玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15‑like在提高植株抗盐和抗旱中的应用

摘要

本发明公开了一种玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15‑like在提高植株抗盐和抗旱中的应用，其中所述玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15‑like存在两个mRNA剪切体，分别命名为剪切体1和剪切体2，其中所述剪切体1 cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述剪切体2 cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。实验结果表明，本发明所述基因突变体植株比野生型植株对盐和旱更为敏感，此成果为通过基因工程手段提高作物抗盐抗旱性提供了理论依据和实践基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like在提高植株抗盐和抗旱中的应用。

背景技术

随着全球性的气候变化，盐和干旱成为限制植物生长发育和相关产量的重要因素之一。因此，发掘和鉴定抗盐相关基因通过基因工程或分子育种技术用于农作物改良是育种科学家考虑的关键问题之一。玉米是世界上最为重要的粮食/经济作物之一，种植范围和面积巨大。近年来，随着世界范围的气候变化，土壤的盐渍化和干旱情况加剧，这些成为限制玉米生长发育和产量的重要逆境因素。因此筛选和创造对逆境适应强的玉米新种质资源/品种成为玉米育种的方向之一。已有的文献报道，15kD硒蛋白(Selenoprotein 15kD，Sep15)基因在动物中能被多种非生物胁迫诱导表达且参与内质网压力反应，通过维持不同种类组织细胞内质网压力反应的平衡保证生理状态的稳定。但在植物体内，尽管在GenBank已有相关基因的释放，但未见有关证明Sep15的同源基因玉米ZmSep15-like在应对逆境胁迫中可能发挥作用或相关功能研究的文献报道。

发明内容

针对现有技术，本发明的目的是提供一种玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like在提高植株抗盐和抗旱中的应用。

本发明所述的玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like在提高植株抗盐和抗旱中的应用。

其中：所述玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like存在两个mRNA剪切体，分别命名为剪切体1和剪切体2，其中所述剪切体1cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述剪切体2cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

其中：所述植株优选是玉米。进一步优选的玉米品种是玉米W22。

申请人从玉米W22中分离得到玉米的Sep15-like基因，与已报道基因的序列分析发现：在玉米中克隆的玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like与来自动物中的同源基因相似度较低，同源性在40％～55％之间，与来自植物的同源基因相比同源性在50～85％之间。对其保守区分析发现，玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like推导的氨基酸序列含有“巯基结构域”和“UGT结合结构域”，这两种结构域在生物中是保守的，这表明这类基因在功能上可能有很大的保守性；与此同时，也发现其保守结构域的关键位点存在氨基酸的替换，这暗示在植物和玉米中与动物相比，该基因存在功能上的分化。也预示Sep15的同源基因玉米ZmSep15-like在应对逆境胁迫中可能发挥重要作用。基于此，申请人从玉米W22中分离得到玉米的Sep15-like基因，首先利用逆境因子胁迫处理，发现该基因受到逆境的强烈诱导，随后在玉米遗传家系和不同突变体纯系中证实其确实具有提高抗盐和抗旱的能力。

在研究发现ZmSep15-like基因在逆境处理下有强烈响应的状况下，申请人利用山东大学生命学院谭宝才教授参与创造的玉米W22Sep15-like突变体系，经筛选获得突变体纯系2个(插入位点都在转录起始位点下游第一内含子处，约300～400bp处)，利用杂交自交的方式获得了F2遗传家系。进一步的实验证实：在盐和旱的处理下，玉米植株表现出很强的诱导ZmSep15-like表达的情况；模拟干旱和高盐的条件下，玉米F2遗传家系表现出该基因与抗旱性和抗盐性极其相关；两个不同突变体系在盐和旱处理下相比于野生型更加敏感，说明该基因与玉米的旱敏和盐敏性状极其相关，结果表明该基因参与了玉米的对盐和旱的抗性。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like并进行了功能验证。实验发现该基因与抗旱性和抗盐性密切相关。故本专利的成果对于该基因ZmSep15-like的研究具有重要理论意义和对作物育种和改良具有重要指导。

附图说明

图1：ZmSep15-like基因的cDNA电泳图，

其中：M为DNA Marker，Sep15-1、-2分别为两个不同cDNA剪切体。

图2：NaCl和PEG诱导玉米W22不同组织中两个不同ZmSep15-like剪切体的表达，leave,叶；root,根；stem,茎。

图3玉米F2遗传家系抗旱性、抗盐性分析，

其中，图3A：玉米F2遗传家系抗旱性分析，野生、杂合和突变分别为野生型、杂合型和纯合突变型F2后代株系；图3B：玉米F2遗传家系抗盐性分析，野生、杂合和突变分别为野生型、杂合型和纯合突变型F2后代株系。

图4：两个不同玉米突变体纯系中ZmSep15-like基因Real-time PCR表达分析，

其中，W22为野生型玉米，Sep15-1mutant和Sep15-2mutant为不同突变体纯系。

图5：两个突变纯系的抗旱性实验，

其中，W22为野生型玉米，Sep15-1mutant和Sep15-2mutant为不同突变体纯系。

图6：两个突变纯系的抗盐性实验，

其中，W22为野生型玉米，Sep15-1mutant和Sep15-2mutant为不同突变体纯系。

具体实施方式

实施例1、玉米W22类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like的克隆

1.1玉米W22总RNA的提取

(1)将生长到3片叶的玉米植株剪碎放入研钵中，加入液氮后将其研磨成粉。

(2)取200mg未解冻的粉末转入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol RNA提取液混匀后室温下静置5min。

(3)将提取液离心10min：4℃，12000rpm。取上清液0.9ml+0.2ml氯仿移入另一个新1.5ml离心管中剧烈振荡15sec混匀，室温静置5min。

(4)在4℃、12000rpm条件下离心10min，取0.4ml上清液+0.4ml异丙醇在新的1.5ml离心管中混匀，室温静置15mim。

(5)继续离心，条件：4℃、12000rpm、10min，沉淀用1ml 75％的乙醇连续洗涤两次后离心，条件：4℃，8000rpm、5min。

(6)倒掉乙醇，在超净工作台中干燥沉淀5min，加入RNase-Free水40μl后在60℃水浴中温育10min。

(7)用紫外分光光度计检测RNA样品的浓度和质量，要求A₂₆₀/A₂₈₀为1.7～2.0。

1.2合成ZmSep15-like cDNA第一链

(1)向新离心管中依次加入下列物质，建立反应体系(40μl体系)：总RNA，3μg；oligo-dT(0.05μg/μl)，2μl；dNTP(0.01μg/μl)，2μl；加入RNase-Free水，至27μl。

(2)轻混后在65℃下5min，立即冰浴1min；

(3)之后立即向离心管中依次加入下列试剂：5×buffer，8μl；20mM DTT，4μl；MMLV，1μl。轻混后于42℃恒温水浴1h，之后65℃下变性10min，于-20℃下储存备用。

1.3PCR反应合成ZmSep15-like的cDNA

第一链的合成使用5μg总RNA，所使用的试剂盒为PrimeScript^TM>

(1)cDNA合成所使用的引物：

ZmSep15-like-F：5'GGGGAGGAGATATGGA 3'

ZmSep15-like-R：5'AGGATGATTGGAAGCAGAC 3'

(2)PCR反应体系(20μl)：

cDNA，1μl；10×Buffer，2μl；dNTP(2.5mM each)，0.4μl；引物F(10μM)，0.5μl；引物R(10μM)，0.5μl；TransTaq HiFi DNA聚合酶，0.2μl；补充双蒸水至20μl。PCR反应条件如下：95℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1.5min；2-4步骤循环35次；72℃，10min；10℃保存。反应结束后，PCR产物于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，获得了预期大小的电泳条带(图1)。

(3)克隆基因片段的纯化回收(使用DP209试剂盒)

将凝胶产物放入1.5ml离心管，加入3倍体积的溶胶液，在60℃低频振荡水浴10min；融化后凝胶注入回收柱中放置片刻后室温离心：12000rpm，离心30sec；倒掉上清液后在柱中加入700μl漂洗液，稍后常温离心：12000rpm，离心1min；倒掉上清后在柱中加入500μl的漂洗液，稍后常温离心：12000rpm，1min；弃去上清液后离心：12000rpm，2min；回收柱晾干2min后放入新的1.5ml离心管，加入40μl 60℃的EB缓冲液；静置2min后离心：12000rpm，1min；留取上清液。

1.4目的片段的连接和转化E.coli DH10B

(1)连接。体系：1μl pEasy-T1simple载体，4μl PCR回收产物(含目的片段100～200ng)混匀后短暂离心，于25-30℃连接20min得到重组质粒。

(2)转化。在无菌条件下取100μl感受态E.coli DH10B(鼎国，北京)加入预冷灭菌的1.5ml Eppendorf管中，加入10μl连接产物，混匀后置于冰上30min；在42℃水浴中90sec后立即插入冰中5min；转化产物与800μl不含抗生素的LB液体培养基混匀，在37℃振荡复苏培养60min；短暂离心收集菌体，用150μl LB液体培养基重悬菌体，之后用无菌涂布棒涂布在含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上；平板先在37℃正向放置30min，之后倒置培养在于37℃温箱中16h。

1.5阳性重组子的鉴定

(1)碱裂解法提取阳性重组质粒。挑取白色单菌落，接入3ml含抗生素Amp(50mg/L)的LB液体培养基中37℃低频震荡培养16h；离心：12000rpm，30sec；倒掉上清后加入100μl冰预冷的标准碱裂解质粒溶液I充分混匀；加入200μl标准溶液II，充分混匀后冰浴10min；加入冰预冷的溶液Ⅲ150μl，轻轻混匀后冰浴10min；经12000rpm，3min离心后取上清转入新离心管中；加入2倍体积95％乙醇，混匀后12000rpm离心3min；弃上清后加入200μl TE溶液；加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量RNA；12000rpm，离心3min；上清移到另一新离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，混匀后于室温静置3min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；弃上清后用1ml 70％乙醇洗涤沉淀；弃洗液后室温干燥。取200μl的TE溶液溶解沉淀，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，混匀后静置10min，12000rpm离心5min；取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇,混匀后-20℃放置15min后,12000rpm离心3min使质粒沉淀；弃上清用1ml70％乙醇洗涤沉淀，弃液体,用40μl无菌水溶解质粒沉淀。

(2)酶切验证重组质粒。酶切体系：重组质粒，16μl；EcoRI，2μl；10×Buffer，2μl。将反应体系混匀并5000rpm离心1min，37℃水浴中过夜，然后进行1％的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6cDNA测序和基因命名

经验证的阳性单菌落接种到含有50mg/L Amp LB液体培养基摇过夜培养，经商业公司(博亚，上海)测序，全长cDNA基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。使用NCBI blast软件分析，与其它生物来源的Sep15存在保守序列的高度相似性，初步命名为玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like。

实施例2、玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like的诱导表达分析

2.1实验材料的处理

本申请所使用的玉米W22野生型种子由山东大学谭宝才教授赠与。为了萌发，首先使用2％(w/v)NaClO对玉米种子进行表面消毒处理，之后将种子排在饱和水的滤纸上，在28℃下培养3天。待萌发后幼苗移至1/2Hoagland培养液中培养到两叶一心期(表1)，温室条件为28℃，光周期为16/8h(光照/黑暗)。

表1：1/2Hogland液体培养基配方如下：

挑选生长一致的幼苗用于诱导实验，将幼苗移至含有1/2Hoagland培养液的大试管中，培养液分别含有20％(w/v)PEG6000(20％)和200mM NaCl，以不添加PEG6000和NaCl的培养液作为对照。分别在培养的0、1、6、12、24、48小时取根茎叶进行取样，冲洗植物组织表明的泥土，使用液氮进行速冻，-70℃保存。

2.2总RNA的提取

将液氮冷冻的实验材料用研钵研磨成粉末，分装到1.5ml离心管，用于组织总RNA的提取。方法参照实施例1.1。

2.3RNA反转录与诱导表达的qRT-PCR分析

(1)第一链的合成

第一链的合成使用5μg总RNA，所使用的试剂盒为PrimeScript^TM>

(2)qRT-PCR分析

使用两对引物，分别对应两个不同的剪切体：

第一对引物

ZmSep15-like-1-F：5'TTCGTCAAGGACCAAGAGC 3'

ZmSep15-like-1-R：5'GAATAACGGGTTTCCACAT 3'

第二对引物

ZmSep15-like-2-F：5'CCGTTATTCTTATGGTTCGC 3'

ZmSep15-like-2-R：5'TGTCTAATTTCACTGGCTTCAC 3'

qRT-PCR分析所使用的反应体系：1μl单链cDNA，5μl 2×Power SYBR Premix Ex Taq II(Takara,大连),3μl RNase free水,终浓度分别为0.5mM引物,添加双蒸水至10μl。反应在Bio-Rad real-time thermal cycling system中进行，使用的PCR条件为：首先在95℃变性1min，40个反应循环(在95℃下变性5s，在58℃下合成和延伸30s)，使用SYBR-Green检测基因的表达量，所有的反应重复三次。数据分析使用Bio-Rad CFX Manager software。同时用玉米18S特异引物进行qRT-PCR扩增作为内参。

(3)结果如图2所示。

结果表明，在玉米根茎叶中，两个剪切体均受到模拟盐和旱的PEG6000和NaCl的诱导表达，其中以剪切体2表达更为强烈。这说明ZmSep15-like受到了盐和旱的诱导表达，暗示可能参与了玉米W22的抗盐和抗旱的生理过程。

实施例3、玉米类硒蛋白15kD基因ZmSep15-like突变体F2家系的抗旱性、抗盐性与两个突变体纯系的抗盐性和抗旱性实验

3.1玉米W22ZmSep15-like突变体F2群体的建立

两种不同插入位点的突变体F3混合种子和野生型玉米W22由山东大学生命科学学院谭宝才教授馈赠。获得玉米种子种植在生命科学学院实验田中，待长出4～5片叶时对幼苗进行基因型鉴定，所使用的引物为：

Tir6 5‘AGAGAAGCCAACGCCAWCGCCTCYATTTCGTC 3’

和tir8，这是个兼并引物混合物

三对基因特异引物：

F1：5'TGGATCGGTCGTATCTCCC 3'

R1：5'TCAACAGTAACCACCCTCA 3'

F2：5'CGACCGTATCTGCATCTT 3'

R2：5'CAACAGTAACCACCCTCA 3'

F3：5'GGCTCCAGGCTTCAGTCA 3'

R3：5'CGATCCATATCTCCTCCC 3'

引物使用方法是三对基因特异引物载不插入突变子的情况下可以扩增大约为基因全长的片段，如果有插入子则无法扩增；Tir6和tir8是插入突变子上的正向引物序列，配合基因特异引物的反向序列可以扩增较小的片段。这样，扩增结果为一条较长的片段时，为野生型位点，如果有一大一小片段时，则为杂合基因型，如果仅有一个小片段时，则为纯合突变位点。扩增结果送商业公司测序确认。

玉米叶DNA的提取参照《分子克隆实验指南》标准程序，PCR的体系是：

进行PCR的条件是：预变性：94℃，时间为4min；变性：94℃，时间为45sec；退火：58.8℃，时间为1min；延伸：72℃，时间为1min；循环整个过程32次；最后72℃延伸10min，可保存至4℃。反应结束后，PCR产物于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。检测得到的突变体纯系待开花后，收集同时种植的野生型花粉，按照常规方法进行去雄和套袋授粉，成熟后收获得到F1，继续种植F1种子后，收获F2种子，得到的F2群体用于下面的抗逆性实验。

3.2ZmSep15-like突变体F2群体基因型确定和抗旱/抗盐性实验

首先使用2％(w/v)NaClO对F2群体玉米种子进行表面消毒处理，之后将种子排在饱和水的滤纸上，在28℃下培养3天。待萌发后幼苗移至1/2Hoagland培养液中继续培养至两叶一心期，取一段侧根按照《分子克隆实验指南》标准程序提取F₂个体的基因组DNA，之后按照3.1中的方法确定每一个个体的基因型。之后将幼苗移到含有20％(w/v)PEG6000和200mM>

在PEG所处理的F2群体43株个体中，发现32株野生型或杂合型的抗性好，11株突变体纯系对旱敏感(图3A)。χ2检测显示其遗传分离比(抗性：敏感)接近理论值3:1,符合单基因位点显性孟德尔遗传规律，结果表明ZmSep15-like控制了玉米的抗旱性状。

在NaCl所处理的F2群体54株个体中，野生型或杂合型40株表现抗性，14株突变体纯系表现敏感(图3B)。χ2检测显示其遗传分离比(抗性：敏感)接近理论值3:1,符合单基因位点显性孟德尔遗传规律，结果表明ZmSep15-like控制了玉米的抗盐性状。

3.3ZmSep15-like突变体抗盐和抗旱性实验

(1)两个F2突变体纯系基因表达分析

随机选取两个突变体纯系的种子，按照上述的方法进行萌发生长至2叶1心期，剪取底叶进行总RNA的提取、第一链反转和Q-PCR实验，所使用的引物为：

第一对引物

ZmSep15-like-1-F：5'TTCGTCAAGGACCAAGAGC 3'

ZmSep15-like-1-R：5'GAATAACGGGTTTCCACAT 3'

第二对引物

ZmSep15-like-2-F：5'CCGTTATTCTTATGGTTCGC 3'

ZmSep15-like-2-R：5'TGTCTAATTTCACTGGCTTCAC 3'

方法参照实施例2所描述的方法。

结果如图4所示，在所使用的两个突变体纯系中，ZmSep15-like的两个剪切体均不表达。

(2)两个突变体纯系的抗盐和抗旱性实验

材料处理参照实施案例3.2。

结果如图5和图6所示，显示两个突变体系均表现出对盐和旱的敏感，结果表明ZmSep15-like参与了玉米的抗盐和抗旱的生理活动。