一种拟无枝酸菌在降解炔雌醚中的应用

摘要

本发明公开了一种拟无枝酸菌在降解炔雌醚中的应用，所述的应用以炔雌醚为底物添加至拟无枝酸菌经发酵培养获得的含菌发酵液中，在28‑37℃、150‑250rpm下进行降解反应，降解结束后，获得炔雌醚降解液；其菌液能对炔雌醚进行降解，5天对50mg/L炔雌醚降解达100％。

说明书

(一)技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.WP1菌株在炔雌醚高效降解中的应用。

(二)背景技术

炔雌醚(Quinestrol)是一种典型的人工合成雌激素，用于避孕，用来抑制青藏高原鼠兔的大量繁殖是重要的环境内分泌干扰物之一(Endocrine-disruptingcompounds,EDCs)，会通过人类排泄物和污水排放所产生的废物进入水体环境，最后在生物体内积累并通过细胞毒性、遗传毒性和免疫毒性对生物体产生致癌、致畸、致突变作用，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁。

炔雌醚是作为一种常用的人工合成雌激素药物，它具有雌激素的四环母核结构，一个苯环基团、两个环己烷基团、一个环戊烷基团，其中苯环对人类雌激素受体有较高亲和力(Yu Changping,Rula A Deeb,Chu Kunghui.Microbial degradation of steroidal estrogens[J].Chemosphere,2013,91(9):1225-1235)。炔雌醚是由炔雌醇的3号位的碳元素上羟基取代基的氢换成了环戊烷，又称为3-环戊醚雌二醇。它是一种作用较强的口服长效雌激素，其活性为炔雌醇的4倍，并且具有强大的雌激素效应。关于炔雌醚口服增效的机理，曾有动物实验证明，炔雌醚在被机体吸收后能储存在脂肪组织和脑组织内，然后缓慢释放，从而发挥长效作用(MELI A,WOLFF A,HONRATH W L.The mechanism by which 3-etherification with cyclopentyl alcohol enhances the oral activity of ethynylestradiol[J].Steroids,1963,2(4):417-424)。它主要通过下丘脑一垂体水平抑制促性腺激素的释放，从而抑制排卵。炔雌醚在人体内的排泄很慢，服药后100天，尿中仍有微量排泄(WILLIAMS K I,LAYNE D S,HOBKIRK R,et al.Metabolism of doubly labelled ethynylestradiol-3-cyclopentyl ether in women[J].Steroids,1967,9(3):275-287)。因此炔雌醚通过人类排泄物和污水排放所产生的废物进入水体环境(Fu Heping,Zhang Jinwei,Shi Dazhao,et al.Effects of levonorgestrel-quinestrol(EP-1)treatment on Mongolian gerbil wild populations:a case study[J].Integrative Zoology,2013,8(3):277-284)。而在pH不同的水中，炔雌醚的半衰期从148.1-316.6天不等，炔雌醚在自来水、池塘水和河水90天中降解率分别为49％、63％、77％(Tao Tang,Li Pingliang,Luo Laixin,et al.Development and validation of a HPLC method for determination of levonorgestrel and quinestrol in rat plasma[J].Biomedical Chromatography,2010,24(7):706-710)。基于以前的对炔雌醚和对内分泌干扰物的雌激素活性的研究，炔雌醚是环境中最重要的内分泌干扰物之一(ODELL W D,MOLITCH M E.The Pharmacology of Contraceptive Agents[J].Annual Review of Pharmacology,1974,14:413-434)。低浓度的炔雌醚在环境中可以改变女性与男性比率，并导致种群崩溃，对环境的影响极其重大。现对炔雌醚的降解研究仅停留在光降解，且降解缓慢，本发明首次对炔雌醚进行生物降解，并能在短时间内得到较高的降解率。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一株可降解炔雌醚的菌株及其应用。

本发明技术方案为：

本发明提供一种拟无枝酸菌在降解炔雌醚中的应用，具体所述的应用以炔雌醚为底物添加至拟无枝酸菌经发酵培养获得的含菌发酵液中，在28-37℃、150-250rmp(优选30℃、180rmp)下进行降解反应，降解结束后，获得炔雌醚降解液。

进一步，所述底物终浓度为10-130mg/L发酵液。

进一步，所述发酵液中菌体干重浓度为1.0-2.5g/L。

进一步，所述含菌发酵液按如下步骤制备：

(1)斜面培养

将拟无枝酸菌接种至斜面培养基中，于30℃的恒温培养箱中培养至出现单菌落，获得斜面菌落；所述斜面培养基终浓度组成为：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.3；

(2)种子培养

将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃，180r/min的摇床中进行振荡培养48h，获得种子液；种子培养基终浓度组成：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L，溶剂为去离子水，pH 7.3；

(3)发酵培养

将种子液以体积浓度10％的接种量接种至发酵培养基中，在30℃，180r/min条件下发酵培养2-3天，获得含菌发酵液；所述发酵培养基终浓度组成：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L，溶剂为去离子水，pH 7.3。

本发明所述优选拟无枝酸菌，拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)WP1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10738，保藏日期：2015年04月23日，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，邮编100101。该菌株属于放线菌类；该菌株在发酵固体培养基上生长时为圆形、白色、直径约0.1cm的干燥菌落。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明首次提出炔雌醚生物降解，并提供了一种利用拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.WP1高效降解炔雌醚的方法，拟无枝酸菌WP1菌液5天对50mg/L炔雌醚降解达100％。

(四)附图说明

图1是Amycolatopsis sp.WP1的平板培养基菌落图片。

图2是Amycolatopsis sp.WP1的菌体形态电镜图片。

图3是炔雌醚的标准曲线图。

图4是Amycolatopsis sp.WP1在不同浓度的炔雌醚环境中耐受5天的降解图。

图5是Amycolatopsis sp.WP1对50mg/L炔雌醚耐受5天的降解曲线图。

图6是Amycolatopsis sp.WP1对100mg/L炔雌醚耐受10天的降解曲线图。

(五)具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

(1)培养基：

筛选无机盐培养基：Na₂HPO₄>2PO₄>3>4Cl>4·7H₂O>2>4·7H₂O>

斜面培养基：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.3；

(2)菌株的筛选与分离纯化

从西南印度洋63.50E，27.89S，2945米以下的泥土样品中筛选具有炔雌醚降解能力的菌株。土样以10％的体积分数加入到以炔雌醚(终浓度为100mg/L)为唯一碳源的筛选无机盐培养基中，置于30℃，180r/min的摇床中培养5d后，转接于新鲜的以炔雌醚(终浓度为100mg/L)为唯一碳源的筛选无机盐培养基内培养5d左右。上述操作重复7次后，采用稀释涂布法涂布于炔雌醚(终浓度为100mg/L)为唯一碳源的筛选无机盐固体培养基上，30℃培养箱培养3-5天后挑取较大的菌落进行划线分离、纯化，最后将纯菌株接种在斜面培养基上，培养后于4℃冰箱冷藏，并命名为菌株WP1。

(3)菌株WP1的形态学观察与分子生物学鉴定

菌体WP1在电镜显微镜下观察结果如图2所示。对菌株WP1进行分子生物学鉴定，NCBI BLAST 16s rRNA序列搜索结果与Amycolatopsis mausensis KT2025(T)菌株同源性98.58％，结合生理生化特征，结果显示菌株WP1为拟无枝菌酸菌属，命名为Amycolatopsis sp.WP1，于2015年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.10738。

实施例2

(1)将拟无枝酸菌WP1接种至斜面培养基，在30℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.3；

(2)将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃，180r/min的摇床中进行振荡培养48h，获得种子液；种子培养基终浓度组成：酵母提取物4g，麦芽提取物10g，葡萄糖4g，蒸馏水1000mL，pH 7.3，培养基在121℃高压蒸汽灭菌器中灭菌20min中备用；

(3)用移液管移取10mL种子液于新鲜的100mL发酵培养基中，置于30℃，180r/min的摇床中进行振荡发酵培养48h后，获得发酵液(菌体干重为1.0g/L)，向发酵液中加入终浓度50mg/L的炔雌醚进行降解，每隔24h取样进行HPLC检测炔雌醚的残留量。发酵培养基终浓度组成：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L，溶剂为去离子水，pH 7.3。

(4)炔雌醚的标准曲线

准确称取0.05g炔雌醚，用甲醇定容至10mL配成母液，分别取母液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL定容至10mL，得到浓度分别为0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL，在280nm下进行HPLC，以峰面积为纵坐标，炔雌醚浓度为横坐标，得到标准曲线，结果见图3。

(5)炔雌醚测试

使用岛津液相(HPLC)进行，紫外检测，检测波长280nm，柱子Phenomenex Luna 5u C18,5μm,4.6×250mm(Phenomenex,USA)。

(6)炔雌醚降解率计算

C₀是指炔雌醚的初始浓度，C_*是指降解结束时炔雌醚的浓度。

实施例3

将实施例2步骤(3)中发酵培养24h后，向发酵液(菌体干重为1.0g/L)中添加底物，底物炔雌醚终浓度分别改为10mg/L、30mg/L、50mg/L、60mg/L、80mg/L、90mg/L、100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L，在30℃、180r/min的摇床中振荡培养，模拟降解，5d后取出，用2倍的乙酸乙酯进行萃取，以甲醇-水为流动性进行液相分析，探究Amycolatopsis sp.WP1菌株对炔雌醚的耐受性，其它操作同实施例2。如图4，当炔雌醚浓度为50mg/L时，其降解率可达100％。

实施例4

参照实施例2步骤(3)，用移液管移取10mL种子液于新鲜的250mL的发酵培养基中，置于30℃，180r/min的摇床中进行振荡发酵培养48h后，获得发酵液(菌体干重为1.0g/L)，向发酵液中加入终浓度50mg/L的炔雌醚进行降解，在30℃、180r/min的摇床中振荡培养5d，其它操作同实施例2，结果见图5，对炔雌醚的降解达到100％。

实施例5

参照实施例2步骤(3)，用移液管移取10mL种子液于新鲜的100mL的发酵培养基中，置于30℃，180r/min的摇床中进行振荡发酵培养48h后，获得发酵液(菌体干重为1.0g/L)，向发酵液中加入终浓度100mg/L的炔雌醚进行降解，在30℃、180r/min的摇床中振荡培养10d，其它操作同实施例2，结果见图6，对炔雌醚的降解达到85.96％。