一种虾中磺胺类药物残留的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种虾中磺胺类药物残留的快速检测方法，采用甲醇提取虾肉中的磺胺类药物残留，通过磺胺类药物残留与特定的衍生化试剂快速衍生反应，形成稳定的紫红色衍生物，肉眼观察显色结果从实现快速检测，检测灵敏度最低可达50µg/kg。本发明前处理简单，检测时间短，检测成本低，无需大型仪器，可现场检测，肉眼观察颜色变化即能快速得到检测结果，能够快速、高效检测虾中磺胺类药物残留。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水产品中磺胺类药物残留的检测方法，特别涉及一种虾中磺胺类药物残留的快速检测方法。

背景技术

磺胺类药物是以对氨基苯磺酰胺结构为主体的合成抗菌素的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。近年来，随着国内外对磺胺类药物残留的分析进行了多方面研究，出现了许多检测磺胺类药物的方法，包括高效液相色谱法（如CN101639466A）、液相色谱-质谱法、胶体金免疫层析法、免疫分析法和近红外光谱法等。但只注重于实验室传统检测，且存在样品前处理步骤复杂、耗费时间长、低通量、成本高的限制。然而，水产品中药物残留的快速检测技术十分匮乏，当前实验室传统的检测方式很难实现快速、高效的检测效果，越来越不适应食品的生产、流通和销售特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虾中磺胺类药物残留的快速检测方法，前处理简单，检测时间短，检测成本低，无需大型仪器，可现场检测，肉眼观察颜色变化即能快速得到检测结果，能够快速、高效检测虾中磺胺类药物残留。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种虾中磺胺类药物残留的快速检测方法，包括如下步骤：

（1）样品前处理：取新鲜对虾的虾肉，将虾肉研磨匀浆得虾肉浆，取虾肉浆5.0g，加入5.0g的无水硫酸钠和甲醇20mL，振摇2分钟后，静置分层或4000转/min离心5min，所得上清液作为样品处理液；

（2）检测：在5mL样品处理液中加入2mL衍生化试剂01，振摇5分钟后加入0.1mL衍生化试剂02，振摇1分钟，静置5分钟，观察衍生后的上层液体颜色，若上层液体显红色则表明样品中含有磺胺类药物，其含量在100μg/kg以上；若上层液体不显红色，则采用层析柱处理后二次检测。

发明人经过长期研究，开发了适合虾中磺胺类药物残留的特定快速检测方法。本发明的原理：采用柱前衍生，化学显色法。本发明采用甲醇提取虾肉中的磺胺类药物残留，通过磺胺类药物残留与特定的衍生化试剂快速衍生反应，形成稳定的紫红色衍生物，肉眼观察显色结果从实现快速检测，检测灵敏度最低可达50μg/kg。该方法检测限满足欧盟及我国对磺胺类药物检测的需求，且能够实现虾中多种磺胺类药物的现场快速检测。

本发明在虾肉浆中同时加入无水硫酸钠和甲醇，甲醇用于提取虾肉中的磺胺类药物残留，无水硫酸钠能排除水分的干扰，同时，无水硫酸钠能使得虾肉组织分散的更均匀，利于甲醇更快速、高效的提取磺胺类药物残留。

样品处理液经本发明选择的衍生化试剂衍生后，磺胺类药物含量在100μg/kg以上的样品即能看到明显的显色反应，从而能快速得出检测结果。而为了进一步提高检测的精度，对磺胺类药物含量在100μg/kg之下的样品，样品处理液经本发明选择的衍生化试剂衍生后，其基本不显色或肉眼难以观察到显色，本发明采用特定的层析柱处理对衍生后的上层液体浓缩，洗脱后再观察显色结果，对于磺胺类药物含量在50μg/kg以上，100μg/kg之下的样品，能看到明显的显色反应，进一步提高了本发明的检测精度，满足更高的检测需求。

作为优化方案，一种虾中磺胺类药物残留的快速检测方法，包括如下步骤：

（1）样品前处理：取新鲜对虾的虾肉，将虾肉研磨匀浆得虾肉浆，取虾肉浆5.0g，加入5.0g的无水硫酸钠和甲醇20mL，振摇2分钟后，静置分层或4000转/min离心5min，所得上清液作为样品处理液；

（2）检测：在5mL样品处理液中加入2mL衍生化试剂01，振摇5分钟后加入0.1mL衍生化试剂02，振摇1分钟，静置5分钟后直接采用层析柱处理后检测。层析柱处理后检测操作为：A、层析柱活化：依次加入2mL甲醇及5mL蒸馏水于层析柱中，控制流速为1-2滴/秒，弃去流出液；B、层析检测：将上层液体加入A步活化后的层析柱中，再加入2mL去离子水淋洗柱子，抽干；最后加0.8mL乙酸乙酯洗脱，观察洗脱液颜色，若洗脱液显紫红色，则表明样品中含有磺胺类物质，其含量在50μg/kg以上。

作为优选，层析柱处理后二次检测操作为：

A、层析柱活化：依次加入2mL甲醇及5mL蒸馏水于层析柱中，控制流速为1-2滴/秒，弃去流出液；

B、层析检测：将上层液体加入A步活化后的层析柱中，再加入2mL去离子水淋洗柱子，抽干；最后加0.8mL乙酸乙酯洗脱，观察洗脱液颜色，若洗脱液显红色，则表明样品中含有磺胺类物质，其含量在50μg/kg以上，100μg/kg之下。

作为优选，步骤（2）中上层液体显红色具体为上层液体显紫红色。

作为优选，步骤B中洗脱液显红色具体为洗脱液显紫红色。

作为优选，所述层析柱内装填HLB反相色谱填料和硅胶填料的混合物，HLB反相色谱填料与硅胶填料的质量比为4：1。本发明层析柱装填的填料有特定要求，要适合衍生后的上层液体才能起到明显的浓缩，提高检测效果的作用。HLB反相色谱填料对衍生物具有很强的萃取浓缩衍生物的能力，硅胶填料不仅具有很强的萃取浓缩衍生物的能力，并且还能抑制虾样中蛋白质的吸附力，降低蛋白质的干扰。二者结合使用，取得良好的浓缩作用。

作为优选，所述HLB反相色谱填料平均粒度：40-60μm，平均孔径：80Å。

作为优选，所述硅胶填料平均粒度：40-60μm，平均孔径：50Å。

作为优选，步骤（2）中加入2mL衍生化试剂01后调节体系pH值为12。

作为优选，所述衍生化试剂01具体成分为质量浓度5%的碳酸钠溶液。

作为优选，所述衍生化试剂02具体组成为：质量浓度5%的亚硝酸溶液、质量浓度5%的尿素水溶液与质量浓度0.1%的2-萘酚乙醇溶液按照1:1:2的体积比的混合物。

本发明的有益效果是：前处理简单，检测时间短，检测成本低，无需大型仪器，可现场检测，肉眼观察颜色变化即能快速得到检测结果，能够快速、高效检测虾中磺胺类药物残留。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

磺胺类药物标准品（市售）：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑；样品为新鲜对虾，购于舟山水产品批发市场。

衍生化试剂01、衍生化试剂02可市售，购自北京六角体科技发展有限公司的产品“组织样品磺胺类快速检测试剂盒” ，衍生化试剂01为试剂盒中的试剂A，衍生化试剂02为试剂盒中的试剂B、试剂C、试剂D按照1:1:2的体积比混合而成。

更优选的，衍生化试剂01、衍生化试剂02还可自己配制：所述衍生化试剂01具体成分为质量浓度5%的碳酸钠溶液，所述衍生化试剂02具体组成为：质量浓度5%的亚硝酸溶液、质量浓度5%的尿素水溶液与质量浓度0.1%的2-萘酚乙醇溶液按照1:1:2的体积比的混合物。

实施例：

1、磺胺类药物标准物质的检测

用甲醇将磺胺类药物标准品溶解并稀释到50μg/L、100μg/L的浓度。分别取1mL浓度为50μg/L、100μg/L 磺胺类药物标准溶液，加入4mL的甲醇和2mL衍生化试剂01，振摇5分钟后加入0.1mL衍生化试剂02，振摇1分钟，静置5分钟，观察上层液体颜色；每个做5个重复，同时做试剂空白试验。

2、样品检测

2.1取新鲜对虾的虾肉，将虾肉研磨匀浆得虾肉浆，取虾肉浆5.0g，加入5.0g的无水硫酸钠和甲醇20mL，振摇2分钟后，静置分层或4000转/min离心5min，所得上清液作为样品处理液。

2.2在5mL样品处理液中加入2mL衍生化试剂01，并调节pH=12，振摇5分钟后加入0.1mL衍生化试剂02，振摇1分钟，静置5分钟，观察上层液体颜色；初步判断：在5mL样品处理液中加入2mL衍生化试剂01，振摇5分钟后加入0.1mL衍生化试剂02，振摇1分钟，静置5分钟，观察衍生后的上层液体颜色，若上层液体显紫红色则表明样品中含有磺胺类药物，其含量在100μg/kg以上；若上层液体不显紫红色或显色不明显（肉眼难以辨别），则采用层析柱处理后二次检测。

层析柱处理后二次检测操作为：取层析柱一支依次加入2mL甲醇及5mL蒸馏水于层析柱中，控制流速为1-2滴/秒，弃去流出液；衍生后的上层液体加入活化后的层析柱中，再加入2mL去离子水淋洗柱子，抽干；最后加0.8mL乙酸乙酯洗脱，观察洗脱液颜色；结果判断：洗脱液边自然挥发边观察颜色：若显紫红色，则表明样品中含有磺胺类物质，其含量在50μg/kg以上，不显色或显色不明显（肉眼难以辨别）则表明样品中含有磺胺类物质含量低于50μg/kg，若要更精确检测，必须要用大型仪器如高效液相色谱等进一步检测。

层析柱内装填HLB反相色谱填料（市售，平均粒度：40-60μm，平均孔径：80Å）和硅胶填料（市售，Hisep^TM硅胶填料，平均粒度：40-60μm，平均孔径：50Å）的混合物，HLB反相色谱填料与硅胶填料的质量比为4：1，

3、样品前处理的条件优化

3.1 pH值对衍生化效果的影响

取100μg/kg磺胺类药物标准溶液1mL，加入4 mL的甲醇，再加入衍生化试剂01（调节pH值分别为6、8、10、12），依第1节步骤进行衍生化，直接观察不同pH值下的衍生化效果，从而选择最佳的衍生化pH值。结果表明，pH值为6时，无颜色变化；pH值≥8时，颜色有变化，且碱性越大，颜色越红，因此当pH值为12时，衍生效果最为理想。

3.2 层析柱的优选

将第二节衍生后的上层液体，分别经本发明的层析柱、硅胶柱（市售）、HLB柱（市售）、氧化铝柱（市售）、ENVI-18固相萃取小柱（市售）浓缩和净化，根据每个柱提供的处理方法，依次活化、平衡、上样、淋洗和洗脱，分别观察洗脱液的颜色变化。结果表明，层析柱、硅胶柱、HLB柱、氧化铝柱、ENVI-18都有保留，但是本发明的层析柱保留效率最好。

虾肉样品中磺胺类药物残留的检测

磺胺类药物标准物质衍生物呈明显的紫红色，且随着含量的增加颜色加深，空白对照则不显变色。当磺胺类药物标准物质浓度为50μg/L以上时，其衍生物在离心管内呈紫红色。将该衍生物进行层析柱浓缩和净化，在层析柱中的颜色更明显，洗脱后的颜色放置200min无明显变化。

添加精密度实验结果

对60份已知含量的空白样品进行磺胺类药物标准添加验证试验，标准物质添加含量分别为50μg/kg、100μg/kg，由不同操作人员按照第1节方法进行验证实验。当磺胺类药物残留添加浓度分别为50μg/kg、100μg/kg时，均可观察到明显的紫红显色，而阴性样品无出现颜色变化。

比对验证实验结果

依据GB/T 21316-2007方法采用液相色谱串联质谱仪和本发明的方法检测325份对虾盲样中的磺胺类药物残留，两者结果进行比对。液相色谱串联质谱法检测出含有磺胺类药物残留的样品有62个，总含量范围在2.0μg/kg-103.5μg/kg，总含量高于50μg/kg的样品有16个。本发明的方法快速检测325份样品，磺胺类药物残留含量在50.0μg/kg -103.5μg/kg之间的16个样品均有不同程度的显色反应，二者结果符合。

结论

本发明对虾样品采用甲醇提取，层析柱净化富集，在碱性条件下进行衍生化反应，衍生化产物在200min内保持相对稳定，检测在30min内完成，实现了磺胺类药物残留的快速筛查，方法快速、准确、实用，可有效筛选虾肉中磺胺类药物残留。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。