治消食活血，健脾燥胃，跌打伤损，以及妇女血气痛和产后恶血不尽。

红曲是红曲霉寄生在大米上的发酵品，近代科学进一步揭示了红曲还具有其它独特的功效。1979年日本学者远藤章发现红曲中含有血脂调节剂——HMG-COA还原酶抑制剂(莫纳可林K)，并认为这是红曲的主要功效成分。莫纳可林K可竞争性地阻断肝脏总胆固醇的合成，使血清总胆固醇(TC)降低，并能降低甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白(LDL-C)，升高高密度脂蛋白(HDL-C)。因此红曲能够降低胆固醇，预防心血管疾病等。

由于纯天然的红曲制备复杂，且红曲中莫纳可林K的含量较低，价格较贵。目前，市场上有厂家把洛伐他汀添加到功能性红曲中，提高功效成分莫纳可林K的总含量，来假冒天然功能性红曲。

洛伐他汀是土曲霉发酵后经提纯而得，美国默克公司用洛伐他汀制成降高脂血症产品“美降之”。洛伐他汀的结构与闭环莫纳可林K的结构相同，本身是没有活性的，只有经过人体产生的羧基酯酶水解转化为有活性的开环莫纳可林K才有调节血脂的功效，但这一过程需要消耗人体的羧基酯酶，会增加肝和肾的负担。另外用来提取洛伐他汀的残留有机溶剂也不免会对人体产生副作用。而红曲，是一种天然的红曲霉发酵产品，无需经过任何提纯，经现代科学实验证明：由于红曲是天然发酵产品，在安全性方面更比处方药洛伐他汀安全可靠。同时还含有多种必需氨基酸、不饱和脂肪酸，各种活性酶与糖等。由于其成分的多样性，决定了其多系统、多靶点协同作用的特点：除了益肝和胃，消食之功效之外，还能调节血脂、降低血粘度、降血压、改善糖尿病、预防骨质疏松、抗肿瘤、抗阿尔茨海默症以及预防动脉粥样硬化等方面的应用。上述充分表明，红曲的作用远远超过单一的洛伐他汀的作用，它的前途更加广阔，从而受到世界各国的青睐。

但是目前，并没有一种简单有效且准确的方法能够鉴别功能性红曲产品中有否有人为添加洛伐他汀。因此，如何有效鉴别天然功能性红曲产品中是否人工添加洛伐他汀一直是本领域想要解决的技术难题，对于保障人民的身体健康和红曲行业的正常发展都具有很重要的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种功能性红曲中是否添加洛伐他汀的鉴别方法。本发明的鉴别方法有效准确，能够对功能性红曲中是否添加洛伐他汀进行定量鉴别，填补了目前该领域的空白。

本发明的具体技术方案为：一种功能性红曲中是否添加洛伐他汀的鉴别方法，包括以下步骤：

(1)标准曲线的制定：以莫纳可林K、洛伐他汀为原料，分别配制n个不同的检测样，其中检测样中洛伐他汀质量百分比为0-100％；检测样用甲醇溶解后注入HPLC预处理的分离柱中；采用同位素比例质谱仪、元素分析仪，测定检测样中δ¹³C值；以洛伐他汀的质量百分比为横坐标，以δ¹³C值为纵坐标，将测得的各个δ¹³C值，制得δ¹³C值与洛伐他汀的质量百分比关系的标准曲线A；

(2)功能性红曲待测样鉴别：对功能性红曲待测样中的莫纳可林K以及洛伐他汀进行提取，得到提取物；提取物用甲醇溶解后注入HPLC预处理的分离柱中；采用同位素比例质谱仪、元素分析仪，测定提取物的δ¹³C值；

(3)将提取物的δ¹³C值代入到标准曲线A中，求得功能性红曲待测样的提取物中洛伐他汀的质量百分比。

作为优选，步骤(1)中所述的n为大于等于3的自然数。

作为优选，步骤(1)中所述的n为10，其中各检测样中洛伐他汀的质量百分比分别为0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。

作为优选，步骤(1)中所述的n为6，其中各检测样中洛伐他汀的质量百分比分别为0％，26％，40％，57.5％，73％，100％。

作为优选，在步骤(1)中，同时测定检测样中δ²H值；以洛伐他汀的质量百分比为横坐标，以δ²H值为纵坐标，将测得的各个δ²H值，制得δ²H值与洛伐他汀的质量百分比关系的标准曲线B；在步骤(2)中，同时测定提取物的δ²H值；在步骤(3)中，将提取物的δ²H值代入到标准曲线B中，求得功能性红曲待测样的提取物中洛伐他汀的质量百分比。

本发明人通过对莫纳可林K以及洛伐他汀的进行长期的研究，特别是对于莫纳可林K以及洛伐他汀两者培养方式的研究，发现以下区别：洛伐他汀来自于液体深层发酵，目前市面上洛伐他汀的培养基含有葡萄糖、乳糖、玉米浆或大豆衍生物等。这些培养基中的物质，其为碳源、氢源均是通过C4途径(光合作用)合成的，因此洛伐他汀的δ¹³C(平均值为-16‰左右)、δ²H(平均值为-278‰左右)与培养基配料中的C4源相一致。莫纳可林K来自大米的发酵物，大米是通过C3途径(光合作用)合成的，其δ¹³C值相对同位素标准V-PDB被表征在-25‰和-27‰之间，莫纳可林K的¹³C(平均值为-30‰左右)、δ²H(平均值为-310‰左右)与基质的植物学来源相一致。

发现上述区别特征后，本发明人运用基质合成途径的不同，对莫纳可林K和洛伐他汀进行稳定同位素比例进行鉴别，并且能够进行定量分析，方法简单，稳定性较好。本发明通过两条标准曲线求得待测样提取物中洛伐他汀的质量百分比，双重验证，可靠性更高。

作为优选，步骤(2)中所述提取物的提取方法为：

将功能性红曲待测样粉碎至40目并充分混合均匀，称取400.0-600.0mg于50mL容量瓶中，加入75vol％乙醇30mL，摇匀，室温下超声40-60min，加75vol％乙醇至接近容量瓶刻度，摇匀后再超声8-12min，之后冷却至室温，用75vol％乙醇定容至50mL，以3000-4000rpm的旋转速度离心8-12min，去除不溶残渣，取上清液经0.45微米的微孔滤膜过滤，滤液干燥后制得提取物。

采用上述方法对功能性红曲待测样中的莫纳可林K和洛伐他汀进行提取，方法简单，提取率高。

作为优选，所述检测样或提取物用甲醇溶解后通过注入2mL至HPLC预处理的分离柱中，所述分离柱规格为：kromaton,Annonay F 21*250mm,5μm。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明的鉴别方法有效准确，能够对功能性红曲中是否添加洛伐他汀进行定量鉴别，填补了目前该领域的空白。

附图说明

图1为实施例1中的标准曲线A；

图2为实施例1中的标准曲线B。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种功能性红曲中是否添加洛伐他汀的鉴别方法，包括以下步骤：

(1)标准曲线的制定：以莫纳可林K、洛伐他汀为原料，分别配制6个检测样，其中各检测样中洛伐他汀的质量百分比分别为0％，26％，40％，57.5％，73％，100％。检测样用甲醇溶解后注入2mL至HPLC预处理的分离柱(kromaton,Annonay F 21*250mm,5μm)中；采用同位素比例质谱仪、元素分析仪，测定检测样中δ²H值和δ¹³C值；测得的各个δ²H值、δ¹³C值，如下表所示：

洛伐他汀质量百分比(％)δ¹³C(‰)δ²H(‰)0-29.7-31026-25.74-30240-23.88-29857.5-21.85-29273-19.63-286100-15.92-278

根据上表中数据，以洛伐他汀的质量百分比为横坐标，以δ¹³C值、δ²H值分别为纵坐标，分别制得δ¹³C值与洛伐他汀的质量百分比关系的标准曲线A以及δ²H值与洛伐他汀的质量百分比关系的标准曲线B，分别如图1、图2所示。

(2)功能性红曲待测样鉴别：将功能性红曲待测样粉碎至40目并充分混合均匀，称取500.0mg于50mL容量瓶中，加入75vol％乙醇30mL，摇匀，室温下超声50min，加75vol％乙醇至接近容量瓶刻度，摇匀后再超声10min，之后冷却至室温，用75vol％乙醇定容至50mL，以3500rpm的旋转速度离心10min，去除不溶残渣，取上清液经0.45微米的微孔滤膜过滤，滤液干燥后制得提取物。提取物用甲醇溶解后通过注入2mL至HPLC预处理的分离柱(kromaton,Annonay F 21*250mm,5μm)中；采用同位素比例质谱仪、元素分析仪，测定提取物的δ²H值和δ¹³C值；其中δ¹³C为-25.55‰，δ²H值为-300.44‰

(3)将提取物的δ²H值和δ¹³C值分别代入到标准曲线B以及标准曲线A中，分别求得功能性红曲待测样的提取物中洛伐他汀的质量百分比，δ¹³C对应的数值a为29.26％，δ²H对应的数值b为30.43％。因此功能性红曲待测样的提取物中洛伐他汀的质量百分比在29.26％-30.43％区间。

实施例2

一种功能性红曲中是否添加洛伐他汀的鉴别方法，包括以下步骤：

(1)标准曲线的制定：以莫纳可林K、洛伐他汀为原料，分别配制10个检测样，其中各检测样中洛伐他汀的质量百分比分别为0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。检测样用甲醇溶解后注入2mL至HPLC预处理的分离柱(kromaton,Annonay F21*250mm,5μm)中；采用同位素比例质谱仪、元素分析仪，测定检测样中δ²H值和δ¹³C值；以洛伐他汀的质量百分比为横坐标，以δ²H值、δ¹³C值分别为纵坐标，将测得的各个δ²H值、δ¹³C值，分别制得δ²H值与洛伐他汀的质量百分比关系的标准曲线B以及δ¹³C值与洛伐他汀的质量百分比关系的标准曲线A。

(2)功能性红曲待测样鉴别：将功能性红曲待测样粉碎至40目并充分混合均匀，称取400.0mg于50mL容量瓶中，加入75vol％乙醇30mL，摇匀，室温下超声40min，加75vol％乙醇至接近容量瓶刻度，摇匀后再超声8min，之后冷却至室温，用75vol％乙醇定容至50mL，以3000rpm的旋转速度离心12min，去除不溶残渣，取上清液经0.45微米的微孔滤膜过滤，滤液干燥后制得提取物。提取物用甲醇溶解后通过注入2mL至HPLC预处理的分离柱(kromaton,Annonay F 21*250mm,5μm)中；采用同位素比例质谱仪、元素分析仪，测定提取物的δ²H值和δ¹³C值；

(3)将提取物的δ²H值和δ¹³C值分别代入到标准曲线B以及标准曲线A中，分别求得功能性红曲待测样的提取物中洛伐他汀的质量百分比。

实施例3

一种功能性红曲中是否添加洛伐他汀的鉴别方法，包括以下步骤：

(1)标准曲线的制定：以莫纳可林K、洛伐他汀为原料，分别配制10个检测样，其中各检测样中洛伐他汀的质量百分比分别为0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。检测样用甲醇溶解后注入2mL至HPLC预处理的分离柱(kromaton,Annonay F21*250mm,5μm)中；采用同位素比例质谱仪、元素分析仪，测定检测样中δ²H值和δ¹³C值；以洛伐他汀的质量百分比为横坐标，以δ²H值、δ¹³C值分别为纵坐标，将测得的各个δ²H值、δ¹³C值，分别制得δ²H值与洛伐他汀的质量百分比关系的标准曲线B以及δ¹³C值与洛伐他汀的质量百分比关系的标准曲线A。

(2)功能性红曲待测样鉴别：将功能性红曲待测样粉碎至40目并充分混合均匀，称取600.0mg于50mL容量瓶中，加入75vol％乙醇30mL，摇匀，室温下超声60min，加75vol％乙醇至接近容量瓶刻度，摇匀后再超声12min，之后冷却至室温，用75vol％乙醇定容至50mL，以4000rpm的旋转速度离心8min，去除不溶残渣，取上清液经0.45微米的微孔滤膜过滤，滤液干燥后制得提取物。提取物用甲醇溶解后通过注入2mL至HPLC预处理的分离柱(kromaton,Annonay F 21*250mm,5μm)中；采用同位素比例质谱仪、元素分析仪，测定提取物的δ²H值和δ¹³C值；

(3)将提取物的δ²H值和δ¹³C值分别代入到标准曲线B以及标准曲线A中，分别求得功能性红曲待测样的提取物中洛伐他汀的质量百分比。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。