大豆威廉姆斯82中NAC膜结合转录因子基因GmNTL1及其应用

摘要

本发明公开了一种大豆威廉姆斯82中的NAC膜结合转录因子基因GmNTL1及含所述基因GmNTL1的植物表达载体。本发明还公开了所述基因GmNTL1在拟南芥和大豆植株中提高其盐胁迫耐受性的应用。实验证明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的耐盐能力得到了很大程度的提高，此为提高作物耐盐性提供了理论依据和实践基础，预示本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐的植物品种。

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆(Glycine max(L.)Merr)威廉姆斯82(Williams 82)中NAC膜结合转录因子基因——GmNTL1及其应用。

背景技术

植物暴露在自然环境当中，经常受到各种环境胁迫的影响，比如干旱、极端的温度、养分缺乏和病虫害等。这些环境胁迫不仅制约了植物的生长发育，同时也导致了粮食作物的减产。高等植物自身生长发育和对环境变化的响应是通过调控目的基因的表达来实现。而转录因子和基因顺式作用元件的相互作用，可以作为基因表达调控的分子开关。正是转录因子与抗逆功能基因启动子区域顺式作用元件的相互作用激活了抗逆相关基因的表达，提高了植物的综合抗逆性。有一类特殊的转录因子，因其含有一段跨膜区被称为膜结合转录因子(Membrane-bound transcription factors,MTFs)。膜结合转录因子直接整合在细胞内的膜结构上(如细胞质膜，内质网膜、核膜等)，处于休眠状态，当受到外界环境变化刺激后，膜结合转录因子便从膜上释放，转变为激活状态，并转运到细胞核内行使功能。

MTFs在酵母、原核生物和动植物中均已被发现，并证实其可通过激活目的基因的表达来行使多种功能。值得注意的是，大部分的植物膜结合转录因子在调节植物对环境胁迫响应上发挥着重要的作用。NAC转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族，继2006年Kim等首次在拟南芥中发现NAC转录因子家族存在MTFs类型，并命名为NTM1(NAC WITH TRANSMEMBRANE MOTIF 1)以来，目前在植物中，已有9个NAC膜结合转录因子的功能已被发掘和报道。如表1：

表1植物膜NAC结合转录因子的功能

自从植物膜结合转录因子首次发现至今，人们对膜结合转录因子的研究已经取得了重大进展，涉及到植物生长发育、激素信号响应等多个方面。尤其值得关注的是，膜结合转录因子对植物的抗病性、抗寒性、抗旱性和耐盐性等逆境适应均具有十分重要的调控作用。但目前对其信号传导和调控机制的研究尚缺乏突破性的研究成果，并且多集中在模式植物拟南芥中。经检索，目前还未见大豆NAC膜结合转录因子及其相关功能的报道。

发明内容

针对目前的技术状况，本发明的目的是提供一种大豆(Glycine max(L.)Merr)威廉姆斯82(Williams 82)中NAC膜结合转录因子基因——GmNTL1及其应用。

本发明所述的大豆威廉姆斯82中NAC膜结合转录因子基因，其特征在于：所述基因命名为大豆威廉姆斯82NAC膜结合转录因子基因GmNTL1，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述大豆威廉姆斯82中NAC膜结合转录因子基因的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为表达载体pK2GW7::GmNTL1，该表达载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

或者，本发明还提供了一种含有上述大豆威廉姆斯82中NAC膜结合转录因子基因的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为表达载体pB2GW7::GmNTL1，该表达载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明所述的大豆威廉姆斯82中NAC膜结合转录因子基因在提高植株盐胁迫耐受性中的应用。

其中：所述植株优选是大豆或拟南芥。进一步的，所述拟南芥是Col-0野生型，大豆品种是鲁豆11。

本发明中，申请人从大豆Williams 82中分离得到NAC膜结合转录因子基因—GmNTL1，将该基因转到模式植物拟南芥中证明其功能，然后将该基因再转到原植株大豆中，结果得到了耐盐性提高的转基因植株。

具体的，大豆威廉姆斯82NAC膜结合转录因子基因GmNTL1在拟南芥或大豆植株中表达GmNTL1应用的例证。

申请人首先在Williams 82植株中克隆到了NAC膜结合转录因子基因GmNTL1；利过Gateway系统将GmNTL1基因通过BP反应连接到pDONR221载体上(见图1)，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmNTL1连接到表达载体pK2GW7(见图2)或pB2GW7(见图3)上，并在大肠杆菌DH5α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株GV3101中。将转化农杆菌菌株转入拟南芥和大豆中，验证表达了基因GmNTL1的功能。

本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了Williams82NAC膜结合转录因子基因并在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的高盐胁迫耐受性的能力。同时通过大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法将该基因转入大豆中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的耐盐性有很大提高。充分证明了本发明所述的大豆威廉姆斯82NAC膜结合转录因子基因GmNTL1在提高植株盐胁迫耐受性中具有重要的作用，预示本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐的植物品种。

附图说明

图1为入门载体pDONR221图谱。

图2为植物表达载体pK2GW7图谱。

图3为植物表达载体pB2GW7图谱。

图4为Williams 82NAC转录因子基因GmNTL1的CDS全长克隆电泳图，

其中：M为Marker，泳道1、2、3、4为基因的CDS全长克隆。

图5为35S::GmNTL1转基因的拟南芥纯系筛选。

图6为Williams 82NAC转录因子基因GmNTL1在转基因拟南芥中RT-PCR表达分析。

图7为35S::GmNTL1转基因拟南芥植株在0、50、100、150、200mmol/L NaCl条件下的抗盐性分析；

其中：A：0mM NaCl条件下；B：50mM NaCl条件下；C：100mM NaCl条件下；D：150mM NaCl条件下；E：200mM NaCl条件下。

图8为35S::GmNTL1转基因大豆再生植株，其中：A：T0代转基因植株；B：T1代转基因植株；C：T2代转基因植株。

图9为Williams 82NAC膜结合转录因子基因GmNTL1转鲁豆11的PCR检测图，

其中：上图为35S-F/R引物进行PCR扩增的结果，下图为35S-F+GmNTL1-R引物进行PCR扩增的结果；

泳道M为Marker，泳道阳性对照为阳性质粒对照；泳道阴性对照为阴性植株对照；上图中：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9均为转GmNTL1转基因阳性植株。下图中：泳道1、2、3、4、5、6、8为转GmNTL1转基因阳性植株。

图10为Williams 82NAC膜结合转录因子基因GmNTL1转鲁豆11的Southern blot分析图，

其中：泳道M为Marker，泳道“+”为阳性质粒对照；泳道“-”为阴性植株对照；泳道“1、2、3、4”均为GmNTL1转基因阳性植株。

图11为35S::GmNTL1转基因大豆植株的耐盐性分析，WT为阴性植株对照，1、2为转基因阳性植株。

其中：左图为0mM NaCl处理下的表型，右图为150mM NaCl处理下的表型。

具体实施方式

实施例1、GmNTL1的克隆

1.1Williams 82总RNA的提取

(1)将Williams 82植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于-80℃超低温冰箱保存备用)；

(2)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，8,000rpm，离心5min；

(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。

1.2RNA的反转录

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：

(2)轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向离心管中依次加入下列物质

(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。

1.3GmNTL1基因克隆

GmNTL1OX-F：5’-AAAAAGCAGGCTCGATGGGTGCCGTCGTC-3’

GmNTL1OX-R：5’-AGAAAGCTGGGTTTTAAGATCTGACATATGCCCA-3’

(1)高保真酶Primer Star进行Gateway系统的第一步扩增的反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)

1)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管并称凝胶重量，加入3倍体积的溶胶液，60℃溶胶10min，溶胶期间不断的翻转；

2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；

3)室温，12000rpm，离心30Sec，弃溶液；

4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

6)空柱，12000rpm，离心2min；

7)回收柱开盖晾干1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水或者EB缓冲液，放置2min；

8)12000rpm离心1min，所得溶液即为回收片段。

(3)高保真酶Primer Star进行Gateway系统的第二步扩增。

attb引物序列：

attb-F：5’-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3’

attb-R：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3’

反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，见图4。

1.4克隆基因片段的BP反应

BP反应(Gateway系统)体系如下：

25℃反应8小时-过夜。

1.5大肠杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取DH5α菌种接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；

(2)按1:100接种于50ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养1小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)将菌液放置在冰上30min；

(4)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入10ml预冷的0.1M的CaCl₂悬浮菌体；

(5)将菌液放置在冰上10min；

(6)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入2ml预冷的0.1M的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积30％甘油经液氮速冻后-80℃保存备用。

1.6大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将1-5μl质粒DNA或者连接产物加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)42℃，温水浴热激90sec，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml LB培养基，37℃培养40-50min；

(4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。

1.7大肠杆菌PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8DNA测序

挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Kan(25mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

经过序列分析，上述cDNA序列与大豆Willms82的核苷酸同源100％，三次实验证明得到的就是Willms82NAC膜结合转录因子基因，命名为GmNTL1，所述基因GmNTL1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

1.9大肠杆菌质粒DNA的提取

(1)挑取单克隆接种于10ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养8h；

(2)室温，12,000rpm，离心1min，收集菌体；

(3)弃上清，加入100μl低温预冷的溶液I，振荡悬浮菌体；

(4)加200μl新鲜配制的溶液II，快迅翻转混匀，冰浴5min；

(5)溶液澄清后加入150μl低温预冷的溶液III，轻轻混匀后冰浴5min；

(6)4℃，12000rpm，离心10min，吸取上清至新的1.5ml离心管中；

(7)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，振荡混匀；

(8)室温，12,000rpm，离心10min，转移上层水相于另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，再抽提一次，振荡混匀；

(9)室温，12,000rpm，离心10min，转移上层水相于另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀并于-20℃放置30min；

(10)室温，12,000rpm，离心10min，弃上清保留沉淀。

(11)用75％乙醇洗涤沉淀两次，真空干燥5min，溶于40μl灭菌水，放至-20℃保存备用。1.10克隆基因片段的LR反应

LR反应(Gateway系统)体系如下：

25℃反应8小时。

1.11大肠杆菌感受态的制备和质粒转化(同1.5、1.6)

1.12大肠杆菌PCR验证(同1.7)

1.13大肠杆菌质粒DNA的提取(同1.9)

验证转入pK2GW7载体的阳性pK2GW7::GmNTL1质粒的克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

验证转入pB2GW7载体的阳性pB2GW7::GmNTL1质粒的克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

1.14农杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取农杆菌GV3101菌种接种于10ml YEP液体培养基中，28℃摇床培养过夜；

(2)按1：50接种于50ml YEP液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)4℃，4,200rpm，离心10min，收集菌体；

(4)弃上清，加入10ml预冷的0.15mol/L的NaCl悬浮菌体；

(5)重复步骤3；

(6)弃上清，加入2ml预冷的20mmol/L的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积7％DMSO经液氮速冻后-80℃保存备用。

1.15农杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将10μl质粒DNA加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)液氮速冻1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml YEP培养基，28℃培养2-4h；

(4)室温，4,000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的YEP培养平板上，28℃倒置培养48h。

1.16转化农杆菌的PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2、在拟南芥中表达Williams 82NAC膜结合转录因子基因GmNTL1的功能验证

2.1花侵染法转化拟南芥

(1)拟南芥(Col-0野生型)生长至抽苔1cm时，将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；

(2)在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌GV3101加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀约为1.0-1.2；

(3)室温，4,200rpm,离心10min，收集菌体，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重悬菌体，使OD₆₀₀约为0.8；

(4)用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染，待所有花序都被侵染后，将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

(5)用保鲜袋覆盖花序，至于20-22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。

2.2拟南芥种子的表面消毒

将适量待灭菌的拟南芥中子放入1.5ml离心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％体积比的TritonX-100)震荡消毒1min，再用70％的乙醇震荡消毒1min(两次)，最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入培养基中。

2.3转基因植株的筛选

对收获的T0代种子进行表面消毒，然后后均匀涂布于1/2MS平板上(含相应的抗生素Baste)。春化处理3d后移入人工气候室生长。萌发约10天，子叶深绿色的植株为转基因植株，而子叶发浅绿甚至黄化的植株为非转基因植株。将转基因植株转入土中生长直至收获得到T1代转基因种子，T1代植株单株收种子，每株收取的种子继续筛选，将后代分离比为3∶1(阳性∶阴性)的阳性植株移栽后生长至收获T2代转基因种子，单株收种后，每株收取的种子经筛选可以得到纯系T2代转基因种子，见图5。

2.4植物RNA的提取

(1)将植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于-80℃超低温冰箱保存备用)；

(2)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，8,000rpm，离心5min；

(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。

2.5RNA的反转录

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：

(2)轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向离心管中依次加入下列物质

(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。

2.6转基因植株的RealTime-PCR检测

PCR法筛选转基因阳性植株：将具有抗性的植株的cDNA用GmNTL1基因RT-PCR引物进行PCR检测。

GmNTL1基因RT-PCR引物序列：

GmNTL1RT-F：5’-GCCGTTAGGGTTCCGTTTC-3’

GmNTL1RT-R：5’-AAGGCTCCCATTTGCAGACA-3’

普通Taq酶进行RealTime-PCR扩增的反应如下(15μl体系)：

扩增条件如下：

注：内标基因选用GmTUB。

结果见图6。

2.7甘露醇和NaCl处理拟南芥

(1)拟南芥种子的表面消毒(同2.2)。

(2)甘露醇和NaCl处理

将灭了菌的Col-0、GmNTL1-1、Gm NTL1-2种子分别均匀涂布于1/2MS平板上(含相应的抗生素Baste)。春化处理3天后移入人工气候室生长。萌发约4d，根长至1cm左右，将拟南芥小苗移至添加不同浓度的甘露醇(250、300、350、400mmol/L)或NaCl(50、100、150、200mmol/L)的1/2MS培养基平板上。待小苗长至11d，观察小苗生长状况。

结果见图7。

实施例3、在大豆中表达Williams 82NAC转录因子基因GmNTL1的功能验证

3.1大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化法转化大豆

(1)种子消毒及预培养处理

将大豆种子用70％乙醇消毒5min，去净乙醇后用0.1％HgCl₂消毒10min，无菌水冲洗5-6遍，在25℃-28℃下无菌水浸种12h。

将浸种后胚膨大萌动的大豆放入预培养培养基，28℃、光培养1d，其中所述预培养培养基配方为：MS+3.0mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

(2)种子胚膨大萌动后经切割，暴露或损伤萌动胚部位

当预培养的大豆胚整体膨大、胚根长至0.5±0.1mm，未突破种皮时，剥去种皮，切去胚根，保留胚芽、胚轴及1/2的子叶，同时用解剖针在胚芽尖处刺针，使针眼布满胚芽尖。

(3)真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚

将4℃保存的带有植物表达载体的农杆菌在添加了50mg/L利福平的YEP固体培养基上划线，28℃黑暗培养3天后挑取单菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液体培养基，黑暗下28℃、200r/min振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16h。将菌液置于灭菌的离心管中，5,000rpm离心5分钟收集菌体，用侵染液重悬菌体，调整至OD₆₀₀值为0.6，加入30mg/L乙酰丁香酮备用。其中所述侵染液配方为：0.1MS大量+0.1MS微量+B5维生素+0.5MES+1％葡萄糖+2％蔗糖，pH5.4。

将步骤(2)的大豆浸入农杆菌菌液中，抽真空并维持0.05MPa压力5-8min，黑暗下28℃、200r/min振荡培养，侵染15-20min。

(4)共培养

将步骤(3)的大豆取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下置于共培养培养基上，25℃-28℃下暗培养4天。其中所述共培养培养基配方为：MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

(5)丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选

将共培养后的大豆用无菌水清洗4次，再用无菌滤纸吸干，转接至丛生芽诱导培养基上，在25℃、且每日光照14h条件下，每两周换至新的培养基，连续培养20±2d，分化出丛生芽。其中所述丛生芽诱导筛选培养基配方为：MS+3.0mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.2mg/L IAA(吲哚乙酸)+0.125μL/mL Baste+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

选筛选后长至1-2cm的丛生芽，将小芽单独剪下，转移到生根筛选培养基上，在25℃、且每日光照14±1h条件下，连续培养14d。其中所述生根筛选培养基配方为：MS+0.4mg/L IBA(乙哚丁酸)+0.125μL/mL Baste+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

(6)小苗壮苗及移栽

选根系生长良好的小苗转移到壮苗培养基上，在25℃且每日光照14小时条件下，培养7-10d。当小苗经筛选存活、且根系生长良好后，将其不伤及根部取出，除去残存培养基移入土壤，用薄膜覆盖花盆以提高湿度。其中所述壮苗培养基配方为：MS+2.0mg/L KT(激动素)+0.4mg/L NAA(α-萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，见图8。

3.2CTAB法提取转基因植株基因组DNA

称取0.5g的再生植株叶片，剪碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl预热至65℃的2xCTAB提取缓冲液及0.1％的疏基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，然后置于65℃水浴保温2h，不时颠倒混匀。混合物冷却至室温后加入等体积的酚：氛仿：异戊醇(25∶24∶1)，4℃下10,000g离心10min。将水相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，4℃下10000g离心10min。将水相转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10,000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100ul TE液溶解，37℃水浴30min。加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10,000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40μl无菌水溶解DNA，4℃保存待用。

3.3PCR和Sothern blot检测转基因植株

3.3.1PCR法检测阳性转基因植株

抗性植株总DNA分别用35S启动子引物、GmNTL1基因引物和连有GmNTL1基因片段和植株表达载体片段的序列引物进行PCR检测。

35S片段启动子引物序列：

35S-F：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’

35S-R：5’-GACGATCTACCCGAGCAA-3’

GmNTL1基因引物序列：

Gm NTL1-F：5’-AAAAAGCAGGCTCGATGGGTGCCGTCGTC-3’

Gm NTL1-R：5’-AGAAAGCTGGGTTTTAAGATCTGACATATGCCCA-3’

35S启动子F+GmNTL1基因R引物序列：

35S-F：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’

Gm NTL1-R：5’-AGAAAGCTGGGTTTTAAGATCTGACATATGCCCA-3’

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，见图9。

3.3.2Sothern blot杂交验证

选取3株阳性植株(GmNTL1OX-1、GmNTL1OX-2、GmNTL1OX-3)进行Sothern blot杂交验证。步骤如下：

(1)CTAB法提取阳性植株，野生型植株DNA

(2)EcoRI酶切阳性植株和野生型植株DNA，电泳

(3)转膜

①碱变性：室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。变性液：0.5mol/L NaOH；1.5mol/L NaCl。

②中和：将凝胶转移到中和液15min。中和液：1mol/L Tris-HCl(pH 7.4)；1.5mol/L NaCl；

③转移：按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。进行转移。(转移过程一般需要8-24h，每隔数小时换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物)转移液(20×SSC)：NaCl 175.3g；柠檬酸三钠82.2g，NaOH调pH至7.0，加ddH2O至1,000ml。

④转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数分钟，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80℃烘2h，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。

(4)按照Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II说明书标记GmNTL1，并进行杂交及检测。

检测发现所选的GmNTL1转基因植株(GmNTL1OX-1、GmNTL1OX-2、GmNTL1OX-3)的基因组均整合了目的基因，见图10。

3.4转基因大豆植株的耐盐性分析

Tl代转基因大豆种子与对照种子经浸种催芽后，分别移栽到塑料钵(1/2Hogland液体培养基)中，在室温25℃条件下，使其生长2周后，长至两叶一心期用含有NaCl 50rnmol/L的1/2Hogland液体培养基浇灌，为避免盐冲击效应，浓度以每天递增25rnrnol/L的方式加盐，直至处理预定浓度250rnmol/L，对转基因植株与野生型植株表型进行观察。见图11。

1/2Hogland液体培养基配方：