同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程

摘要

本发明公开了同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程，它涉及医疗卫生技术领域；它的步骤如下：步骤一：高丰度蛋白去除；步骤二：变性；步骤三：还原；步骤四：烷基化；步骤五：终止烷基化；步骤六：胰酶消化；步骤七：固相萃取；步骤八：蒸干；步骤九：复溶；本发明重复性和复现性好，且覆盖面广，适用于同位素稀释质谱法检测血清中各种低丰度蛋白的前处理。

说明书

技术领域

本发明涉及医疗卫生技术领域，具体涉及一种同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程。

背景技术

同位素稀释质谱法特异性强、复现性好，因此是血清低丰度蛋白绝对定量的最佳方法，但是该方法的准确性显著依赖于蛋白的前处理优劣。现有的血清低丰度蛋白前处理流程较多，不同流程间差异较大，普遍存在重复性和复现性差的缺陷，严重影响了同位素稀释质谱法对血清低丰度蛋白的准确定量。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明的同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程，它的步骤如下：

步骤一：高丰度蛋白去除：将100μL血清按试剂说明书步骤用BlueAlbumin&IgG Depletion Kit去除绝大部分白蛋白和IgG，取180μL去除高丰度蛋白后的血清，并与70μL 25mM的碳酸氢铵溶液混合；

步骤二：变性：将上述混合样本首先在100℃水浴下热变性5min，再冰浴5min冷却，然后加入约96.1mg尿素进行化学变性，漩涡30s后静置5min，最后加入250μL 25mM碳酸氢铵溶液稀释；

步骤三：还原：加入50μL 100mM二硫苏糖醇，60℃水浴30min，使变性蛋白已打开的二硫键保持还原状态；

步骤四：烷基化：加入50μL 550mM碘乙酰胺，黑暗中室温下作用30min，使半胱氨酸上的巯基烷基化，防止二硫键的形成；

步骤五：终止烷基化：加入185μL 100mM二硫苏糖醇终止烷基化，且二硫苏糖醇与碘乙酰胺的摩尔比为1∶2，室温下作用30min，防止过量的碘乙酰胺烷基化非胱氨酸残基；

步骤六：胰酶消化：加入1mL 25mM碳酸氢铵溶液稀释尿素，使其终浓度小于1M，然后加入100μL 1mg/L同位素标记肽，再加入胰酶，且胰酶与底物的质量比为1∶20，37℃作用30min，使蛋白质水解成多肽，最后加入35μL 5％三氟乙酸终止消化；

步骤七：固相萃取：将酶解产物用Waters Sep-pak C18固相萃取柱纯化富集，首先用3mL甲醇和3mL超纯水分别活化和平衡柱子，然后加入酶解产物，再用2mL超纯水清洗柱子两次，最后用1mL 100％乙腈萃取；

步骤八：蒸干：将萃取产物用氮吹仪蒸干，氮气流速为8L/min，蒸干温度为45℃；

步骤九：复溶：将蒸干产物用400μL含0.1％甲酸的超纯水复溶。

本发明有益效果为：重复性和复现性好，且覆盖面广，适用于同位素稀释质谱法检测血清中各种低丰度蛋白的前处理。

具体实施方式

本具体实施方式采用如下技术方案：它的步骤如下：

步骤一：高丰度蛋白去除：将100μL血清按试剂说明书步骤用BlueAlbumin&IgG Depletion Kit(Sigma-Aldrich)去除绝大部分白蛋白和IgG，取180μL去除高丰度蛋白后的血清，并与70μL 25mM的碳酸氢铵(ABC)溶液混合；

步骤二：变性：将上述混合样本首先在100℃水浴下热变性5min，再冰浴5min冷却，然后加入约96.1mg尿素(终浓度8M)进行化学变性，漩涡30s后静置5min，最后加入250μL25mM ABC溶液稀释；

步骤三：还原：加入50μL 100mM二硫苏糖醇(DTT)(终浓度10mM)，60℃水浴30min，使变性蛋白已打开的二硫键保持还原状态；

步骤四：烷基化：加入50μL 550mM碘乙酰胺(IAM)(终浓度50mM)，黑暗中室温下作用30min，使半胱氨酸上的巯基(-SH)烷基化，防止二硫键的形成；

步骤五：终止烷基化：加入185μL 100mM DTT终止烷基化(DTT/IAM(mol/mol)＝1∶2)，室温下作用30min，防止过量的IAM烷基化非胱氨酸残基；

步骤六：胰酶消化：加入1mL 25mM ABC溶液稀释尿素，使其终浓度小于1M，然后加入100μL 1mg/L同位素标记肽，再加入胰酶(胰酶/底物(w/w)＝1∶20)37℃作用30min，使蛋白质水解成多肽，最后加入35μL 5％三氟乙酸(TFA)终止消化；

步骤七：固相萃取：将酶解产物用Waters Sep-pak C18固相萃取柱纯化富集，首先用3mL甲醇和3mL超纯水分别活化和平衡柱子，然后加入酶解产物，再用2mL超纯水清洗柱子两次，最后用1mL 100％乙腈(ACN)萃取；

步骤八：蒸干：将萃取产物用氮吹仪蒸干，氮气流速为8L/min，蒸干温度为45℃；

步骤九：复溶：将蒸干产物用400μL含0.1％甲酸(FA)的超纯水复溶。

以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。