一种脱‑γ‑羧基凝血酶原的检测方法、检测试剂和检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种脱‑γ‑羧基凝血酶原的检测方法、所用试剂和检测试剂盒，本发明的检测方法包括以下步骤：步骤1，表面偶联抗DCP抗体的磁微粒A的制备，和表面偶联DCP抗原的磁微粒B的制备；步骤2，荧光标记的抗DCP抗体的制备；步骤3，DCP含量的检测：血浆或血清样品和磁微粒A反应，反应完毕将DCP洗脱，加入荧光标记的抗DCP抗体孵育，再加入磁微粒B继续孵育，然后磁性分离，用荧光分光光度计检测样品荧光值，计算样品中DCP含量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种医学检测方法，特别涉及一种DCP磁微粒免疫荧光检测方法、以及DCP磁微粒免疫荧光检测试剂和检测试剂盒。

背景技术

肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，其死亡率为我国恶性肿瘤的第2位，占全球肝癌死亡人数的53％(Bruix J,Llovet JM.Major achievements in hepatocellular carcinoma.Lancet.2009,373(9664):614-616)。HCC的发生主要与乙型肝炎病毒感染有关，其发展进程复杂，涉及多阶段、多因素，由肿瘤细胞及其周围的局部微环境共同作用(Altekruse SF,McGlynn KAJDickie LA,et al.Hepatocellular carcinoma confirmation,treatment,and survival in surveillance 5 epidemiology 9 and end results registries,1992-2008.Hepatology.2012,55(2):476-482)。临床结果显示，已检测出具有典型临床症状的患者往往已是肝癌晚期，因此早期诊断是治疗HCC的关键。临床诊断HCC最常用的血清肿瘤标志物为甲胎蛋白AFP，其检测敏感性仅为60％～70％，但约18％的肝癌AFP不升高。早期肝癌AFP的假阴性率更可高达40％，其原因可能是某些类型肝癌早期并不表达AFP或AFP含量与肿瘤体积大小有关。此外，在筛选有慢性病毒性肝炎背景下的肝癌时，AFP的特异性和敏感性相对较低，其假阴性和假阳性均可影响肝癌的正确诊断，而且AFP在一些良性肝病、部分生殖系统和胃肠道的恶性肿瘤患者的血清中也会升高，从而导致产生假阳性，影响临床诊断结果，存在一定的缺陷(Gupta S,Bent S,Kohlwes J.Test characteristics of alpha-fetoprotein for detecting hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C.A systematic review and critical analysis.Ann Intern Med,2003；139(1):46-50)(Spangenberg HC,Thimme R,Blum HE.Serum markers of hepatocellular carcinoma.Setnin Liver Dis.2006；26(4):385-390)。因此，寻找新的HCC早期诊断血清标志物一直是研究关注的热点。

DCP(Des-γ-carboxy prothrombin)即脱-γ-羧基凝血酶原，又可称为维生素K缺乏或拮抗剂II诱导的蛋白质PIVKA-II(Protein induced by vita min K absence-II)，也被称为人异常凝血酶原APT(Human abnormal prothrombin)，是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的产物。与正常凝血酶原相比，DCP的分子结构域中有一个或多个Glu残基没有被完全羧化成为Gla，从而失去凝血功能。正常凝血酶原(Prothrombin)是在肝细胞微粒体内主要依赖维生素K的γ-谷氨酰羧化酶(γ-glutamyl-carboxylase)及辅酶vitamin K-epoxide-reductase和vitamin K-reductase参与下，将结构Gla domam中的第6，7，14，16，19，20，25，26，29和32位的10个Glu残基(Glu residus)羧化为Gla，使之成为有活性的prothrombin。上述任何位点的一个或多个Glu残基羧化不全，都将可能形成DCP，失去prothrombin的凝血功能。作为HCC的肿瘤标记物，DCP已成为协助临床诊断和预后的重要辅助指标。其与多种肝细胞癌恶性增殖途径相关，尤其可能在HCC的发展、浸润与转移等方面促进肝癌细胞的恶性增殖。1984年Liebman等首次报道(Liebman HA,Furie BC,Tong MJ,et al.Des-gamma-carboxy(abnormal)prothrombin as a serum marker of primary hepatocellular carcinoma.N Engl J Med.1984；310:1427-1431)称DCP在91％的肝癌患者血清中水平升高。Sakon报道60例HCC中DCP的阳性率为58.4％，而AFP阴性HCC其阳性率仍为61.9％，提示其有助于AFP阴性HCC的诊断。DCP的阳性率还与肿瘤的生长有关，其阳性率在直径<3cm的HCC为19.1％，直径3～5cm的HCC为55.6％，直径>5cm的HCC为66.2％，慢性肝病或肝硬化为14.8％，因此可作为AFP阴性或低浓度AFP肝细胞癌的辅助诊断。DCP与肿瘤大小、肝内转移、门静脉侵犯(portal venous invasion，PVI)以及肿瘤组织增殖有关。Khan在对65例首次治疗采用无水酒精经皮注射单个HCC癌瘤结节直径≤6cm的患者作了分析后表明，DCP阳性(>20μg/L)患者1年和2年肝内复发率分别为22.5％、31.4％，而阴性者(<20μg/L)则分别为8％和17.8％。因此认为治疗前DCP的血浆水平可以作为早期HCC复发的预测指标，并有助于为患者选择适宜的治疗方法。Sakon和Naka认为DCP阳性者与DCP阴性者比较生存率降低，转移率及复发率增加，癌灶直径更大(Khan KN,Yatsuhashi H,Yamasaki K,et al.Prospective analysis of risk factor for early intrahepatic recurrence of hepatocellular carcinoma following ethanol injection.J Hepatol,2000,32(2):269-278)。Koike在对227例首次住院无PVI且接受经皮乙醇注射或微波治疗的HCC患者，做了平均19个月的随访分析，发现11％的患者出现PVI，单因素分析表明：肿瘤数目、组织学类型、AFP及DCP水平与出现PVI时相比有显著相关性；进一部分析表明，血浆DCP水平对于HCC后期是否伴发PVI是最常用的预后指标，监测其水平有助于PVI的早期诊断和治疗(Koike Y,Shiratori Y,Sato S,et al.Des-γ-carboxy prothrombin as a useful predisposing factor for development of portal venous in-vasion of hepatocellular carcinoma.Cancer,2001,91(3):561-569)。Utsunomiya对23例原手术时为进展期HCC后伴肝外复发者与186例肝内复发者作了比较。在对肿瘤大小限定后，两组患者预后无差异，而当肿瘤直径>5cm时，血浆DCP含量高于2000μg/L者发生肝外复发(62.5％)的显著多于肝内复发(P<0.05)。因此认为，一旦肿瘤直径超过5cm且其血浆DCP水平高于2000μg/L，就有必要采取比平常更为仔细的随访检查以尽可能早期发现肝外复发的可能(Utsunomiya T,Shimada M,Shirabe K,et al.Clinicopathological characteristics of patients with extrahepatic recurrence following a hepatectomy for hepatocellular carcinoma.Hepatogastroenterology,2001,48(40):1088-1093)。DCP的氨基酸特定位置上存在未经羧基化的谷氨酸残基，当肝细胞发生癌变时，内质网不能将DCP羧化成有活性的凝血酶原，从而使DCP含量升高。有报告显示，血清DCP有助于提高肝癌诊断的敏感性和特异性，并可以发现部分AFP阴性的小肝癌。因此DCP是临床上一个具有很好应用前景的HCC血清标志物，有望提高HCC诊断的敏感性和特异性，实现HCC的早期诊断(Lok AS,Sterling RK,EverhartJE,et al.Des-γ-carboxy prothrombin andα-fetoprotein as biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma.Gastroenterology,2010,138(2):493-502)。

DCP对疾病的诊断价值是肯定的，但是一些常规的检测方法缺乏足够的敏感性，导致检测结果不准确。临床常用免疫分析法检测DCP的含量，利用抗原抗体特异性结合反应进行检测，免疫标记技术进行结果判定，将荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体(或抗原)进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的检测，达到对免疫反应进行监测的目的。常用的免疫分析标记技术包括酶免疫分析、放射免疫分析、荧光酶免疫分析、胶体金免疫技术、发光免疫技术等。其中酶免疫分析灵敏度较低且操作复杂；放射免疫分析灵敏精确、样本用量少，但检测有效期较短且具有放射性污染；胶体金免疫技术标记物的制备简便，灵敏直观，但同时受影响因素较多；发光免疫技术检测步骤较复杂，本底较高且结果不稳定。

现有技术中，磁微粒化学发光免疫分析技术综合了磁微粒载体技术和化学发光免疫检测技术，使测量结果更准确，更稳定。该技术包括：

●磁微粒化学发光--双抗体夹心法：待测抗原同荧光素标记的抗体及酶标抗体结合形成“三明治”结构的复合物。随后加入连有抗荧光素抗体的磁微粒，通过抗荧光素抗体与荧光素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，通过光量子阅读系统记录光子能量，并通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度，并报告结果。

磁微粒化学发光--竞争法：将待测抗原、用过量包被磁微粒的抗体和定量的标记抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合形成复合物；二是待测抗原与抗体结合形成复合物。如待测标本中含有待测抗原，则与标记抗原以同样的机会与磁微粒包被的抗体结合，竞争性地占去了标记抗原与磁微粒包被的抗体结合的机会，使标记抗原与磁微粒包被的抗体的结合量减少。由于磁微粒包被的抗体是过量的，足以与待测抗原结合。磁微粒在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，通过光量子阅读系统记录光子能量，并通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度，并报告结果。

磁微粒化学发光—间接法：待测抗体与荧光素标记的抗原结合，随后加入包被着抗荧光素抗体的磁微粒，通过抗荧光素抗体与荧光素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直接沉淀，去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶标抗体，形成磁微粒－抗原－抗体－酶标二抗夹心免疫复合物。再次清洗后，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，通过光量子阅读系统记录光子能量，并通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗体的浓度，并报告结果。

但上述技术存在一些缺陷：如：

间断的、闪烁性发光不稳定，

反应过程中易发生裂变，结果不稳定，

以微孔板为载体，测试成本高、时间长，

需对结合相、游离相进行分离，操作步骤多，

瞬间产生的化学发光峰值很快衰减，

本底较高，干扰妨碍应用，

不易自动化等。

基于以上不足，本发明建立了一种DCP磁微粒免疫荧光检测方法，使用磁微粒A与DCP特异性结合的抗体偶联，使用荧光素标记该抗体作为检测抗体，再使用偶联DCP的磁微粒B清除过量的检测抗体，通过检测荧光强度计算目标检测物DCP的含量，实现对DCP含量的简便快速、灵敏准确的检测。

发明内容

本发明提供一种检测血浆或血清中DCP含量的方法：所述方法包括以下步骤：

步骤1，表面偶联抗DCP抗体的磁微粒A的制备，和表面偶联DCP抗原的磁微粒B的制备；

步骤2，荧光标记的抗DCP抗体的制备；

步骤3，DCP含量的检测：血浆或血清样品和磁微粒A反应，反应完毕将DCP洗脱，加入荧光标记的抗DCP抗体孵育，再加入磁微粒B继续孵育，然后磁性分离，用荧光分光光度计检测样品荧光值，计算样品中DCP含量；

其中所述DCP为脱-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-carboxy prothrombin)，又可称为PIVKA-II(Protein induced by vita min K absence-II)，维生素K缺乏或拮抗剂II诱导的蛋白质，也被称为APT(Human abnormal prothrombin)，人异常凝血酶原。

本发明所述的方法，其中所述磁微粒A和磁微粒B的制备，方法如下：将磁微粒制备成磁微粒悬浮液，磁微粒悬浮液与抗DCP抗体或DCP抗原偶联：将抗DCP抗体或DCP抗原与磁微粒悬浮液混合孵育偶联，偶联后用封闭液封闭，得到偶联DCP抗体的磁微粒A和偶联DCP抗原的磁微粒B。

本发明所述的方法，其中，所述与DCP特异性结合的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明所述的方法，其中，磁微粒与DCP抗原的偶联条件选自如下条件：

磁微粒粒径120nm、抗原浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；

磁微粒粒径180nm、抗原浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；

磁微粒粒径200nm、抗原浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；

磁微粒粒径300nm、抗原浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；

磁微粒粒径500nm、抗原浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；

或者磁微粒粒径800nm、抗原浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10；

本发明所述的方法，其中，磁微粒与抗DCP抗体的偶联条件选自如下条件：

磁微粒粒径120nm、抗体浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；

磁微粒粒径180nm、抗体浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；

磁微粒粒径200nm、抗体浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；

磁微粒粒径300nm、抗体浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；

磁微粒粒径500nm、抗体浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；

或者磁微粒粒径800nm、抗体浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10。

本发明所述的方法，步骤如下：

步骤(1)取磁微粒，加入磁微粒体积2～50倍的洗涤缓冲液，混匀，然后在磁力架上磁性分离，弃上清液；重复上一步骤，然后将磁微粒在与其等量的偶联缓冲液中悬浮，得到磁微粒悬浮液；

步骤(2)向抗DCP抗体或DCP抗原中加入体积0.01～1倍的步骤(1)处理的磁微粒悬浮液，加入偶联缓冲液，孵育，直至磁微粒偶联完全；磁性分离，保留磁微粒；磁微粒偶联结束后，加入封闭液，混匀，孵育磁性分离，得到偶联DCP抗体的磁微粒A和偶联DCP抗原的磁微粒B；

步骤(3)荧光标记的抗DCP抗体的制备：抗DCP抗体溶解于碳酸盐缓冲液中，荧光素溶解于DMSO中，将荧光素逐滴缓慢加入抗DCP抗体溶液中，4℃避光搅拌12～20h，用G-25葡聚糖凝胶去除游离的荧光素；

步骤(4)取待测样品，加入样品体积1～100倍的磁微粒A，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，使DCP抗原抗体充分反应；置于磁力架上磁性分离，弃上清液，用洗涤缓冲液清洗磁微粒复合物，置于磁力架上磁性分离，弃上清液；加入与抗体等量的洗脱液，混匀，重悬磁微粒，室温孵育5min，置于磁力架上磁性分离，保留上清液；加入样品体积1～100倍的荧光标记DCP抗体，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h；加入磁微粒A体积1～100倍的磁微粒B，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h；置于磁力架上磁性分离，保留上清液，采用荧光分光光度计检测样品荧光值，并对照标准曲线计算样品中DCP含量。

本发明所述的方法，优选的步骤如下：

(5)取磁微粒置于EP管中，加入磁微粒体积10～20倍的洗涤缓冲液，混匀，然后在磁力架上磁性分离，弃上清液；重复上一步骤，然后将磁微粒在与其等量的偶联缓冲液中悬浮，得到磁微粒悬浮液；

(6)加入磁微粒悬浮液体积0.2～0.3倍的需偶联的抗DCP抗体或DCP抗原于盛有磁微粒磁微粒悬浮液的EP管中，并加入磁微粒悬浮液体积10倍的偶联缓冲液，混匀；将EP管置于旋转混合仪上室温孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，直至磁微粒偶联完全；将EP管置于磁力架上磁性分离，保留磁微粒；表面偶联抗DCP抗体的为磁微粒A，表面偶联DCP抗原的为磁微粒B，上清液用于检测偶联效率；

(7)磁微粒偶联结束后，加入磁微粒悬浮液体积10倍的封闭液，混匀，将EP管置于旋转混合仪上室温孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，将EP管置于磁力架上磁性分离，弃上清液；重复上一步骤一次；

(8)取待测血浆或血清样品，加入样品体积1～100倍的磁微粒A，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，使DCP抗原抗体充分反应；置于磁力架上磁性分离，弃上清液，用洗涤缓冲液清洗磁微粒复合物，置于磁力架上磁性分离，弃上清液；加入与抗体等量的洗脱液，混匀，重悬磁微粒，室温孵育5min，置于磁力架上磁性分离，保留上清液；加入样品体积1～100倍的荧光标记DCP抗体，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h；加入磁微粒A体积1～100倍的磁微粒B，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h；置于磁力架上磁性分离，保留上清液，采用荧光分光光度计检测样品荧光值，并对照标准曲线计算样品中DCP含量。

本发明所述的方法，其中，

偶联缓冲液选自：碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硫酸盐缓冲液的一种或多种的组合，浓度为1～100mM，pH为8.0～10.0；

洗涤缓冲液选自：甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、氯化盐缓冲液的一种或多种的组合，浓度为2～200mM，pH为7.0～8.0；

洗脱液选自：甘氨酸、Tris Buffer、EDTA溶液、IPTG溶液、L-谷氨酸溶液、MES Buffer的一种或多种的组合，浓度为0.01～10M，pH为2.0～3.0；

封闭液选自：BSA、酪蛋白、甘氨酸的一种或多种的组合，浓度为0.05％～5％，pH为8.0～9.0；

保存液选自：BST缓冲液、Tween-20、NaN₃、BSA的一种或多种的组合，浓度为1～50mM，pH为8～10。

本发明还提供一种采用本发明方法检测DCP的试剂盒，包括：

磁微粒，以及任选的以下组分：偶联DCP抗体的磁微粒A，偶联DCP抗原的磁微粒B，DCP抗原，抗DCP抗体，荧光素，偶联缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱液，封闭液，保存液，磁力架。

优选的采用本发明方法检测DCP的试剂盒，包括：

偶联DCP抗体的磁微粒A，

偶联DCP抗原的磁微粒B，

以及任选的以下组分：DCP抗原，抗DCP抗体，荧光素，偶联缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱液，封闭液，保存液，磁力架。

本发明所述的试剂盒，包括：盒体、盒体内的试剂，试剂槽，说明书，所述试剂放置在试剂槽中。

本发明的目的在于提供：与以往的方法相比，简便快速，高灵敏度，高准确性，安全无毒，可回收DCP磁微粒免疫荧光检测方法，以及其检测试剂和检测试剂盒。

本发明人对于DCP的检测方法进行了深入的研究，结果发现：通过磁微粒分离荧光免疫分析技术，与以往的方法相比，具有简便快速，灵敏度高，准确性高，安全无毒，可回收等优点，从而完成了本发明。

即，本发明提供DCP的磁微粒分离免疫荧光分析检测方法，该检测方法包括：使用磁微粒作为固相载体，偶联与DCP特异性结合的抗体作为包被抗体，使用荧光素标记与DCP特异性结合的抗体作为检测抗体，最后使用偶联DCP的磁微粒清除过量的检测抗体，通过荧光强度定量检测样品中的DCP。本发明还提供DCP磁微粒免疫荧光检测试剂，该免疫荧光检测试剂包含：磁微粒，DCP抗原，抗DCP抗体，荧光素，偶联缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱液，封闭液，保存液。本发明进一步提供DCP磁微粒免疫荧光检测试剂盒，该检测试剂盒包括本发明所述的DCP磁微粒免疫荧光检测试剂。

根据本发明可提供简便快速，高灵敏度，高准确性，安全无毒，可回收的的DCP的磁微粒分离免疫荧光分析检测方法、以及用于该检测的试剂和检测试剂盒。本发明的方法与以往的方法相比，检测效率得到大幅提高，作为DCP检测方法，其具有简便快速，灵敏度高，准确性高，安全无毒，可回收等优点。

本发明的检测方法中，使用磁性微粒分别偶联DCP、与DCP特异性结合的抗DCP抗体、和荧光标记的抗DCP抗体进行磁微粒分离免疫荧光分析检测。通过此方法，可以合乎需要地简化操作步骤，降低检测成本，提高检测值的准确性。

DCP抗原，即DCP抗原蛋白标准品，为市售商品，可按照常规方法购买获得，其特性如下：产品浓度1mg/ml，纯化方法为HPLC，纯度≥98％。

抗DCP抗体是与DCP特异性结合的抗体，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。从免疫检测的再现性等角度考虑，可优选使用单克隆抗体。另外，这些抗体也可以保持与对应抗原的结合性的抗体片段(抗原结合性片段)的形式使用。

多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合性片段的制备方法本身是周知的常规方法，抗DCP抗体或及抗原结合性片段可按照常规方法制备。另外，这些抗体也存在市售商品，因此也可以使用市售的抗体。

抗DCP单克隆抗体例如可通过周知的杂交瘤法获得：将DCP或其部分片段作为免疫原与适当的佐剂混合用于免疫动物(人除外)，从该动物采集脾细胞或淋巴细胞等抗体生成细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤，然后选择生产与DCP特异性结合的抗体的杂交瘤，使其增殖，从培养上清中获得抗DCP单克隆抗体。为了使被免疫动物中抗体效价升高，免疫通常需要花费数周进行多次。本发明中，为了提高DCP结合的特异性，优选单克隆抗体。

作为免疫原使用的多肽或其部分片段可通过化学合成、遗传工程学方法等常规方法制备，或从新鲜人血浆等中提取DCP并纯化获得。化学合成法的具体例子例如可举出：Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等。还可以利用各种市售的肽合成仪，通过常规方法参照GenBank等数据库中的DCP序列信息合成所需的多肽。通过遗传工程学方法制备多肽的方法也是周知的。具体来说，例如可通过以下所述的方法制备：首先，由来自人的培养细胞等中提取RNA，通过反转录反应由mRNA合成cDNA。以该cDNA为模板，根据GenBank等数据库中的DCP序列信息等设计引物并进行PCR，制备编码DCP的多核苷酸。或者，编码DCP的多核苷酸可通过使用市售的核酸合成仪的常规方法制备。编码各氨基酸的密码子是公知的，因此只要特定氨基酸序列，编码该氨基酸序列的多核苷酸的碱基序列也可确定。接着，将制备的多核苷酸导入适当的载体，通过适当的表达系统使多肽表达，回收该多肽，由此可获得所需的免疫原多肽。所使用的载体或各种表达系统(细菌表达系统、酵母细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、无细胞表达系统等)也是周知的，各种载体或宿主细胞、试剂类、检测试剂盒均有市售。

免疫分析法是周知的常规方法。作为具体例子，可举出竞争蛋白结合分析、受体结合分析，以及放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、胶体金免疫分析、化学发光和生物发光免疫分析方法等，本发明中可以采用任意方法。从免疫检测的准确性及安全性等角度考虑，可优选使用荧光免疫分析法。

磁微粒即超顺磁性纳米颗粒，磁微粒分离免疫荧光分析技术是将目标分子的亲和基团如抗体、蛋白等偶联于磁性纳米颗粒表面，形成可均匀分散的具有高度稳定性的胶态复合磁微粒。当免疫磁微粒与含有检测目标分子的溶液混合后，由于目标分子与其基团的亲和结合而形成磁微粒-基团-目标分子复合物，然后利用外加磁场(磁力架或磁棒)与磁微粒之间的磁性将磁微粒-基团-目标分子复合物分离，经过洗涤缓冲液去除非特异性结合杂质，然后用洗脱液将目标分子与磁微粒分离，进而实现目标分子的分离检测，具有成本低、能耗少、安全无毒、可回收等优点，若与全自动分离检测仪器配套使用，可进一步提高反应通量和工作效率。本发明在粒径分布于100～1000nm之间的磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团(氨基、羧基、巯基、环氧基、NHS基团等)偶联DCP和与DCP特异性结合的抗DCP抗体，作为固相载体用于免疫检测。本发明中的磁微粒表面可以使用任意一种功能基团与DCP或者抗DCP抗体偶联。悬浮性磁微粒作为固相载体，取代传统的免疫学固相载体用于检测，具有较大的比表面积，能够充分的与样品反应，加之外加磁场的灵活运用，具有快速高效、灵敏度高、重复性好等优点。另外，这些磁微粒也存在市售商品，因此也可以使用市售的磁微粒或者磁珠。

以使用抗DCP抗体作为包被抗体的情形为例，具体说明本发明的DCP检测方法。首先，将抗DCP抗体(包被抗体)偶联于固相载体磁微粒上，将多余的基团封闭后使足量磁微粒与待测样品充分接触，由此磁微粒上的抗DCP抗体与样品中所含的DCP特异性结合，接着磁性分离，用适当的缓冲液洗涤磁微粒复合物，除去未结合的样品中其他成分，例如多余的载体等。然后洗脱DCP，使用过量的荧光素标记的抗DCP抗体与DCP结合，孵育使充分反应。反应结束后，用适当的方法检测来自荧光素标记物的荧光信号，由此可检测样品中的DCP含量。

固相载体没有特别限定，可以与在公知的免疫检测系统中使用的固相载体相同。固相载体的材质的具体例子可举出：聚苯乙烯、聚氯乙烯、琼脂糖、脂质体、膜载体、高分子磁微粒等，但并不限于这些。所使用的固相载体优选为抗体与其表面结合牢固，且可容易地将检测中形成的免疫复合物与未反应的成分分离的材料。从操作性、经济性、安全性与结合效率等方面考虑，优选使用如上所述材质中的磁微粒。

DCP、与DCP特异性结合的抗DCP抗体或其抗原结合性片段与固相载体的结合可通过本领域周知的常规方法进行，作为具体例子，可举出共价键化学偶联、非共价键吸附或物理吸附等，本发明可以采用任意一种方式结合到固相载体表面，但并不限于这些。

一种磁微粒，其特征在于：所述磁微粒表面覆盖有一层具有抗原识别活性的抗体，或覆盖有一层具有抗体识别活性的抗原。

标记物没有特别限定，可以使用与在公知的免疫检测系统中使用的标记物同样的物质。具体例子可举出：酶、荧光物质、化学发光物质、染色物质、放射性物质等。为了提高检测灵敏度，简化操作步骤，降低放射污染，优选使用荧光素标记。用于标记的荧光染料也没有特别限定，可以使用与在公知的免疫荧光检测系统中使用的标记物同样的物质，具体例子可举出：异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)，四乙基罗丹明(rhoda mine,RIB200)，四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhoda mineisothiocyanate,TRITC)，镧系元素(铕Eu₃、铽Tb₃、铈Ce₃等)螯合物，藻红蛋白(phycoerythrin,PE)及其他荧光物质(β-半乳糖苷酶、碱性酸酶、辣根过氧化物酶)等。本发明中可以使用任意一种作为荧光染料，但并不限于这些。

使用生物素作为标记物时，可以使用结合了酶、荧光物质、化学发光物质、染色物质或放射性物质等的链霉抗生物素或半抗原抗体等检测。

信号的检测可根据标记物的种类适当选择。例如信号如果是显色，则可使用比色计或吸光光度计，如果是荧光则可以使用荧光分光光度计，如果是发光则可以使用光子计数仪，如果是放射线则可以使用放射线检测装置。对于以各种浓度含有DCP的浓度已知的标准样品，按照本发明的方法检测DCP，由来自标记的信号量和标准样品中DCP的浓度的相关关系制图，绘制标准曲线，对DCP浓度未知的样品同样进行检测操作，检测来自标记的信号量，将检测值代入该标准曲线，由此可对样品中DCP进行定量。

本发明的方法所适用的样品是从受试者体内分离的样品，优选血液样品，特别优选血浆或血清。根据本发明的检测方法，不管是血浆还是血清，均可稳定地检测DCP含量。根据需要可适当稀释样品，以确保在工作浓度范围内进行检测。

本DCP磁微粒免疫荧光检测方法所述抗体不是包被在板上，而是用抗体来包被磁微粒，将包被的磁微粒作为试剂使用，更利于定量操作，方便稳定且灵敏度更高，在抗体抗原反应中能将检测干扰因素降到最低。

本发明还提供DCP磁微粒免疫荧光检测试剂，该试剂包含：磁微粒，DCP抗原，抗DCP抗体，荧光素，偶联缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱液，封闭液，保存液。

上述DCP磁微粒免疫荧光检测试剂可以适当组合，作为DCP磁微粒免疫荧光检测试剂盒提供。DCP磁微粒免疫荧光检测试剂还可以与其它试剂类等适当组合，例如，除上述检测试剂之外，本发明的检测试剂盒中还可以进一步含有EP管、样本稀释液等。其中，EP管即Eppendorf离心管，为市售商品，可按照常规方法购买获得。免疫检测所必需的其它试剂类是周知的。

本发明所提供的灵敏快速的DCP磁微粒免疫荧光检测试剂盒，为DCP的检测和疾病的早期诊断提供了一种简便快速，高灵敏度，高准确性，安全无毒，可回收的途径。检测试剂盒中包括所述DCP磁微粒免疫荧光检测试剂，固定在盒内的凹槽中。

附图说明

图1是表示实施例1中DCP标准品浓度与吸光度的线性关系的图表。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，以使用DCP作为目标检测物的情形为例，具体说明本发明的DCP磁微粒免疫荧光检测方法。本发明并不受这些实施例等的限定。本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在本发明中，当给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1.DCP磁微粒分离免疫荧光分析检测试剂的制备

1、DCP抗原的制备

(1)pColdⅡ-DCP表达载体的构建

参照GenBank中人DCP的基因序列设计引物并合成DCP基因，PCR扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳检测DCP扩增产物，切下目的条带，使用胶回收试剂盒回收目的片段。对其用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切的原核表达载体pColdⅡ连接，转化至大肠杆菌E.coli.DH5α中扩增，再转入E.coli.BL21(DE3)感受态细胞，接种于LB固体培养基中，含氨苄青霉素(Amp)100mg/L，抽取质粒，进行NdeⅠ和HindⅢ酶切鉴定和测序。重组质粒pColdⅡ-DCP经5'NdeⅠ和3'HindⅢ进行双酶切，出现两条特异性条带，位置与pColdⅡ和目的片段的大小一致。测序结果显示目标序列与NCBI相应序列相符，证实表达载体pCold II-DCP构建成功。

(2)DCP融合蛋白的表达及纯化

挑取含重组质粒pColdⅡ-DCP-BL21的菌落接种于10mL LB培养基(Amp，100mg/L)中，220r/min 37℃摇菌12h，按1:100的比例接种于1000mL的LB培养基(Amp，100mg/L)中，相同条件下培养3h，待菌液达到A₆₀₀时加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，15℃振摇培养16h，诱导培养结束后，收集菌体至50mL无菌离心管，5000r/min>

2、DCP抗体的制备

(1)杂交瘤细胞株的制备

将生长状态良好的S p2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞以1:10的比例混合，加入50％聚乙二醇进行融合，融合过程按常规方法进行。用DCP表达蛋白作为检测抗原，对有融合细胞孔的上清液进行间接ELISA检测，一抗为细胞培养上清，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(1:2000稀释)，TMB显色检测筛选阳性细胞克隆株。将筛选的阳性细胞克隆株用有限稀释法进行单克隆筛选，间接ELISA法检测，直至阳性率达100％，筛选出稳定分泌抗DCP抗体的杂交瘤细胞株进行扩大培养，并冻存于液氮中。

(2)单克隆抗体的制备

选择BALb/c小鼠，每只腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL，1周后经腹腔接种杂交瘤细胞0.5mL(1×10⁶细胞/只)。10～14d后小鼠腹部明显肿胀收集腹水，12000r/min离心10min，去除上层的脂肪、液体石蜡和沉淀，吸取淡黄色腹水，将腹水经Protein>

DCP磁微粒免疫荧光分析检测方法及操作步骤

1、磁微粒与目标生物样品的偶联

(1)磁微粒的预处理

将磁微粒悬浮液反复颠倒混匀，取50μL置于1.5mL EP管中，加入0.5～1.0mL洗涤缓冲液，洗涤缓冲液为：pH为7.2～7.6的20mM磷酸钠，150mM氯化钠，混匀，然后在磁力架上磁性分离，弃上清液。加入1mL洗涤缓冲液悬浮磁微粒，混匀，在磁力架上磁性分离，弃上清液。重复上一步骤，然后将磁微粒在50μL偶联缓冲液中悬浮，偶联缓冲液为：pH为8.0～8.2的25mM～50mM碳酸氢铵，待用。

(2)目标生物样品的偶联

将目标生物样品与磁微粒偶联以制备免疫磁微粒时，所用的单克隆抗体或抗原包被液的浓度是影响后期检测的直接因素，其浓度大小直接影响检测结果的准确性和线性范围。若所用包被液的浓度过低，在后期的免疫反应中磁微粒的反应效率差，抗原抗体反应不完全，使检测结果偏低；若所用包被液的浓度过高，会造成昂贵试剂的浪费。因此采用以下方法进行条件优化筛选：

取10～15μL需偶联的DCP抗体或抗原于盛有2mL粒径为100～1000nm磁微粒的EP管中，并加入500μL偶联缓冲液，偶联缓冲液为：pH为8.0～8.2的25mM～50mM碳酸氢铵，混匀。将EP管置于旋转混合仪上孵育。然后将EP管置于磁力架上磁性分离，保留磁微粒及上清液，采用BCA法检测偶联前后抗DCP抗体标准溶液的蛋白含量。所述磁微粒与抗DCP抗体偶联条件优选为：

磁微粒粒径120nm、抗体浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；

磁微粒粒径180nm、抗体浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；

磁微粒粒径200nm、抗体浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；

磁微粒粒径300nm、抗体浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；

磁微粒粒径500nm、抗体浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；

或者磁微粒粒径800nm、抗体浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10。

所述磁微粒与抗DCP抗原偶联条件优选为：

磁微粒粒径120nm、抗原浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；

磁微粒粒径180nm、抗原浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；

磁微粒粒径200nm、抗原浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；

磁微粒粒径300nm、抗原浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；

磁微粒粒径500nm、抗原浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；

或者磁微粒粒径800nm、抗原浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10。

(3)封闭未反应的基团

磁微粒偶联结束后，加入500μL封闭液，封闭液为：0.1％的BSA，混匀后将EP管置于旋转混合仪上室温孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，然后将EP管置于磁力架上磁性分离，弃上清液。重复上一步骤一次。

(4)磁微粒的保存

向已完成生物分子共价偶联的磁微粒中加入1mL的保存液，保存液为：pH为9的5mM BST缓冲液，0.05％Tween-20，0.01％NaN₃，0.1％BSA，混匀，于4℃保存备用。

2、磁微粒与抗DCP抗体偶联效率的检测

将抗DCP抗体与磁微粒偶联后，采用BCA法检测偶联前后抗DCP抗体标准溶液的蛋白含量，计算磁微粒偶联效率。结果表明，加入磁微粒后，溶液蛋白浓度显著降低，磁微粒表面的基团可与抗DCP抗体发生偶联，以使磁微粒具有生物活性，即具有捕获抗体或抗原的能力成为免疫磁微粒。磁微粒与抗DCP抗体偶联效率为84.78％±7.23。

3、DCP标准曲线的绘制

取FITC标记的抗DCP抗体100μL于EP管中，分别加入DCP标准品各100μL，用0.01mol/L PBS稀释为10个浓度梯度(0ng/mL，0.2ng/mL，0.4ng/mL，0.8ng/mL，1.6ng/mL，3.2ng/mL，6.4ng/mL，12.8ng/mL，25.6ng/mL，51.2ng/mL)，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12h以上，使DCP抗原抗体充分反应。用空白孔调零，采用荧光分光光度计检测标准品荧光值，依据DCP标准品浓度及其荧光值绘制标准曲线，见图1。

4、DCP含量的检测

具体操作步骤如下：

(1)取10份人血清样品200μL，加入2mL偶联DCP抗体的磁微粒A，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，使DCP抗原抗体充分反应。

(2)置于磁力架上磁性分离，弃上清液，用洗涤缓冲液清洗磁微粒复合物，洗涤缓冲液为：pH为7.2～7.6的20mM磷酸钠，150mM氯化钠，置于磁力架上磁性分离，弃上清液。

(3)加入100μL洗脱液，洗脱液为：pH为2.5的0.1M甘氨酸，混匀，重悬磁微粒，室温孵育5min，置于磁力架上磁性分离，保留上清液。

(4)加入2mL FITC标记的抗DCP抗体，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h。加入20mL偶联DCP抗原的磁微粒，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h。

(5)置于磁力架上磁性分离，保留上清液，采用荧光分光光度计检测样品荧光值，并对照标准曲线计算样品中DCP含量。

和现有的方法相比，本发明的优点表现在：

免疫磁微粒具有较高的表面质量比，可以结合更多的抗体或者抗原参加免疫反应；

采用两套磁微粒分别偶联抗体及抗原，与常规的双抗体夹心法相比，本方法只需要一种对应的抗DCP抗体即可完成反应，成本较低；

采用荧光标记抗体技术，将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合，特异性强、灵敏度高、准确性好。

5、DCP检测方法的稳定性比较

将上述检测结果与ELISA法进行对照，结果显示二者具有良好的相关性：采用磁微粒分离免疫荧光分析法检测DCP的线性范围为0.1～50.0ng/mL，检测限为0.1ng/mL，标准曲线的线性回归方程为y＝2.1069+0.9766x，R²＝0.9995，(其中x为DCP浓度，y为吸光度值)，其检测下限比ELISA法低50倍。血清样品DCP含量检测结果如下：

注：-表示不能检出。

6、磁微粒的回收率检测

将已偶联DCP抗体或抗原的磁微粒与洗脱液混合，洗脱液为：pH为2.5的0.1M甘氨酸，充分反应后置于磁力架上磁性分离，立即用洗涤缓冲液清洗磁微粒，洗涤缓冲液为：pH为7.2～7.6的20mM磷酸钠，150mM氯化钠，除去残留于磁微粒表面的抗体或抗原，然后加入1mL保存液，保存液为：pH为9的5mM BST缓冲液，0.05％Tween-20，0.01％NaN₃，0.1％BSA，混匀，于4℃保存备用。将抗DCP抗体与回收的磁微粒偶联后，采用BCA法检测偶联前后抗DCP抗体标准溶液的蛋白含量，计算得磁微粒回收率为83.99％±8.14。

7、全自动磁微粒分离免疫荧光分析检测

磁微粒分离检测的具体实现方法通常有手动和自动两种形式。手动检测是指操作人员使用DCP磁微粒免疫荧光检测试剂、磁力架等耗材和工具，手工完成整个检测流程。手动分选中用到的磁力架结构比较简单，主要由支架和产生磁场的永磁铁组成，起到承托试管并提供外加磁场的作用。磁微粒的孵育、外部磁场的加入与移除、吸附物的清洗与洗脱等各关键步骤都由人工操作完成。手动分选不需要复杂的设备，形式灵活、成本较低，适合少量实验使用。

当需要频繁进行操作且样本量较大时，采用自动分离检测法更为方便高效。自动分离法主要利用全自动磁微粒分选仪，操作人员将待分选样本加入到分选仪中，由分选仪自动完成分离流程。全自动磁性分选仪的分选通量较大，并且一般有多个优化的分选程序可供调用，操作简单，分选可靠性高。当前具有代表性的产品化全自动磁性分选仪有美天旎(MACS)，BD，R&D，StemCell RoboSep和Dynal Bead Retriever等品牌。

本发明磁微粒分离免疫荧光分析DCP含量的检测方法，可用于全自动免疫磁珠分选系统，实现全自动分析检测，具体操作步骤如下：

(1)预冲autoMACS pro分选仪，准备待测血清样品、磁微粒A/B、DCP标准品、FITC标记的抗DCP抗体、偶联缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱液、封闭液、保存液；

(2)细胞分选策略选择“阳性分选策略”，标记方式选择“直接标记”；

(3)取25μL DCP标准品到S1-7号管中，向2个空白管中加入1mL洗涤缓冲液，向离心管中分别加入25μL磁微粒A和50μL荧光标记抗DCP抗体，设置反应程序条件，上机检测。将检测结果与手动检测法进行对照，结果显示二者具有良好的相关性。

实施例2.DCP磁微粒免疫荧光检测试剂盒的组成

本发明根据本发明所述方法设计了一种试剂盒，该试剂盒可以用于DCP的检测，通过使用该试剂盒，使操作简单，省时省力，避免了现用现配的繁琐，同时使操作标准化。

因此本发明提供一种试剂盒。

本发明的试剂盒，包括磁微粒，以及任选的以下组分：偶联DCP抗体的磁微粒A，偶联DCP抗原的磁微粒B，DCP抗原，抗DCP抗体，荧光素，偶联缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱液，封闭液，保存液，磁力架。

本发明的另一种试剂盒，包括：偶联DCP抗体的磁微粒A，偶联DCP抗原的磁微粒B，以及任选的以下组分：DCP抗原，抗DCP抗体，荧光素，偶联缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱液，封闭液，保存液，磁力架。

其中所述任选为可以不选其中任一组分，也可以选择其中一或多种组分。

本发明的试剂盒，是将不同的组分分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，使用时根据说明书中描述的方法进行操作。

试剂盒中，偶联缓冲液选自：碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硫酸盐缓冲液的一种或多种的组合，浓度为1～100mM，pH为8.0～10.0；

洗涤缓冲液选自：甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、氯化盐缓冲液的一种或多种的组合，浓度为2～200mM，pH为7.0～8.0；

洗脱液选自：甘氨酸、Tris Buffer、EDTA溶液、IPTG溶液、L-谷氨酸溶液、MES Buffer的一种或多种的组合，浓度为0.01～10M，pH为2.0～3.0；

封闭液选自：BSA、酪蛋白、甘氨酸的一种或多种的组合，浓度为0.05％～5％，pH为8.0～9.0；

保存液选自：BST缓冲液、Tween-20、NaN₃、BSA的一种或多种的组合，浓度为1～50mM，pH为8～10。

本发明的检测试剂盒，包括：盒体、盒体内的试剂，所述试剂为DCP磁微粒免疫荧光检测试剂，所述盒体内部设有若干试剂槽，所述试剂槽中放置盛有磁微粒的EP管，试剂盒中试剂的量可以是一人份，也可以是多人份。

和现有的方法相比，本发明的优点表现在：

免疫磁微粒具有较高的表面质量比，可以结合更多的抗体或者抗原参加免疫反应；

采用两套磁微粒分别偶联抗体及抗原，与常规的双抗体夹心法相比，本方法只需要一种对应的抗免疫标志物抗体即可完成反应，成本较低；

采用荧光标记抗体技术，将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合，特异性强、灵敏度高、准确性好。

综上所述，本发明所提供的DCP磁微粒免疫荧光检测试剂盒具有良好的准确性和特异性且灵敏度高，有效克服了现有技术中的缺点且具高度产业化利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。