基于喹啉骨架的Cu2+和Fe3+双靶点荧光探针及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种基于喹啉骨架的Cu2+和Fe3+双靶点荧光探针及其制备方法和应用，该双靶点荧光探针具有式I所示的结构。本发明的双靶点荧光探针对Cu2+和Fe3+的识别具有高灵敏度和高选择性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物荧光探针领域，更具体地，涉及一种基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺双靶点荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

铜和铁是人类生产生活中被广泛使用的金属，两者作为过渡元素具有显著的生物相关性。它们常常作为辅酶或其他辅助因子参与生物体的生长代谢。过量的Cu²⁺和Fe³⁺会引起机体代谢障碍及其他严重疫病。Cu²⁺和Fe³⁺引起的代谢障碍疾病主要包括器官功能紊乱或者神经退行性疾病。因此对于过渡金属的检测十分重要。

荧光检测具有高灵敏度、高选择性、操作简易、快速响应等优势。细胞荧光成像作为生物和药物科学领域里一种高效的探测手段备受关注。而用于细胞成像的荧光物质，应当有良好的水溶性、高亮度、光稳定性和低毒性。荧光小分子由于其良好的生物相容性、优越的光物理特性被应用于细胞内成像检测。喹啉是一个大的共轭体系，可以很容易地产生π到π*的电子跃迁，喹啉基衍生物不仅具有较强的荧光，而且其杂环氮原子能参与配位，即同时具有识别和荧光功能。近年来基于喹啉骨架特异性识别Zn²⁺，Ag⁺，Fe³⁺，Cu²⁺等离子的小分子荧光探针被广泛报道。然而，同时识别双靶点或多靶点的荧光探针被较少报道。双靶点荧光探针具有高效、低成本、操作简易的优势，因此，设计一种能够同时识别双靶点、生物相容性好的荧光探针显得日益重要。

发明内容

本发明的目的提供一种基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺双靶点荧光探针，以及提供该双靶点荧光探针的制备方法和其在细胞成像中的应用。

本发明的第一方面是提供一种基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺双靶点荧光探针(以下简称QLBM)，该双靶点荧光探针具有式I所示的结构：

本发明的第二方面是提供该双靶点荧光探针的制备方法，该方法包括：

(i)在第一有机溶剂存在下，使喹哪啶酸与草酰氯反应，得到式II所示化合物；

(ii)在第二有机溶剂存在下，使式II所示化合物与2-氨基苯并咪唑反应，得到式I所示化合物。

本发明的第三方面是提供该双靶点荧光探针在细胞成像中的应用。

本发明的效果表现在：

(1)QLBM对Cu²⁺和Fe³⁺的识别具有高灵敏度和高选择性。

(2)该探针的反应体系为纯水相。

(3)首次提出利用抗坏血酸对Cu²⁺和Fe³⁺进行区分。

(4)利用质谱、DFT分析了其作用机制，并将其作为Cu²⁺和Fe³⁺双靶点探针应用于细胞成像。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为本发明双靶点荧光探针的氢谱。

图2为本发明双靶点荧光探针的碳谱。

图3为本发明双靶点荧光探针的紫外吸收谱图。

图4(a)示出了将200μM的不同金属离子加入QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液后的荧光发射谱图；图4(b)示出了将200μM的不同金属离子加入QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液后紫外光下的颜色图。图4(c)和图4(d)分别示出了QLBM(20μM)在Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中与Cu²⁺(200μM)，Fe³⁺(200μM)和其他金属离子(500μM)的荧光发射谱图。黑条代表其他竞争金属离子。红条代表在加入竞争金属离子后加入Cu²⁺(200μM)和Fe³⁺(200μM)。

图5(a)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH>2+的荧光发射谱图。图5(b)示出了在QLBM(20μM)在Tris-HCl(50mM，pH>2+在508nm处的荧光值与Cu²⁺滴加浓度的滴定曲线。内部曲线为QLBM荧光值与Cu²⁺离子浓度的线性区间曲线。图5(c)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH>3+的荧光发射谱图。图5(d)示出了在QLBM(20μM)在Tris-HCl(50mM，pH>3+在508nm处的荧光值与Fe³⁺滴加浓度的滴定曲线。内部曲线为QLBM荧光值与Fe³⁺离子浓度的线性区间曲线。

图6(a)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入Fe³⁺(200μM)离子后，又加入抗坏血酸(500μM)后的荧光发射谱图变化。图6(b)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH>2+(200μM)离子后，又加入抗坏血酸(500μM)后的荧光发射谱图变化。图6(c)示出了在包含Cu²⁺(200μM)和Fe³⁺(200μM)的QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入抗坏血酸(500μM)后最大发射波长处(508nm)时间梯度的荧光值变化。图6(d)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH>2+(200μM)和Fe³⁺(200μM)后加入抗坏血酸(500μM)紫外灯照射下的颜色变化。

图7示出了QLBM-CuCl₂与2当量QLBM-FeCl₃的质谱结果。

图8(a)、图8(b)、图8(c)分别示出了DFT计算分析的QLBM、QLBM-Cu²⁺和QLBM-Fe³⁺的最优化结构。

图9示出了不同浓度QLBM的细胞毒性。

图10(a)为HeLa细胞与20μM QLBM共孵育6h后的共聚焦显微镜成像。图10(b)为HeLa细胞与20μM QLBM共孵育6h后，加入200μM>2+孵育30min的共聚焦显微镜成像。图10(c)为HeLa细胞与20μM>3+孵育30min的共聚焦显微镜成像。标尺：50μm。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明。

本发明提供一种基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺双靶点荧光探针，该双靶点荧光探针具有式I所示的结构：

本发明提供上述双靶点荧光探针的制备方法，该方法包括：

(i)在第一有机溶剂存在下，使喹哪啶酸与草酰氯反应，得到式II所示化合物；

(ii)在第二有机溶剂存在下，使式II所示化合物与2-氨基苯并咪唑反应，得到式I所示化合物。

根据本发明，优选地，步骤(i)中，喹哪啶酸与草酰氯的摩尔比为1：5-20。

步骤(i)中的所述第一有机溶剂可以为本领域常规的非质子有机溶剂，优选为二氯甲烷、甲苯和正己烷中的至少一种。进一步优选地，上述有机溶剂为干燥处理后的有机溶剂。

具体地，步骤(i)可包括：

将溶解在第一有机溶剂中的草酰氯滴加到喹哪啶酸溶液中，混合均匀后，在惰性气体存在下，蒸馏搅拌反应。

其中，所述喹哪啶酸溶液优选为喹哪啶酸溶解于第一有机溶剂中形成的溶液，喹哪啶酸溶液的浓度可以根据需要确定。

所述滴加优选在低温下进行，例如冰浴条件。

所述惰性气体例如可以为氮气。

步骤(i)还可以包括常规的后处理步骤，例如冷却、旋蒸溶剂等。

根据本发明，步骤(ii)中，式II所示化合物与2-氨基苯并咪唑的摩尔比优选为1：1-2。

步骤(ii)中的所述第二有机溶剂可以为本领域常规的非质子有机溶剂，优选为二氯甲烷、甲苯和正己烷中的至少一种。进一步优选地，上述有机溶剂为干燥处理后的有机溶剂。

优选地，步骤(ii)包括：向反应体系中加入缚酸剂。所述缚酸剂例如可以为三甲胺或三乙胺。

根据本发明，步骤(ii)的反应条件优选包括：温度为-4至5℃，时间为2-10h。

步骤(ii)还可以包括常规的后处理步骤，例如冷却、旋蒸溶剂、柱层析等。

本发明还提供上述的双靶点荧光探针在细胞成像中的应用。

根据本发明一种优选实施方式，通过两步反应设计合成了荧光探针QLBM，合成过程如下式所示：

合成方法：将喹哪啶酸溶于干燥的二氯甲烷中，然后将草酰氯溶解在干燥二氯甲烷中，在冰浴条件和磁力搅拌下，将草酰氯溶液滴加于喹哪啶酸溶液中，之后在氮气环境下蒸馏反应。随后，将反应液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得到粗产物喹哪啶酰氯(简称为C2)。然后将得到的产物C2与2-氨基苯并咪唑加入到干燥的二氯甲烷与三甲胺的混合溶液中，搅拌反应，旋蒸除去溶剂，并通过硅胶柱层析分离纯化，得到QLBM。

通过以下实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

将喹哪啶酸(C1，0.38g，2mM)溶于干燥的二氯甲烷(20mL)加入到100mL的两口瓶中，放入磁力转子。然后将草酰氯(2.60g，20mM)溶解在10mL的干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下滴加于喹哪啶酸溶液中，搅拌30分钟，之后在氮气环境下蒸馏搅拌5个小时。随后，将反应液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得到粗产物喹哪啶酰氯(简称为C2)。然后将得到的产物C2与2-氨基苯并咪唑(0.27g，2mM)加入到30mL干燥的二氯甲烷中与0.1mL的三甲胺的混合溶液中，0℃条件下搅拌反应5个小时，旋蒸除去溶剂，并通过硅胶柱层析分离纯化，得到QLBM黄色固体0.42g，产率为73％。

图1和图2分别为QLBM的氢谱及碳谱。

测试例1

1QLBM的光物理表征

1.1测试QLBM的吸收谱图。配置20μM的QLBM的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液，取2mL加入石英比色皿中，使用紫外-可见分光光度计测试其吸收谱图。

1.2测试QLBM的荧光发射谱图。配置20μM的QLBM溶液于50mM Tris-HCl(pH 7.2)，取1mL加入比色皿中，在荧光分光光度计上测试QLBM的荧光发射谱图。激发波长为370nm，发射区间为400-700nm。

测试例2

2QLBM对不同金属离子的选择性研究

2.1配置QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)的水溶液，向每个比色皿中加入1mL的溶液，每个比色皿中依次加入Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Fe²⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺盐溶液。加入后混合均匀，各皿中金属离子浓度为Na⁺(500μM)，K⁺(500μM)，Mg²⁺(500μM)，Zn²⁺(500μM)，Ca²⁺(500μM)，Fe²⁺(500μM)，Mn²⁺(500μM)，Hg²⁺(500μM)，Cd²⁺(500μM)，Co²⁺(500μM)，Al³⁺(500μM)，Pd²⁺(500μM)离子盐溶液。

2.2在荧光分光光度计上进行荧光强度的检测(激发波长为370nm)。

2.3采集并处理数据。

测试例3

3Cu²⁺和Fe³⁺对QLBM的滴定实验

3.1配置20μM QLBM溶液，溶剂为50mM Tris-HCl(pH 7.2)，取1mL加入比色皿中。

3.2配置10mM的CuCl₂和FeCl₃水溶液。

3.3向比色皿中分别滴加Cu²⁺，Cu²⁺的浓度范围为0～300μM，在荧光分光光度计上依次测试荧光发射谱图。

3.4同法，测试逐滴加入Fe³⁺的荧光发射谱图。

3.5采集并处理数据。

测试例4

4抗坏血酸对Cu²⁺和Fe³⁺的区分

4.1配置20μM QLBM溶液，溶剂为50mM Tris-HCl(pH 7.2)，取1mL分别加入两个比色皿中。

4.2分别加入200μM的Cu²⁺和Fe³⁺盐溶液，测试荧光发射谱图。

4.3继而分别加入500μM抗坏血酸溶液，混合均匀，记录1h内的荧光发射图谱，每10分钟测试一次。

4.4采集并处理数据。

测试例5

5QLBM与Cu²⁺和Fe³⁺的作用机制分析

5.1配置QLBM和两当量的CuCl₂和FeCl₃的溶液，进行质谱分析。

5.2质谱分析得到QLBM与Cu²⁺/Fe³⁺结合比例。

5.3在计算机上利用高斯09软件进行密度泛函理论(DFT)计算分析。

测试例6

6细胞培养方法

将HeLa细胞放置于37℃，二氧化碳含量为5％的培养箱中。培养基为含10％FBS的RPMI-1640。在细胞密度约为90％时使用胰酶细胞消化液进行传代，平均2天传代一次。

测试例7

7细胞毒性检测

收集对数期HeLa细胞，调整细胞溶液浓度至50000个/mL，在96孔板中每孔加入100μL。在5％CO₂，37℃的培养箱培养过夜后，加入不同浓度梯度的QLBM>

测试例8

8细胞成像

8.1QLBM与HeLa细胞作用成像实验。将HeLa细胞传代至直径为20mm的共聚焦玻底培养皿，在5％CO₂，37℃的培养箱培养24h后。将QLBM加入培养基中，QLBM的浓度为20μM，孵育6h后，移去培养液，用1×PBS清洗细胞六次。在共聚焦显微镜(Olympus>

8.2细胞内检测QLBM与Cu²⁺和Fe³⁺细胞成像实验。将HeLa细胞传代至直径为20mm的共聚焦玻底培养皿，在5％CO₂，37℃的培养箱培养24h后。将QLBM加入培养基中，QLBM的浓度为20μM，孵育6h后，加入200μM>2+和Fe³⁺共孵育30min后移去培养液，用1×PBS清洗细胞六次。在共聚焦显微镜(Olympus>

9数据与分析

9.1QLBM在Tris-HCl(50mM,pH 7.2)溶液体系中的紫外吸收和荧光发射谱图

如图3所示，QLBM拥有300～400nm的吸收范围。508nm处为其最大发射波长。

9.2QLBM在Tris-HCl(50mM,pH 7.2)溶液体系中的紫外吸收和荧光发射谱图

如图3所示，QLBM拥有300～400nm的吸收范围。508nm处为其最大发射波长。

9.3QLBM与不同金属离子的选择性研究

QLBM基于喹啉骨架设计而成，其杂环氮原子的喹啉衍生物可以作为金属离子的螯合位点，所以进行QLBM与不同金属离子之间的选择性研究，本发明共选取了14种常见金属离子(Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Fe²⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺)。

如图4(a)-4(d)所示，加入了不同的金属离子后，Cu²⁺和Fe³⁺对QLBM的荧光显示出了显著的淬灭，而对其他离子并没有明显的变化。与之对应，紫外灯照射下QLBM-Cu²⁺和QLBM-Fe³⁺的荧光有显著淬灭，而加入其他离子的QLBM溶液并未明显的颜色变化。在其他离子的QLBM溶液中继而分别加入Cu²⁺和Fe³⁺，其他离子的QLBM溶液荧光显示了明显的淬灭。以上结果说明QLBM对Cu²⁺和Fe³⁺有特异响应，且在其他离子存在的条件下，不会干扰QLBM对Cu²⁺和Fe³⁺的特异响应。

9.4Cu²⁺和Fe³⁺对QLBM的滴定实验

如图5(a)-5(d)所示，在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH>2+和Fe³⁺的滴加浓度不断增加，QLBM的最大发射波长(508nm)处的荧光值不断下降，当Cu²⁺和Fe³⁺的滴加浓度达到200μM时，QLBM的荧光值淬灭效率达到约90％。当Cu²⁺和Fe³⁺的滴加浓度在0～50μM时，QLBM的最大发射波长(508nm)和Cu²⁺/Fe³⁺的滴加浓度呈现较好的线性。通过LOD＝3*Sb/S计算其检测线，QLBM对Cu²⁺的检测限为1.35×10^-7M，对Fe³⁺的检测限为1.24×10^-7M。在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH>2+和Fe³⁺的滴加浓度不断增加，QLBM的最大发射波长(508nm)处的荧光值不断下降，当Cu²⁺和Fe³⁺的滴加浓度达到200μM时，QLBM的荧光值淬灭效率达到约90％。当Cu²⁺和Fe³⁺的滴加浓度在0～50μM时，QLBM的最大发射波长(508nm)和Cu²⁺/Fe³⁺的滴加浓度呈现较好的线性。通过LOD＝3*Sb/S计算其检测线，QLBM对Cu²⁺的检测限为1.35×10^-7M，对Fe³⁺的检测限为1.24×10^-7M。

9.5抗坏血酸(AA)对Cu²⁺和Fe³⁺的区分

如图6(a)-6(d)所示，Cu²⁺和Fe³⁺对QLBM均显示出较好的的淬灭效果(淬灭率～90％)，继而加入过量的抗坏血酸(500μM)后，QLBM-Fe³⁺溶液显示了明显的荧光回复，而QLBM-Cu²⁺的荧光并无显著变化。这主要是由于抗坏血酸具有较强的还原性，能够快速将Fe³⁺还原为Fe²⁺。根据图4结果显示，QLBM对Fe²⁺没有明显响应。而抗坏血酸对Cu²⁺的还原需要更严苛的条件，因而QLBM-Cu²⁺的荧光并无显著变化。紫外灯照射下的溶液颜色变化也与上述结果相一致。抗坏血酸与Fe³⁺的反应属于氧化还原反应，该反应需要一定的时间，又考察了抗坏血酸与Fe³⁺的作用时间，发现当达到1h后，荧光回复到最大值。

9.6QLBM与Cu²⁺和Fe³⁺的作用机制研究

图7(a)-7(b)的质谱结果显示，m/z＝289.1106(计算值＝289.1084)对应于[QLBM+H]⁺,m/z＝350.0238(计算值＝350.0218)对应于[QLBM+Cu²⁺+H]+，m/z＝385.9989(计算值＝385.9990)对应于[QLBM+Cu²⁺+Cl^-]⁺，m/z＝378.0009(计算值＝378.0410)对应于[QLBM+Fe³⁺+Cl^-+OH^-]⁺，m/z＝396.0105(计算值＝396.0071)对应于[QLBM+Fe³⁺+2OH^-]⁺，m/z＝413.9745(计算值＝413.9732)对应于[QLBM+Fe³⁺+2Cl^-]⁺。结果显示QLBM与Cu²⁺及Fe³⁺的结合比例为1:1。

通过DFT计算分析，QLBM、QLBM与Cu²⁺及QLBM与Fe³⁺的结合位点如图8(a)、8(b)和图8(c)所示。Cu²⁺和QLBM结构上的N(1)，N(2)，Cl(3)，Cl(4)原子的距离分别为和Fe³⁺和QLBM结构上的N(1)，N(2)，Cl(3)，Cl(4)原子的距离分别为和图中结构为QLBM，QLBM-Cu²⁺复合物和QLBM-Fe³⁺复合物的最优化结构。

9.7细胞成像

9.7.1细胞毒性

通过MTT法研究QLBM的细胞毒性，如图9所示，当QLBM浓度达到20μM时孵育24h后，细胞存活率达90％以上。

9.7.2QLBM的细胞内成像

图10(a)-10(c)中的结果显示，当HeLa细胞共孵育后6h后进行共聚焦显微成像，HeLa细胞显示明亮的绿色荧光。孵育6h后，分别加入200μM>2+离子和200μM>3+离子后进行共聚焦显微成像，HeLa细胞与图10(a)相比荧光呈现明显的淬灭。结果显示QLBM能够用作细胞内成像检测Cu²⁺和Fe³⁺。