一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法

摘要

本发明涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法，包括：将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液中获得荚膜多糖溶液，所述荚膜多糖溶液与CDAP接触活化获得活化后溶液，将所述活化后溶液与载体蛋白接触结合获得肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物。本发明所提供的方法对CDAP法进行改进，采用硼酸盐缓冲液溶解肺炎链球菌荚膜多糖，不需要在反应中调节pH值，化学试剂使用减少，制备工艺简单，生产效率高。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药化学领域，具体涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)为革兰氏阳性细菌，可导致相当高的发病率和死亡率，引起肺炎、脑膜炎、中耳炎和菌血症等疾病。现已发现近百种肺炎链球菌血清型，而只有其中20几种有致病性。肺炎链球菌荚膜多糖为其主要毒力决定因素，因为荚膜不但保护细菌内表面不受补体影响，而且其本身具弱免疫原性。

2000年2月肺炎链球菌多糖蛋白结合疫苗Prevnar首先在美国得到许可，随后国际市场上陆续出现了10价、11价、13价肺炎链球菌多糖蛋白结合疫苗。肺炎链球菌结合疫苗在儿童中普遍接种，疫苗所包含的血清型致侵入性肺炎链球菌疾病显著减少。

制备结合物所常用的活化多糖方法大致有：溴化氰(CNBr)活化法，CDAP活化法，水溶性碳化二亚胺(EDC)法。

CDAP活化法是先在多糖羟基上形成氰酸酯，通过异脲键将多糖与载体蛋白质连接起来。有资料表明，CDAP法能快速有效地活化肺炎链球菌多糖。CDAP活化多糖的关键参数是浓度和pH值，传统的CDAP法，是采用酸碱试剂调节维持反应中的pH值完成多糖的活化反应，用己二胺、己二酰肼为间隔基，在一定pH值下与载体蛋白质结合，并以酸碱试剂维持结合反应中的pH值，反应过程中需要对反应的pH和温度进行连续监控，操作步骤多，效率低、反应可控制性差。

发明内容

本发明的目的是简化肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物制备的过程，提供一种简便高效的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法，包括：将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液中获得荚膜多糖溶液。

进一步的，所述方法还包括，将荚膜多糖溶液与CDAP接触活化获得活化后溶液，将所述活化后溶液与载体蛋白接触结合获得肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物。

具体的，本发明对于将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液的方式没有特别的限制，只要能够形成充分溶解、性状均一的溶液即可。例如可以在室温下，搅拌溶解。

其中，所述荚膜多糖溶液与CDAP接触活化的步骤包括：在15-25℃下将CDAP按比例加入荚膜多糖溶液中，活化2-4min。

在本发明的一种实施方式中，可以将CDAP溶于乙腈或注射用水中，形成CDAP浓度为100-200mg/mL的储备液。

在活化步骤结束后，室温条件下按比例加入载体蛋白，搅拌反应2-4h，获得肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物。

在本发明的一种实施方式中，在接触结合步骤后，可以将体系经氯化钠溶液透析、Sepharose 4FF凝胶层析柱进行纯化，收集kD值0-0.3的分离峰得到纯化后的产物。

优选的，所述硼酸盐缓冲液中硼酸的浓度为0.2-0.3mol/L，pH值为8.5-9.5。特别优选的，所述硼酸盐缓冲液中硼酸根的浓度为0.25mol/L，pH值为9.0-9.2。

可选的，所述硼酸盐缓冲液的制备方法包括将硼酸和盐溶于水后用酸碱碱调节pH值。其中，所述盐可以为氯化钾或氯化钠，在所述硼酸盐缓冲液中，硼酸根离子的浓度与氯离子或钠离子的浓度的比例可以为0.8-1.2：1。

在本发明的一种实施方式中，所述硼酸盐缓冲液是按照以下方式配制的：硼酸盐缓冲液浓度为0.25mol/L，称取15.458g硼酸和18.638g氯化钾，加入注射用水950mL，用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至9.0-9.2，补加注射用水至1000mL即可。

优选的，所述荚膜多糖溶液中荚膜多糖的浓度为6-32mg/mL。

可选的，所述荚膜多糖为水解后kD值为0.2-0.65的荚膜多糖，血清型包括但不限于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F型。

可选的，当所述荚膜多糖的血清型为1、2、3、8、12F、15B、17F、18C、23F或33F型时，荚膜多糖溶液中荚膜多糖的浓度为6-20mg/mL。

可选的，当所述荚膜多糖的血清型为4、5、6A、6B、7F、9N、9V、10A、11A、14、19A、19F、20或22F型时，荚膜多糖溶液中荚膜多糖的浓度为15-32mg/mL。

需要理解的是，以上所述的荚膜多糖浓度均为单一血清型的荚膜多糖浓度，并非为多种血清型荚膜多糖的总浓度。

在本发明中，上述列举的荚膜多糖的血清型的名称均为按照本领域技术人员所公知的标准进行分类所确定的本领域所公知的血清型，并可以通过多种途径(例如购买、赠与等方式)获得。本发明对于产生各种血清型的菌株没有特别的限制，可以为本领域所有目前已知或未知的生产特定血清型荚膜多糖的肺炎链球菌菌株。

可选的，当荚膜多糖的血清型为3、4、8、9N、9V、11A、14、18C、19F、23F或33F型时，荚膜多糖与CDAP的质量比为1：0.1-0.3。

可选的，当荚膜多糖的血清型为1、2、5、6A、6B、7F、10A、12F、15B、17F、19A、20或22F型时，荚膜多糖与CDAP的质量比为1:0.2-0.6。

其中，载体蛋白为破伤风类毒素TT和/或白喉类毒素DT。

其中，相对于所述荚膜多糖，载体蛋白的用量可以按照以下比例确定，多糖：蛋白质量比为1：1-2.5。

利用本发明所提供的方法制备获得的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物也属于本发明的保护范围。

具体的，在本发明的一种实施方式中，每种荚膜多糖溶液中只含有一种血清型的荚膜多糖，荚膜多糖溶液与载体蛋白结合后获得单价的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物。当需要制备含有多个肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的多价疫苗时，可以利用本领域技术人员所公知的方法将单价的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物按一定比例进行混合。

特别值得注意的是，在本发明所提供的方法中，不需要对所述荚膜多糖溶液的pH值进行调节后再进行接触活化，接触活化的过程中也不再对体系的pH值进行调整，在接触活化后，不需要对所述活化后溶液进行pH值的调节，也不使用间隔基(例如己二胺、己二酰肼)，直接将所述活化后溶液与载体蛋白进行接触结合，接触结合过程中不需要对体系的温度和pH值进行监测和调整，结合2-4h后进行柱纯化即可以完成肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备。与现有技术相比极大的提高了制备的效率，缩短了生产时间，减少了生产人员和试剂的投入。

本发明所提供的方法，通过将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液中使得反应体系获得了合适的理化环境，这种合适的理化环境允许在后续制备过程中不需要再对体系的pH、温度进行监测和调节，不需要添加额外的试剂以保证制备过程顺利进行；这种合适的理化环境使得后续的活化和结合步骤能够在稳定的条件下进行，避免了活化和结合步骤因为部分组分的变化所引起的体系理化环境的变化，极大了简化了肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备过程。

采用本发明制备的结合物原液，其游离多糖含量均小于30％，所得结合物，具有肺炎链球菌多糖的抗原性和免疫原性。

本发明所述的制备方法或利用本发明所提供的方法制备的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物可应用于制备单价或多价肺炎链球菌结合疫苗(例如13价疫苗)。

所述单价或多价肺炎链球菌结合疫苗中可包含基于铝的佐剂。例如，所述铝佐剂可以为氢氧化铝、磷酸铝或明矾。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的硼酸盐缓冲液按照以下方式配置：称取硼酸和氯化钾，加入注射用水，用氢氧化钠溶液调pH后补加注射用水至1000mL即可。以下硼酸盐缓冲液的浓度以硼酸根计。

以下实施例中使用的CDAP指的是将CDAP溶于乙腈中形成的CDAP浓度为100mg/mL的储备液。

以下实施例中使用的各型肺炎链球菌荚膜多糖，均来自北京民海生物科技有限公司。

实施例1

本实施例用于说明1、8、9V、10A、19A、19F、20型肺炎链球菌多糖蛋白结合物的制备。

用浓度0.25mol/L，pH值为9.0-9.2的硼酸盐缓冲液(称取15.458g硼酸和18.638g氯化钾，加入注射用水950mL，用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至9.0-9.2，补加注射用水至1000mL即可。(根据中华人民共和国药典2015年版第三部通则8004配制。))，按表1(1、8、9V、10A、19A、19F、20型肺炎链球菌多糖蛋白结合物的制备)给出的浓度分别完全溶解降解的1、8、9V、10A、19A、19F、20型肺炎链球菌荚膜多糖，分别获得荚膜多糖溶液，25℃下按比例加入CDAP，活化2min，按比例加入载体蛋白TT，室温反应2h，经Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0-0.3的分离峰。采用免疫双扩散法(按照中华人民共和国药典2015年版第三部通则3403)，检测结果显示多糖蛋白结合物与1、8、9V、10A、19A、19F、20型肺炎链球菌血清形成明显的沉淀线，说明有良好的多糖抗原性。

表1

荚膜多糖血清型189V10A19A19F20硼酸盐缓冲液pH9.09.19.19.19.29.29.2荚膜多糖浓度(mg/mL)10121815202020荚膜多糖与CDAP比例(质量比)1:0.51:0.21:0.21:0.31:0.21:0.31:0.3荚膜多糖与载体蛋白比例(质量比)1:1.51:1.51:11:11:1.21:1.31:1.2

实施例2

本实施例用于说明2、5、6A、22F、23F、33F型肺炎链球菌多糖蛋白结合物的制备。

用浓度0.2mol/L，pH值为9.0-9.5的硼酸盐缓冲液，按表2(2、5、6A、22F、23F、33F型肺炎链球菌多糖蛋白结合物的制备)给出的浓度分别完全溶解降解的2、5、6A、22F、23F、33F型肺炎链球菌荚膜多糖，分别获得荚膜多糖溶液，25℃下按比例加入CDAP，活化2min，按比例加入载体蛋白TT，室温反应2h，经Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0-0.3的分离峰。采用免疫双扩散法(按照中华人民共和国药典2015年版第三部通则3403)，检测结果显示多糖蛋白结合物与2、5、6A、22F、23F、33F型肺炎链球菌血清形成明显的沉淀线，说明有良好的多糖抗原性。

表2

荚膜多糖血清型256A22F23F33F硼酸盐缓冲液pH9.09.09.09.29.29.5荚膜多糖浓度(mg/mL)152525202015荚膜多糖与CDAP比例(质量比)1:0.31:0.51:0.51:0.31：0.31：0.2荚膜多糖与载体蛋白比例(质量比)1:1.51:11:11:1.51:11:1.2

实施例3

本实施例用于说明3、4、9N、12F、17F、18C型肺炎链球菌多糖蛋白结合物的制备。

用浓度0.3mol/L，pH值为9.0-9.1的硼酸盐缓冲液，按表3(3、4、9N、12F、17F、18C型肺炎链球菌多糖蛋白结合物的制备)给出的浓度分别完全溶解降解的3、4、9N、12F、17F、18C型肺炎链球菌荚膜多糖，分别获得荚膜多糖溶液，25℃下按比例加入CDAP，活化2min，按比例加入载体蛋白DT，室温反应2h，经Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0-0.3的分离峰。采用免疫双扩散法(按照中华人民共和国药典2015年版第三部通则3403)，检测结果显示多糖蛋白结合物与3、4、9N、12F、17F、18C型肺炎链球菌血清形成明显的沉淀线，说明有良好的多糖抗原性。

表3

荚膜多糖血清型349N12F17F18C硼酸盐缓冲液pH9.09.09.19.09.09.0荚膜多糖浓度(mg/mL)151618181520荚膜多糖与CDAP比例(质量比)1:0.11:0.21:0.21:0.31:0.31:0.2荚膜多糖与载体蛋白比例(质量比)1:21:21:21:21:21:2

实施例4

本实施例用于说明6B、7F、11A、14、15B型肺炎链球菌多糖蛋白结合物的制备。

用浓度0.25mol/L，pH值为8.5-9.1的硼酸盐缓冲液，按表4(6B、7F、11A、14、15B型肺炎链球菌多糖蛋白结合物的制备)给出的浓度分别完全溶解降解的6B、7F、11A、14、15B型肺炎链球菌荚膜多糖，分别获得荚膜多糖溶液，25℃下按比例加入CDAP，活化2min，按比例加入载体蛋白TT，室温反应2h，经Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0-0.3的分离峰。采用免疫双扩散法(按照中华人民共和国药典2015年版第三部通则3403)，检测结果显示多糖蛋白结合物与6B、7F、11A、14、15B型肺炎链球菌血清形成明显的沉淀线，说明有良好的多糖抗原性。

表4

荚膜多糖血清型6B7F11A1415B硼酸盐缓冲液pH9.19.19.18.59.0荚膜多糖浓度(mg/mL)252520286荚膜多糖与CDAP比例(质量比)1:0.51:0.51:0.31:0.11:0.4荚膜多糖与载体蛋白比例(质量比)1:1.51:1.51:2.51:21:2.5

实施例5

本实施例用于说明13价肺炎链球菌结合疫苗制备。

将实施例1-4制备的1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F血清型原液组合配制并添加磷酸铝佐剂，获得包含磷酸铝佐剂的13价肺炎链球菌结合疫苗。除了6B血清型为8μg/mL外，其余各血清型均为4μg/mL；添加不高于0.25mg/mL磷酸铝佐剂以及作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸盐及0.2‰的吐温80。

实施例6

本实施例用于说明13价肺炎链球菌结合疫苗免疫原性研究。

用制备的13价肺炎链球菌结合疫苗、阳性对照和阴性对照分别免疫NIH小鼠(每组20只)，于0、14、28天共免疫三针，42天采血，分离血清，用ELISA法检测血清中抗各型多糖的IgG水平。阴性对照平均吸光值×2.1(如阴性对照平均吸光值小于0.05，则按0.05计算)为Cutoff值；以免疫血清吸光值≥Cutoff值判定为阳转。

表5(结合疫苗免疫小鼠后阳转率及各血清型GMT结果)给出了ELISA分析的小鼠各血清型阳转率及抗体几何平均滴度(GMT)。数据表明，13价肺炎链球菌结合疫苗中除7F的阳转率为95％，其它各血清型的阳转率均为100％；与阳性对照相比较接近或高于其阳性对照，而阳性对照中不包含的血清型也产生了较高的抗体滴度。

表5

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。