海洋微生物CSP基因提高转基因玉米的抗旱和耐寒性

摘要

玉米(Zea mays L.)是我国重要的粮食作物和饲料来源。干旱和低温严重影响玉米的产量和品质。近年来，通过基因工程技术选育出抗逆玉米新品种已经成为当前育种的研究趋势。冷激蛋白是广泛存在于细菌、植物和动物中的一类高度保守的核酸结合蛋白，可作为RNA分子伴侣，参与生长发育和非生物胁迫应答等细胞生理活动，增强细胞抵抗外界逆境胁迫的能力。目前已有过表达冷激蛋白基因提高植物抗逆性的研究，但基因来源仅局限于几种已知微生物或植物。海洋微生物99%是不可培养的，本实验室前期从海洋微生物宏基因组中克隆得到一个冷激蛋白基因（CSP），将其构建到植物表达载体上并转入拟南芥，生理检测结果表明CSP基因的转入提高了拟南芥的抗旱和耐寒特性。 本研究利用农杆菌介导的幼胚侵染法将重组质粒Ubi::CSP转入玉米，经过共培养、恢复、筛选、分化和再生等过程共得到9个阳性转化事件。对T0代转化植株进行PCR检测及bar试纸条检测，结果表明目的基因CSP和标记基因bar均成功转入。将T0代转化植株与玉米骨干自交系郑58进行杂交，对F1代玉米进行半定量RT-PCR检测，结果表明9个株系均有表达，选取表达量较高的L4、L5和L9株系进行Southern杂交和卡平方检验。Southern杂交结果表明CSP基因已经整合到玉米的基因组中且三个株系均为单拷贝。卡平方检验结果表明后代基因分离比符合1:1的孟德尔分离定律。因此选择这3个株系进行后续苗期抗旱耐寒生理实验。 苗期生理检测结果表明：干旱胁迫2w后，转基因玉米的生长状况明显优于野生型玉米，其生物量、根长、叶片相对含水量和超氧化物歧化酶活性均高于野生型玉米，丙二醛含量则低于野生型玉米，表明与野生型玉米相比，转基因植株具有更好的抗旱性；低温胁迫3d后，转基因玉米的叶绿素含量和超氧化物歧化酶活性均高于野生型玉米，而丙二醛含量则低于野生型玉米，表明与野生型玉米相比，转基因玉米具有更好的耐寒性。选取表现较好的L9株系进行田间抗旱实验。 田间试验结果表明：正常生长条件下，转基因与野生型玉米各农艺性状无显著差异；干旱胁迫后，转基因玉米与野生型玉米的株高、叶面积、穗粗、穗行数和百粒重无显著差异，穗位显著低于野生型玉米，穗长、行粒数和穗重则显著高于野生型玉米。由此可以推测，干旱胁迫下，转基因玉米通过增加穗长与行粒数从而增加了总粒数使穗重增加。 上述结果表明，CSP基因在玉米中的过表达能够提高转基因玉米的抗旱性和耐寒性。

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摘 要

Abstract

引 言

1.1 干旱、低温对玉米的影响

1.1.1 干旱、低温对玉米生产的影响

1.1.2 干旱对玉米生长的影响

1.1.3 低温冷害对玉米生长的影响

1.2 玉米抗旱耐寒基因工程研究进展

1.2.1 转基因玉米产业现状

1.2.2 玉米遗传转化方法

1.2.3 转基因玉米抗旱耐寒研究现状

1.3 冷激蛋白的研究进展

1.3.1 冷激蛋白的结构

1.3.2 冷激蛋白的功能

1.3.3 冷激蛋白的应用

1.4 目的与意义

2 过表达CSP玉米的获得及其遗传分析

2.1 实验材料及仪器设备

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.2 实验方法

2.2.1 玉米转化培养基配制

2.2.2 玉米转化流程

2.2.3 T0代转基因玉米的PCR检测

2.2.4 T0代转基因玉米的bar试纸条检测

2.2.5 F1代转基因玉米的RT-PCR检测

2.2.6 F1代转基因玉米Southern杂交检测

2.2.7 F1代转基因植株的遗传分析

2.3 结果与分析

2.3.1 转基因玉米植株的获得

2.3.2 T0代转化植株的PCR检测结果

2.3.3 T0代转化植株的bar试纸条检测结果

2.3.4 F1代转基因植株的半定量RT-PCR检测结果

2.3.5 F1代转基因植株Southern杂交检测结果

2.3.6 F1代转基因植株遗传分析

2.4 讨论

2.5 小结

3 过表达CSP玉米的抗旱和耐寒性分析

3.1 实验材料及仪器设备

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验试剂

3.2 实验方法

3.2.1 转基因玉米的干旱和低温胁迫处理

3.2.2 转基因玉米的生理指标检测

3.3 结果与分析

3.3.1 干旱胁迫对转基因玉米的影响

3.3.2 低温胁迫对转基因玉米的影响

3.4 讨论

3.5 小结

4 过表达CSP玉米的田间抗旱性分析

4.1 试验地点

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.3.1 田间最大持水量的测定

4.3.2 田间试验设计和材料种植

4.3.3 田间农艺性状测定

4.4 结果与分析

4.4.1 田间试验处理结果

4.4.2 植株性状统计结果

4.4.3 穗部性状统计结果

4.5 讨论

4.6 小结

结 论

展 望

参 考 文 献

附录A 缩略语

附录B 论文中所用的DNA Marker

附录C 论文中所用的重组植物表达载体图谱

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

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