一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒及其应用，属于PCR检测试剂盒技术领域。该试剂盒包括以产气荚膜梭菌的α毒素基因为模板设计的引物PrimerF1和PrimerR1，以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)和B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA为模板设计的引物PrimerF2、PrimerR2和PrimerR3。该试剂盒操作方便、省时省力、成本低、特异性高。

说明书

技术领域

本发明属于PCR检测试剂盒技术领域，具体涉及一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌可引起牛羊痢疾和坏死性肠炎，并可导致动物死亡。这些细菌有时单独感染，有时混合感染，并且在临床上很难鉴别诊断，对及时预防和治疗带来很大的困难。目前对这三种细菌病的诊断方法主要是：分离培养、显微镜观察和PCR检测，但是目前的PCR方法一次只能检测一种细菌，并且没有商品化的试剂盒，费时费力。

如定量检测产气荚膜梭菌的方法，其包括以下步骤：(1)获得患者分泌物并提取其中细菌的基因组DNA；(2)以产气荚膜梭菌α毒素基因为靶基因设计引物和探针，对步骤(1)中获得的DNA 进行荧光定量PCR扩增；(3)制作CT值与所述产气荚膜梭菌的浓度之间的标准曲线，根据步骤(2)的扩增结果，对患者分泌物中的产气荚膜梭菌进行定量。该方法具有高度的特异性、灵敏性和定量准确度，可以检出细菌或病毒 的存在，全部检测过程在2-3小时内可以完成；最低可检出约10个细菌，定量误差小于5％，特异性和试剂稳定性等指标符合有关国家标准。但是该方法只能检测患者分泌物中的产气荚膜梭菌，无法同时检测溶血梭菌和B型诺维氏梭菌，且该方法成本高，需要昂贵的仪器和专业的技术人员才能完成检测。

如一种产气荚膜梭菌检测试剂盒，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒包括以产气荚膜梭菌的16S rDNA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。该产气荚膜梭菌检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。但是该试剂盒只能检测产气荚膜梭菌一种细菌，不能同时检测溶血梭菌和B型诺维氏梭菌；而且该方法容易产生气溶胶，造成实验室基因污染，造成假阳性，从而无法判定样品的阴阳性，操作方法繁琐，试剂昂贵，不适合推广应用。

目前还未见有在同一样品中同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的相关报道，也没有商品化的试剂盒。因此对能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒的研究已成为本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒及其应用，该试剂盒操作方便、省时省力、成本低、特异性高。

本发明采用如下技术方案：

能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒，包括以产气荚膜梭菌的α毒素基因为模板设计的引物PrimerF1和PrimerR1，以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)和B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA为模板设计的引物PrimerF2、PrimerR2和PrimerR3，其中所述引物的序列为：PrimerF1：SEQ ID NO.1，PrimerR1：SEQ IDNO.2，PrimerF2：SEQ ID NO.3，PrimerR2：SEQ ID NO.4，PrimerR3：SEQ ID NO.5。

更进一步地，所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用，包括如下步骤：

步骤一，引物设计：以产气荚膜梭菌α毒素基因为模板，设计引物PrimerF1和PrimerR1；分别以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)，B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA为模板设计引物PrimerF2、PrimerR2、PrimerR3；

步骤二、试剂盒组装：将步骤一设计好的5条引物，分别用灭菌水稀释成10µM，分别标记为F1、F2、F3、F4和F5；将DNA聚合酶预混液标记为试剂T；将DNA分子质量标准DL2000标记为试剂M；将灭菌水标记为试剂W，阳性对照为产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌DNA混合物，标记为P；阴性对照为灭菌水标记为N；将以上试剂全部组装入一个纸盒中，组装好后置于冰箱储存；

步骤三，样品处理：将动物组织样品或肠内容物经研磨或厌氧肉汤培养；

步骤四，样品DNA提取：用细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取；

步骤五，PCR扩增：用设计的5条引物进行PCR扩增，同时设立阴阳性对照，PCR反应体系：12.5µL DNA聚合酶预混液，10µM的5条引物各1µL，模板DNA3µL，加灭菌水至25µL；反应条件为：95℃ 4 min；95℃ 50s，58℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；之后72℃ 7 min；

步骤六，电泳分析：将PCR扩增产物进行电泳：取6 μL PCR扩增产物在质量百分比为1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，观察结果；

步骤七，结果判定：若扩增产物中存在大小为397 bp的条带则表明样品中存在产气荚膜梭菌；若扩增产物中存在大小为427 bp的条带，则表明样品中存在B型诺维氏梭菌；若扩增产物中有大小为694 bp的条带则表明样品中存在溶血梭菌。

更进一步地，所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用，其中步骤二中所述DNA聚合酶预混液为500µL，所述灭菌水为500µL，所述产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌DNA混合物为100µL；置于冰箱的储存温度为-20℃。

更进一步地，所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用，其中步骤三中样品处理具体为：将动物组织样品或肠内容物经研磨或厌氧肉汤培养12小时。

更进一步地，所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用，其中步骤六中所述琼脂糖凝胶含0.50 μg 的溴化乙锭。

更进一步地，所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用，其中步骤六中所述电泳的条件为以80V电压电泳20min。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

第一，采用本试剂盒可同时对产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌进行检测，同时具有良好的特异性和敏感性；

第二，特异性方面：用本试剂盒检测肉毒梭菌、衣原体、支原体、大肠杆菌、巴氏杆菌和葡萄球菌的基因组扩增结果均为阴性；

第三，敏感性方面：以产气荚膜梭菌为例进行PCR检测，当样品中细菌量为1.2×10^{3>CFU/mL时即可检测出产气荚膜梭菌α毒素基因、溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)以及B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA。}

附图说明

图1为用本发明试剂盒中5条引物进行PCR扩增后扩增产物电泳后的示意图，其中，M、DNA分子质量标准；1，2为样品检测结果；3、阳性对照；4、阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

本试剂盒包含用于检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌的5条引物、PCR扩增预混酶、灭菌水、以及产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌检测的阳性对照和阴性对照DNA。通过DNA分子量标记测定扩增片段的大小，从而确定三种细菌的存在情况。

实施例

1、引物设计：从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/下载产气荚膜梭菌α毒素基因（登录号：L43548），以此基因为模板，采用Primer5.0软件设计一对引物：PrimerF1：5´-GCTAATGTTACTGCCGTTGA-3´，PrimerR1：5´-CCTCTGATACATCGTGTAAG-3´。

依据溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)（基因登录号：AB058931，AB058939），B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA（基因登录号：AB058938）设计3条引物：PrimerF2：5´-AGAATAAACAGAGCTGGAGATG-3´；PrimerR2：5´-TTATGCTAACTTTAGCTG CGTC-3´；PrimerR3：5´- CTGCTGTACCTTCTATGAACC-3´。

2、试剂盒组装：采用引物设计软件（Primer 5.0）设计所需的5条引物，之后送生物公司化学合成，将合成的5条引物分别用灭菌水稀释成10µM，标记为F1、F2、F3、F4和F5；购买商品化的GoTaq DNA聚合酶预混液1支（500µL），标记为试剂T；购买商品化的DNA分子量标记DL2000，标记为试剂M；灭菌水500µL，标记为试剂W，阳性对照（产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌DNA混合物）100µL，标记为P；阴性对照（灭菌水）标记为N；以上试剂全部组装入一个纸盒中，组装好后置于-20℃冰箱储存，可置于冰盒中运输。

3、样品处理：动物组织样品或肠内容物经研磨或厌氧肉汤培养12小时后可直接用于细菌DNA提取。

4、样品DNA提取：采用商品化的细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取。

5、PCR扩增：用设计的5条引物进行PCR扩增，同时设立阴阳性对照。

PCR反应体系：12.5µL GoTaq DNA聚合酶预混液，5条引物各1µL（10µmol/L），模板DNA3µL，加灭菌水至25µL；反应条件为：95℃ 4 min；95℃ 50s，58℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；之后72℃ 7 min。

6.、电泳分析：将PCR扩增产物进行电泳：取6 μL PCR扩增产物在1.5%质量百分比的琼脂糖凝胶（含0.50 μg 的溴化乙锭）中以80V的电压电泳20min,观察结果并拍照。

7、结果判定：若扩增产物中存在大小为397 bp的条带则表明样品中存在产气荚膜梭菌；若扩增产物中存在大小为427 bp的条带，则表明样品中存在B型诺维氏梭菌；若扩增产物中有大小为694 bp的条带则表明样品中存在溶血梭菌。PCR扩增产物电泳后的图片如图1所示，由图1可见在同一块琼脂糖凝胶上电泳后，当DNA分子质量标准、阴阳性对照同时成立时，被检样品1和2电泳道扩增反应出现三条带，大小分别为397bp、427bp和694bp，判定为产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌阳性（+）。

作为本申请的延伸可以用产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的其它基因设计引物，模仿本试剂盒的组分，组建类似的检测试剂盒。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQ ID NO.1 GCTAATGTTACTGCCGTTGA

SEQ ID NO.2 CCTCTGATACATCGTGTAAG

SEQ ID NO.3 CCTCTGATACATCGTGTAAG

SEQ ID NO.4 TTATGCTAACTTTAGCTGCGTC

SEQ ID NO.5 CTGCTGTACCTTCTATGAACC