岩生忍冬总多糖提取物的制备方法及其用途

摘要

本发明提供了一种岩生忍冬总多糖的制备方法，以及由该方法得到的岩生忍冬总多糖提取物产品；同时，本发明还提供了该提取物用于制备预防和治疗细菌性感染药物的用途。本发明制备方法得到的岩生忍冬总多糖尤其适用于制备成兽用药，用于牦牛和藏绵羊细菌性腹泻等疾病的治疗。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及藏兽药岩生忍冬总多糖提取物及其提取工艺和用途。

背景技术

岩生忍冬(Lonicera rupicola Hook.f.et Thomson.)，又名西藏忍冬，为忍冬科忍冬属，是藤本药用植物，主要产于宁夏、甘肃、青海东南部、四川西部、云南西北部及西藏东部至西南部，生于高山灌丛草甸、流石滩边缘、林缘河滩草地或山坡灌丛中，全植物均可入药。

畜牧业是上述地区，尤其是四川省西北地区(川西北)甘孜、阿坝等地的主要农业形式之一。当地的畜禽常见病、多发病、肆虐发病，如牦牛、藏绵羊细菌性腹泻病和寄生虫疾病猖獗等，严重影响了当地的畜牧业发展。

川西北阿坝和甘孜两州藏兽医结合当地藏药资源优势选择单方药物或药物组合进行防治具有一定经验，如原四川省汶川地区使用验方(夏枯草、金银花、菊花、千里光和荆芥组方)治疗牦牛结膜炎和角膜炎。

金银花和岩生忍冬均为忍冬属植物，金银花在川西北高原地区可用于畜禽常见疾病的防治，而对岩生忍冬的利用却没有报道。中国药典记载的金银花(山银花)主产于我国北方、南方，西部地区使用金银花在成本和来源上均受到一定的限制。而岩生忍冬主产于川西北等西部地区，这些地区具有丰富的岩生忍冬植物资源。目前川西北牧区等对岩生忍冬的开发和利用率都较低，如何有效发挥岩生忍冬的药物活性、扩展和升级治疗用途和方式，可为以岩生忍冬为代表的藏兽药新药研发奠定基础，为川西北等畜牧业的健康、持续发展保驾护航，并为藏兽药的开发利用及产业化奠定基础。

发明内容

本发明目的包括：

提供一种岩生忍冬总多糖的提取工艺；

提供一种岩生忍冬总多糖提取物产品；

提供一种岩生忍冬总多糖提取物的用途。

具体的，本发明提供了一种岩生忍冬总多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)岩生忍冬粉碎；可过30-200目筛，如过40目、50目、80目、100目筛或40目、50目、80目筛、100目药典筛。

(2)取粉碎的岩生忍冬，按重量比计，以1:(20～40)的料液比加入水，于70～90℃浸提1～3次，每次浸提时间45～75分钟，合并浸提上清液，浓缩上清液，得岩生忍冬水提取；

(3)将步骤(2)得到的浓缩物进行1-5次醇沉，优选为3次。

进一步的，本发明提供了一种岩生忍冬总多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)岩生忍冬粉碎；如可粉碎至过40目、50目、80目、100目筛或40目、50目、80目筛或100目药典筛。

(2)取步骤(1)粉碎的岩生忍冬，以重量比计，按1:40的料液比加入水，于90℃浸提3次，每次浸提时间45分钟，将多次浸提的上清液合并，在70℃下浓缩；

(3)将步骤(2)得到的浓缩物进行1-5次醇沉，优选为3次。

以及，进一步的提供了一种岩生忍冬总多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)岩生忍冬粉碎；可粉碎至过40目、50目、80目、100目筛或40目、50目、80目筛或100目药典筛。

(2)取步骤(1)粉碎的岩生忍冬，以重量比计，按1:20的料液比加入水，于90℃浸提2次，每次浸提时间60分钟，将多次浸提的上清液合并，在70℃下浓缩；

(3)将步骤(2)得到的浓缩物进行1-5次醇沉，优选为3次。

以及，进一步的提供了一种岩生忍冬总多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)岩生忍冬粉碎；可粉碎至过40目、50目、80目、100目筛或40目、50目、80目筛或100目药典筛。

(2)取步骤(1)粉碎的岩生忍冬，按1:20(重量比)料液比加入蒸馏水，于80℃浸提3次，每次浸提时间75分钟，将多次浸提的上清液合并，在70℃下浓缩；

(3)将步骤(2)得到的浓缩物进行1-5次醇沉，优选为3次。

以及，进一步的提供了一种岩生忍冬总多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)岩生忍冬粉碎；可粉碎至过40目、50目、80目、100目筛或40目、50目、80目筛或100目药典筛。

(2)取步骤(1)粉碎的岩生忍冬，按1:30(重量比)料液比加入蒸馏水，于90℃浸提1次，每次浸提时间75分钟，将上清液在70℃下浓缩；

(3)将步骤(2)得到的浓缩物进行1-5次醇沉，优选为3次。

上述制备方法所述的步骤(3)，优选的醇沉方法为：

取步骤(2)制备的浓缩物，于水中搅拌均匀，加入体积浓度为70～99％的乙醇水溶液，0～10℃放置5-24小时，离心，弃上清液；

向沉淀中加入体积浓度为60～90％的乙醇水溶液，于水中搅拌均匀，离心，弃上清液；

再向沉淀中加入无水乙醇，搅拌均匀，离心，弃上清液，得沉淀；沉淀可进行干燥。

进一步的，步骤(3)所述醇沉为：取步骤(2)制备的岩生忍冬水提物，加入蒸馏水搅拌均匀后，加入95％乙醇，4℃冰箱内放置过夜；取放置过夜的待用液放入离心管中，离心后弃去上清液，往沉淀中加入85％乙醇搅拌均匀离心，弃去上清液，沉淀加入95％乙醇搅拌均匀离心，弃去上清液，沉淀加入无水乙醇搅拌均匀，离心弃去上清液，取沉淀得总多糖；将总多糖于60℃的烘干4个小时，得岩生忍冬总多糖提取物。

此外，本发明还提供了一种岩生忍冬总多糖提取物；以及该岩生忍冬总多糖提取物在制备预防和治疗细菌性感染药物中的用途，所述细菌如大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、普通变形杆菌、肺炎克雷伯氏、痢疾志贺氏菌、中间耶尔森氏菌、粪肠球菌、屎肠球菌、阪崎肠杆菌和/或阴沟肠杆；所述药物优选为兽药；所述兽，优选为牦牛、藏绵羊、藏鸡，以及其他藏区主要经济动物等。

岩生忍冬可自行采集和炮制，采集后可将岩生忍冬切段3-5cm后置通风处阴干；也在药材饮片市场购买得到。岩生忍冬为忍冬科忍冬属植物岩生忍冬的全草。

使用本发明可以达到以下有益效果：本发明充分利用了川西北等西部地区的植物资源优势，为川西北常见藏药材忍冬科忍冬属植物岩生忍冬提供了有益的医疗用途，并筛选出良好的提取制备工艺，以及寻找到岩生忍冬抑菌/抗菌活性最强的细菌类型，为川西北禽畜常见病和多发病的防治提供了有益的选择，并为后续以岩生忍冬为核心药物，研制防治牦牛细菌性腹泻病等川西北禽畜疾病奠定良好基础。

具体实施方式

岩生忍冬采自四川省阿坝藏族羌族自治州红原县和若尔盖县，经鉴定为忍冬科忍冬属植物岩生忍冬(Lonicera rupicola Hook.f.et Thomson.)。岩生忍冬也可在中药材或饮片市场购买得到。

实施例1岩生忍冬的水提工艺

将岩生忍冬粉碎，过筛；称取岩生忍冬5g，按1:20(重量比)料液比加入蒸馏水，于70℃浸提1次，每次浸提时间45分钟，将上清液在70℃下浓缩。

实施例2岩生忍冬的水提工艺

将岩生忍冬粉碎，过筛；称取岩生忍冬5g，按1:30(重量比)料液比加入蒸馏水，于80℃浸提2次，每次浸提时间45分钟，将多次浸提的上清液合并，在70℃下浓缩。

实施例3岩生忍冬的水提工艺

将岩生忍冬粉碎，过筛；取岩生忍冬5g，按1:40(重量比)料液比加入蒸馏水，于90℃浸提3次，每次浸提时间45分钟，将多次浸提的上清液合并，在70℃下浓缩。

实施例4岩生忍冬的水提工艺

将岩生忍冬粉碎，过筛；称取岩生忍冬5g，按1:30(重量比)料液比加入蒸馏水，于70℃浸提3次，每次浸提时间60分钟，将多次浸提的上清液合并，在70℃下浓缩。

实施例5岩生忍冬的水提工艺

将岩生忍冬粉碎，过筛；称取岩生忍冬5g，按1:40(重量比)料液比加入蒸馏水，于80℃浸提1次，每次浸提时间60分钟，将上清液在70℃下浓缩。

实施例6岩生忍冬的水提工艺

将岩生忍冬粉碎，过筛；称取岩生忍冬5g，按1:20(重量比)料液比加入蒸馏水，于90℃浸提2次，每次浸提时间60分钟，将多次浸提的上清液合并，在70℃下浓缩。

实施例7岩生忍冬的水提工艺

将岩生忍冬粉碎，过筛；称取岩生忍冬5g，按1:40(重量比)料液比加入蒸馏水，于70℃浸提2次，每次浸提时间75分钟，将多次浸提的上清液合并，在70℃下浓缩。

实施例8岩生忍冬的水提工艺

将岩生忍冬粉碎，过筛；称取岩生忍冬5g，按1:20(重量比)料液比加入蒸馏水，于80℃浸提3次，每次浸提时间75分钟，将多次浸提的上清液合并，在70℃下浓缩。

实施例9岩生忍冬的水提工艺

将岩生忍冬粉碎，过筛；称取岩生忍冬5g，按1:30(重量比)料液比加入蒸馏水，于90℃浸提1次，每次浸提时间75分钟，将上清液在70℃下浓缩。

实施例10醇沉工艺分离岩生忍冬水提物的总多糖(粗多糖)

分别取实施例1-9制备得到的岩生忍冬水提物，冷却后加入10mL蒸馏水搅拌均匀后，加入40mL 95％乙醇，4℃冰箱内放置过夜。取放置过夜的待用液放入离心管中，离心后弃去上清液，往沉淀中加入85％乙醇搅拌均匀离心，弃去上清液，沉淀加入95％乙醇搅拌均匀离心，弃去上清液，沉淀加入无水乙醇搅拌均匀，离心弃去上清液，将装有粗多糖的离心管放入60℃的鼓风干燥箱中烘干4个小时，得岩生忍冬粗多糖提取物。由实施例1-9水提物分离得到的岩生忍冬总多糖的干膏率见表1。

由实施例1水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖称岩生忍冬总多糖提取物1；由实施例2水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖称岩生忍冬总多糖提取物2；由实施例3水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖称岩生忍冬总多糖提取物3；由实施例4水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖称岩生忍冬总多糖提取物4；由实施例5水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖称岩生忍冬总多糖提取物5；由实施例6水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖称岩生忍冬总多糖提取物6；由实施例7水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖称岩生忍冬总多糖提取物7；由实施例8水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖称岩生忍冬总多糖提取物8；由实施例9水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖称岩生忍冬总多糖提取物9；

表1实施例1-9水提物经醇沉分离得到的岩生忍冬总多糖的干膏率

实施例11忍冬总多糖含量测定

含量测定方法：以葡萄糖标准曲线为标准，根据蒽酮硫酸法测定岩生忍冬中糖的总含量。称取20mg干浸膏溶于100mL蒸馏水中，待用。取4支试管，编号1-4。1号加入0.4mL待测溶液，不加蒸馏水。从1号管中取出0.2mL加入2号管，用蒸馏水补足0.4mL，后面2-4号试管按2号试管稀释操作方法依次2倍倍比稀释。然后向以上每个试管内依次加入2mL蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出自来水浴中冷却10min后，分光光度计测625nm处吸光值大小，测吸光度值，带入标准曲线，求出不同提取组合中岩生忍冬总糖含量，平行做3次重复。

取实施例10制备的岩生忍冬总多糖1-9，按本实施例方法分别测定其忍冬总多糖含量，含量测定结果见表2。

表2岩生忍冬总多糖提取物的总多糖含量

实施例12岩生忍冬总多糖抑菌活性实验

采用微量稀释法和纸片法评价岩生忍冬总多糖提取物对10种标准菌株的抗菌活性。

①岩生忍冬总多糖稀释液的制备：取实施例6制备的岩生忍冬总多糖提取物，用去离子水溶解均匀，过滤除菌后放置待用。

②实验菌株的选择：14种标准菌株购自中国微生物所或中国兽药监察所，菌株包括大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞杆菌CGMCCPa3、普通变形杆菌CGMCC1.491、肺炎克雷伯氏菌CGMCC1.1062、痢疾志贺氏菌CGMCC1.1869、中间耶尔森氏菌CGMCC1.6197、粪肠球菌ATCC25912、屎肠球菌ATCC35667、阪崎肠杆菌CGMCC1.6765、阴沟肠杆菌阴沟亚种CGMCC1.2022。

③微量稀释法测定组方药物抗菌效果

实验步骤及结果判定参考标准美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法操作程序进行，具体操作步骤如下：在96孔细胞培养板1-12列各孔加100μLMH肉汤，然后分别在第1-3排的第1孔加入100μL岩生忍冬提取物，依次倍比稀释至第11列，然后第1-11列各孔加入100μL制备好的菌悬液。每个菌株在1个96孔板上进行实验。37℃培养16-24h后，计算MIC。实验孔号及对应浓度如下表3所示。

表3实验孔号中岩生忍冬总多糖提取物的实验浓度表

孔号岩生忍冬提取浓度186.20mg/mL243.10mg/mL321.55mg/mL410.78mg/mL55.39mg/mL62.69mg/mL71.34mg/mL80.67mg/mL90.34mg/mL100.17mg/mL110.08mg/mL120mg/mL

试验结果如表4所示：从表中可以看出，岩生忍冬总多糖对大多数实验菌株表现出不同程度的抗菌活性，其中岩生忍冬总多糖对普通变形杆菌CGMCC1.491、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌CGMCC1.1869、中间耶尔森氏菌CGMCC1.6197、阪崎肠杆菌CGMCC1.6765和粪肠球菌ATCC25912的抗菌活性最强，对肺炎克雷伯氏菌CGMCC1.1062和铜绿假单胞杆菌CGMCCPa3的抗菌活性居中，对肠沙门氏菌亚种CGMCC1.10754和阴沟肠杆菌阴沟亚种CGMCC1.2022的抗菌活性较弱。

表4岩生忍冬多糖提取物对10种菌株的体外抑菌效果

注：“+”表示孔内有细菌生长，“_”表示孔内无细菌生长。