用于净化葡萄糖聚合物和葡萄糖聚合物水解产物的生产的优化方法

摘要

本发明涉及用于净化葡萄糖聚合物或其促炎分子的水解产物的方法。所述方法包括：a)提供葡萄糖聚合物或其水解产物，b)任选地，检测或测定步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子，并且c)进行以下纯化步骤：i.使用具有洗涤剂特性和澄清特性的酶制剂进行处理；ii.使用具有非常高吸附特性和“微孔”孔隙率的药用级活性碳进行处理；iii.任选地，使用具有“介孔”孔隙率的第二活性碳进行处理；iv.使它们穿过具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附剂聚合树脂；并且v.在5kDa下进行连续超滤。

说明书

本发明涉及用于生产或纯化葡萄糖聚合物，更具体地是目的在于食品(富含纤维的健康成分)和医学(腹膜透析)部门的那些，或葡萄糖聚合物水解产物，更具体地是目的在于医学部门(非热原性可注射葡萄糖)的那些的净化回路的优化方法的发展。

发明的技术背景

本申请人公司已经选择在如下领域研发其发明，该领域因微生物来源的污染物能够在用于生产葡萄糖聚合物的回路中、或在用于生产其水解产物的那些回路中发展的风险而众所周知，所述污染物具有以下可能的来源：

-食物中毒，

-对人类健康危害很大的炎性反应。

因此在食品安全方法的背景下，如在健康安全方法的背景下，重要地是通过所有适当的技术手段，尤其是通过以下各项来确保不存在处于活细胞形式和处于细胞碎片形式两者的微生物来源的污染物：

-用于有效鉴别和测定污染物的方法的限定，

-通过设置适当的纯化装置和技术限定安全生产回路。

在腹膜透析的情况下，必需在严格的净度条件下制备一定量的成分。

腹膜透析事实上是一种类型的透析，它的目的是除去肾不能成功地或者不再能成功地从血浆纯化的废物，例如脲、肌酸酐、过量的钾或过剩水。这种医学处理适用于终末期慢性肾衰竭的情况。

最常用的透析液由在酸性pH(5.2-5.5)或生理学pH(7.4)下的缓冲溶液(乳酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液)组成，其中添加了：

-电解质类(钠、钙、镁、氯)并且首先是

-渗透剂，主要是葡萄糖聚合物，例如像“艾考糊精”，存在于由巴克斯特(BAXTER)公司销售的非卧床腹膜透析液中。

在将葡萄糖聚合物旨在用于连续流动式腹膜透析的这一更具体领域中，非常快地变得明显的是，这些淀粉水解产物(葡萄糖的混合物和葡萄糖低聚物和聚合物的混合物)不能够按照原样使用。

欧洲专利申请EP 207 676传授在水中形成10％浓度的清澈和无色溶液的葡萄糖聚合物是优选的，所述葡萄糖聚合物具有5 000至100 000道尔顿的重均分子量(Mw)和小于8 000道尔顿的数均分子量(Mn)。

这类葡萄糖聚合物还优选地包含其分子量在5 000和50 000道尔顿之间的至少80％葡萄糖聚合物、DP小于或等于3(分子量504)的很少或没有葡萄糖或葡萄糖聚合物和分子量大于100 000(DP约600)的很少或没有葡萄糖聚合物。

换言之，优选的葡萄糖聚合物是具有低多分散性指数(通过计算Mw/Mn比率所获得的值)的葡萄糖聚合物。

在专利申请EP 207 676中建议的用于从淀粉水解物获得这些具有低多分散性指数的葡萄糖聚合物的方法在于：

-用水混溶性溶剂进行麦芽糊精的分级沉淀，

-或者通过拥有适当的截留或排除阈值的不同膜对相同麦芽糊精进行分子过滤。

在这两种情况中，这些方法目的在于移除非常高分子量的聚合物以及低分子量单体或寡聚物两者。

然而，就它们的实现方式而言并且就它们使可能获得的产品的产率和质量而言，这些方法并不令人满意。

为了开发发展一种用于产生低多分散性指数优选地小于2.5、Mn优选地小于8 000道尔顿和Mw在12 000和20 000道尔顿之间的完全水溶性葡萄糖聚合物的方法，所述方法不存在现有技术的缺点，通过从水解淀粉而非麦芽糊精开始，本申请人公司在其专利EP 667 356中而努力解决此问题。

通过色谱分级所获得的葡萄糖聚合物则优选含有少于3％的葡萄糖和DP小于或等于3的葡萄糖聚合物，以及少于0.5％的具有大于600的DP的葡萄糖聚合物。

这种葡萄糖聚合最终由腹膜透析领域的专家接受，在于因其渗透能力使用的这些葡萄糖聚合物是完全令人满意的。

污染的风险

然而，微生物污染意在用于腹膜透析的制品的风险是令人痛惜的。

的确，已知葡萄糖聚合物生产回路可能受微生物或所述微生物中所含的促炎性性物质污染。

例如淀粉工业中描述了玉米或小麦淀粉受酵母、霉菌以及细菌型微生物，并且更具体地受酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)型的嗜酸热细菌(在回路的热区域以及酸性区域生长的嗜极性细菌)污染。

接受这些污染产品的患者的主要风险则是腹膜炎。

腹膜炎的这些发作是通过腹膜内细菌感染引起的，并且通过阳性透析液培养通常易于建立诊断。

“无菌性腹膜炎”，其被描述为无菌、化学或培养物阴性腹膜炎，就其本身来说一般由化学刺激物或异物引起。

自从引入艾考糊精用于制备腹膜透析液，已经报告了无菌性腹膜炎的孤立病例，这些病例可能与不同原因有联系，尤其是通过潜在存在的促炎性性物质来诱导。

无菌炎性发作因此是注射透析液后所观察到的主要并发症。

虽然这些炎性发作的某些与化学性质关联(意外注射化学污染物或某些化合物的不正确剂量)，但是大部分病例与用来制备透析液的溶液中出现的微生物源污染物存在直接相连。

脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是具有甚至以痕量存在时引发炎症的高风险的主要微生物源污染物。

此外，本申请人公司的荣幸在于也已经考虑到存在这样的分子，这些分子能够加重这些污染物，例如PGN解聚产物(其仍有生物活性的最少结构是胞壁酰二肽(MDP))引起的炎性应答。

除PGN解聚产物之外，甲酰化微生物肽，其原型是f-MLP(甲酰基-Met-Leu-Phe三肽)，也具有实质性的协同活性。最初，这些肽因它们对白细胞的趋化剂活性而鉴定，尽管它们不能诱导细胞因子反应本身。

因此重要的不是忽略这些“小分子”，因为它们可以通过加重痕量PGN和/或LPS的作用间接地引起无菌炎性发作。

用于有效鉴别和测定所述污染物的方法的限定

因此本申请人公司致力于开发比现有技术中可达到的那些更有效的检测和测定方法。

经过最后数年，已经开发了使用原代细胞的许多试验，以便替代炎性反应试验中的动物模型。

然而，这些体外模型遭受巨大的个体间变异性，这可能是实验偏倚的原因。

相反，单核细胞细胞系给出一致反应，由此解释了目前正在开发的试验为何日益使用培养的这种类型细胞。然而，这些试验具有对溶液中作为混合物存在的全部污染物给出总体炎性反应的缺点，并且因此导致不可能表征污染物的性质。

还重要的是，注意到加重的炎性应答对于炎性的急性期的细胞因子而言是可见的，例如：

-TNF-α(肿瘤坏死因子α)，

-IL-1β(白细胞介素1β)和

-趋化因子，例如CCL5(趋化因子(C-C单元)配体5)/RANTES(当活化时调节的、正常T细胞表达的、和分泌的)，

但是对于IL-6(白细胞介素6)而言，是不可见或勉强可见的。

因此，基于IL-6产生的方法(US 2009/0239819和US2007/0184496)不适合检测溶液中作为混合物的污染物。

因此本申请人公司的荣幸在于，在其国际专利申请WO2012/143647中已经开发了用于检测具有促炎作用的微生物污染物的灵敏且有效方法，所述微生物污染物低于目前使用和/或文献中描述的程序的灵敏度阈值，并且随后已经鉴定了在批次中以痕量存在的促炎分子的家族或甚至其性质的灵敏且有效方法，其中所述促炎分子源自生产回路。

确定单独纯化步骤的有效性

然后本申请人公司寻求更好地限定待进行的关键纯化步骤，以便确保对于生产线，尤其是用于葡萄糖聚合物的那些而言的最佳安全性。

为这个目的，它致力于通过使用基于如在其国际专利申请WO2012/143647中呈现的单核细胞系的检测和测定方法，确认用于纯化所述回路的关键单独步骤。

因此，在其国际专利申请WO 2013/178931中，本申请人公司分析了以下单独步骤的有效性：

-热处理，

-酸化，

-穿过活性碳，

-穿过吸附、超滤、或过滤性树脂，

-化学水解或酶水解。

为了分析这些不同单独步骤的有效性，然后在不同基质上进行不同净化步骤：

-葡萄糖聚合物，艾考糊精原料(在根据发明EP 667 356的传授进行层析分离之前)，

-一个批次的艾考糊精，

-一个批次的分枝麦芽糊精，由本申请人公司在商标名FB06下销售，

-一个批次的制备的一水右旋糖，从而在可注射溶液中进行调制，由本申请人公司在商标名PF下销售，

-一个批次的高度分枝的可溶性葡萄糖聚合物，根据本申请人公司是所有人的国际专利申请WO 2007/099212的传授进行制备，

-一种商业麦芽糊精。

尽管这些不同研究已经使可能证明以下影响，这些步骤中的每一个可能关于消除对于每一基质而言给定的污染物，仍必须限定能够确保所有基质避免所有潜在污染物的最佳组合。

从在专利申请WO 2013/178931中呈现的所有结果可见，因此对于开发用于生产或纯化葡萄糖聚合物，更具体地是目的在于食品(富含纤维的健康成分)和医学(腹膜透析)部门的那些，或葡萄糖聚合物水解产物，更具体地是目的在于医学部门(非热原性可注射葡萄糖)的那些的净化回路的优化方法，仍存在未满足的需求。

发明概述

因此本发明提出了小心地选择并且按顺序放置的若干净化步骤的组合，该组合证明在消除在生产回路，尤其是葡萄糖聚合物中可能存在的所有炎性分子方面是有效的，不管该组合的性质如何。

因此，本发明的方法涉及以下步骤的组合：

-用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂进行处理，

-用具有非常高吸附能力和“微孔的”孔隙率的药用级活性碳进行处理，

-任选地，用具有“介孔的”孔隙率的第二活性碳进行处理，

-穿过具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附剂聚合树脂；并且

-进行连续的5kDa超滤。

在本发明背景下：

-“具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂”旨在意指甘露聚糖酶类型，例如由诺维信公司(Novozymes)销售的的酶活性；

-“具有非常高吸附能力和‘微孔的’孔隙率的药用级活性碳”旨在意指具有等于Norit C Extra USP活性碳的孔隙率的活性碳；

-“具有‘介孔的’孔隙率的活性碳”旨在意指具有等于ENO-PC活性碳的孔隙率的活性碳；

-“具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附剂聚合树脂”旨在意指DOWEX OPTIDORE SD2型的树脂。

优选地，该方法包括5个步骤。

具体地，这些葡萄糖聚合物选自艾考糊精和麦芽糊精，特别是分枝的或未分枝的麦芽糊精，并且这些葡萄糖聚合物水解产物是完全水解的一种产物，例如，一水右旋糖。

选择的步骤使可能靶向污染物的不同家族，并且因此获得没有炎性反应性的产物。

发明详述

本发明的方法旨在替代常规地用于纯化葡萄糖聚合物或其水解产物的路径。

根据本发明，净化葡萄糖聚合物或其水解产物的方法包括以下步骤：

a)提供葡萄糖聚合物或其水解产物；

b)任选地，检测或测定步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子；

c)进行以下纯化步骤：

i.用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂进行处理，

ii.用具有非常高吸附能力和“微孔的”孔隙率的药用级活性碳进行处理，

iii.任选地，用具有“介孔的”孔隙率的第二活性碳进行处理，

iv.穿过具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附剂聚合树脂，并且

v.进行连续的5kDa超滤。

这些葡萄糖聚合物或其水解产物可以旨在用于腹膜透析、肠内及肠胃外给食和新生婴儿给食。

在一个优选实施例中，将在本发明背景下制备的葡萄糖聚合物是艾考糊精或麦芽糊精(它们是分枝或不分枝的，如将在下文描述的)。

在此涉及的葡萄糖聚合物水解产物尤其被理解为是完全水解的产物，例如，在本申请人公司的商品名PF下销售的非热原性的一水右旋糖。

可以在其制备的一个或若干个阶段，并且尤其是在其制备方法的后面的步骤将它们净化。

因此，在根据本发明的方法中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物对应于成品之前的产物。

这些促炎组分首先是细菌来源的分子。

具体地，它们可以是：

-PGN，

-LPS，

-脂肽，

-PGN解聚产物，尤其是MDP，

-甲酰化微生物肽，例如f-MLP，

-β-葡聚糖，

-等。

为了监控用于制备于人类中用作治疗性用途的葡萄糖聚合物(例如，腹膜透析液)的方法的净化步骤的效力，在本发明背景下使用的、用于体外测量炎性应答的方法基于细胞试验(“生物测定”)，使用单核细胞/巨噬细胞型细胞系(THP-1、和/或Raw-Blue^TM)以及表达特异性天然免疫的受体的、经转染的细胞系(HEK-Blue^TM)，其细胞试验是由本申请人公司开发的，并且在它的在先专利申请中做了详细描述。

优选使用五个细胞系：

-Raw-Blue^TM细胞系：这一细胞系源自小鼠巨噬细胞，响应可以存在于葡萄糖聚合物基质和衍生物中的大部分促炎污染物(PGN、脂肽、LPS、酵母聚糖、LTA)。因此，它的使用使可能估计存在于样品中的促炎分子的整体负荷。

-HEK-Blue^TM>

-HEK-Blue^TM>

-HEK-Blue^TM>

-HEK-Blue^TM裸(Null)2细胞系：这是未经免疫受体转染的对照细胞系。它的使用是必须的，以验证葡萄糖聚合物或其水解产物溶液不经由毒性机制诱导SEAP产生。

然而，应注意，本领域技术人员还可使用其他商业细胞系(因埃克斯(IMGENEX))或可制备这些细胞系。

在一个优选的实施例中，这些细胞系以0.5和1×10⁶个细胞/ml培养基的密度使用，并且使得葡萄糖聚合物或其水解产物的制剂与这些细胞接触持续约16至24h。

可以使用剂量-反应曲线进行污染物的量化。这种剂量-应答曲线可以尤其是用相同的细胞在相同条件下伴以递增剂量的污染物时产生。这些剂量-应答曲线具体地用LPS、PGN、脂肽和MDP标准品产生。

优选地，这样一种剂量-应答曲线可以针对以下各项而生成：表达TLR4的细胞(例如，THP-1、HEK-Blue^TM>TM)，用递增剂量的LPS；表达TLR2(例如，THP-1、HEK-Blue^TM>TM)，用递增剂量的PGN；以及经由NOD2反应的细胞(例如，HEK-Blue^TM>

可以如在本申请人的专利申请：WO 2012/143647和WO2013/178931中所述，进行细胞试验。

根据本发明的方法的第一净化步骤由用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂进行的处理组成。

这一甘露聚糖酶型的酶活性，例如由诺维信公司(Novozymes)销售的酶制剂已经证明对于解离大复合体，例如细菌碎片和高分子量PGN是有效的。

当在50℃，在用NaOH调节至pH 10的32％(重量/体积)葡萄糖聚合物溶液中以0.4％(体积/体积)的终浓度使用它持续24h的处理时间时，活性是最佳的。

在处理后，用HCl中和该溶液，并且通过在85℃加热10min来将该酶灭活。

第二步骤由用具有非常高吸附能力和“微孔的”孔隙率的药用级活性碳进行的处理组成。

本申请人公司推荐使用Norit C Extra USP型的活性碳。这是因为C Extra USP碳在消除PGN及其降解产物时被证明有效。

在用HCl调节至pH 4.5的32％(重量/体积)葡萄糖聚合物溶液中以0.5％(重量/体积)的终浓度添加它时，活性是最佳的。在80℃搅拌持续1h下，进行该处理。在处理后，用NaOH中和该溶液，然后过滤通过0.22μm。

第三步骤由用具有“介孔的”孔隙率的第二活性碳进行的处理组成。这一步骤是任选的。

在此，ENO-PC型活性碳是优选的。这一质量的活性碳具有广谱的作用，并且使得可能优先消除具有<100kDa的分子量的分子(例如，LPS和PGN的降解产物)。

还在80℃温度下，在pH 4.5，按0.5％的含量，在此使用它持续1h。

第四步骤由在具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附剂聚合树脂上进行的处理组成。

选择Dowex SD2树脂，该树脂具有与其他相同家族的树脂相比，污染分子(除了PGN外)的更广谱的消除。

在包含20ml的这一树脂的柱上，洗脱32％(250ml)葡萄糖聚合物溶液。

最终步骤由在具有5kDa的截断阈值的超滤膜上进行的过滤组成。

用超滤进行处理的目的是消除仍存在于葡萄糖聚合物溶液中的小尺寸的分子。本申请人公司推荐在该方法结束时使用这一处理，因为这一处理还具有透析作用，该透析作用使得可能消除经以上处理的过程已经累积的痕量的盐。

选择在室温下，以25ml/min的速率连续注射葡萄糖聚合物溶液经过5kDa过滤器，持续3h。为了补偿滤液的损失，将滞留物注入起始溶液，并且通过添加无菌PBS缓冲液，连续调节至初始体积(100ml)。3h后，滤液的体积在150和200ml之间，该体积大于葡萄糖聚合物溶液的初始体积。

如将在以下实例中示出，多个步骤的这一组合单独能够提供对用于生产聚合物和葡萄糖及其衍生物的回路的最大保护，避免细菌来源的污染物。

从以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例旨在是说明性的，并且是非限制性的。

实例

实例1：剂量-应答曲线的建立

用标准激动剂分子：LPS、PGN、PAM3(cys)(PAM₃Cys-Ser-(Lys)4三盐酸化物，一种合成脂肽)、LTA、酵母聚糖和MDP产生剂量-应答曲线。使用递增浓度的激动剂孵育Raw-Blue^TM和HEK-Blue^TM>

-Raw-Blue^TM细胞系(图1)：这些细胞响应可以存在于基质和葡萄糖聚合物衍生物(PGN、脂肽、LPS、酵母聚糖、LTA)中的大多数炎性分子；它们尤其具有关于PGN的强反应性，但是并不响应其解聚产物。

-HEK-Blue^TM>

-HEK-Blue^TM>

-HEK-Blue^TM>

-HEK-Blue^TM裸2细胞系(图5)：缺乏细胞毒性的对照。

实例2：不同葡萄糖聚合物基质的制备

如上指出的，这些基质如下：

-4种葡萄糖聚合物，艾考糊精原料(在根据专利EP 667 356的传授进行层析分离之前)，在此称作E1565、E3063、E1242、E1242和E5248

根据专利申请WO 2012/059685的传授进行这些聚合物的制备。

-一个污染批次的艾考糊精(在此称作E209J)以及一个“阴性对照”批次的艾考糊精，即用于这些细胞试验中的非污染物对照(在此称作P11-11)。根据专利EP 667 356的传授制备这些批次，详细描述于专利申请WO 2010/125315的实例1中。

实例3：由未处理的样品诱导的细胞应答的分析

这些试验的目的是确定存在于不同基质中的污染物的促炎反应性以及性质。

在非热原性水(例如，注射剂)中以32％(重量/体积)制备根据实例2的这些样品。

在使用SLP-HS和LAL测定进行的细胞试验之前，进行LPS和PGN水平的测定(数据示于下文)：

借助五个细胞类型，分析在不同基质中生物污染物的存在，以便具有对某些污染物的炎性应答的概述(图6)。

对于这些细胞试验，将这些样品稀释为在细胞培养基中的1/10(最终浓度：3.2％(w/v))。

对以下各项进行分析：

-Raw-Blue^TM细胞系：对于PGN具有高反应性的任何污染物，

-HEK-Blue^TM>

-HEK-Blue^TM>

-HEK-Blue^TM>

-EK-Blue^TM裸2细胞系：缺乏细胞毒性的对照。

用样品进行评估：

-E1242：在HEK-TLR2细胞中的高强度炎性应答，和在HEK-NOD2细胞中的低强度炎性应答，具有几乎未降解的PGN的强污染的证据。

-E1565：在HEK-TLR2细胞中的高强度炎性应答，在HEK-TLR4细胞中的中强度炎性应答，以及在HEK-NOD2细胞中的高强度炎性应答，具有降解的PGN并且具有LPS的强污染的证据。

-E3063：在HEK-TLR2细胞中的饱和炎性应答，在HEK-TLR4细胞中的中强度炎性应答，和在HEK-NOD2细胞中的低强度炎性应答，具有几乎未降解的PGN并且具有痕量的LPS的非常强污染的证据。

-E5248：不同细胞系中的低强度炎性应答，具有PGN并且具有LPS的低污染的证据。

-E209J：在HEK-TLR2细胞中的高强度炎性应答，和在HEK-NOD2细胞中的低强度炎性应答，具有弱降解的PGN的强污染的证据。

在HEK-裸细胞存在下，没有葡萄糖聚合物基质给出应答，这确认缺乏细胞毒性。

实例4：净化程序对由样品诱导的细胞应答的作用的分析

在其国际专利申请WO 2013/178931中，本申请人公司使得能够鉴定最适合样品中存在的每一类型的污染物的处理，并且使得可能确定用于其施加至葡萄糖聚合物基质的实验条件。

在这一更早研究的基础上，提出的多个单独处理是：

-在活性碳上进行处理，

-通过具有5kDa过滤阈值的膜的超滤，

-穿过吸附树脂，

-用酶制剂进行处理。

在使用下述组合的实验中，将步骤的选择和安排确定为以下项的函数：

o实验处理条件，

o在样品中污染的水平，和

o促炎分子的性质。

的使用

国际专利申请WO 2013/178931的教授内容示出，该酶制剂略微被痕量的LPS污染。此外，在葡萄糖聚合物溶液中进行处理后，痕量的酶可以存留。因此为了消除这些外源污染，本申请人公司推荐将酶处理步骤放置在组合的测试中的程序的开始处。

活性碳的使用

对于本研究，保留的活性碳是：

oC-EXTRA-USP，因为它在消除PGN及其降解产物中的有效性；

oENO-PC，因为它对于具有<100kDa的分子量的污染物(例如LPS和PGN的降解产物)的优先作用；

oA-SUPRA-EUR，因为它在消除高分子量的复合物中的有效性。

本申请人公司已经选择单独使用活性碳，或在不同组合中成对组合使用活性碳，并且鉴于用碳进行处理是分批进行的并且需要加热、中和与过滤步骤，它们紧接酶处理后、但是在其他处理前进行。

树脂的使用

保留的树脂是：

o大网(Macronet)MN-150，因为它在保留小分子量的分子(例如MDP和PGN的降解产物)方面的有效性；

oDowex SD2，因为它广谱地消除污染物，除了PGN。

膜分离的使用

用5kDa超滤进行处理的目的是消除仍存在于葡萄糖聚合物溶液中的小尺寸的分子。此外，这一程序具有透析作用并且使得可能消除经以上处理的过程已经累积的痕量的盐。

因此这一步骤系统地放置在该程序结束时。

在每一步骤后，在无菌条件下取出样品，并且用于细胞试验，以便测定整体炎性负荷(Raw-Blue^TM细胞应答)和生物污染物的量(HEK-Blue^TM应答)。将在每一步骤后获得的细胞应答与起始基质诱导的应答相比较，以估计净化程序的有效性。结果表示为相对于最大细胞应答的活性。在所有试验中，用P11-11艾考糊精进行非污染对照。

实例5：单独处理步骤的不同组合的比较分析

可以从专利申请WO 2013/178931的教授内容隐含地推断出大量可能的组合。

对于3个设想程序，获得的结果如下：

-程序1：E1242基质；用C-EXTRA>(Macronet)MN-15树脂；5kDa超滤

细胞试验的结果在图7中给出。

在Raw-Blue细胞中，E1242基质诱导了中间炎性应答，该炎性应答主要关系到高浓度的PGN(TLR2应答)。

它还包含痕量的LPS和PGN的降解产物，鉴于TLR4和NOD2应答都接近背景噪声。

该净化程序有效减少了炎性应答。

尽管如此，Raw-Blue细胞的应答保留略高于非污染对照(P11-11)，表明仍存在痕量的污染物。

这一结果是由于在净化后存在残余PGN。的确，在用碳进行处理后，TLR2应答大大减小，但仍保留高于阴性对照。

其他步骤对TLR2应答没有作用，这再也没有发展，直至该程序结束时。从另一方面来说，早在第一处理步骤，TLR4应答就不再是可检测的，这证明已经消除了LPS。关于NOD2应答，这在超滤步骤后被抑制。

结论：

尽管已经有效减少了炎性化合物的负荷，但是程序1仍不足以确保大量加载有PGN的基质的完全净化。

-程序2：E209J基质；用C-EXTRA>脂；5kDa超滤

细胞试验的结果在图8中给出。

对于此程序，用Dowex SD2替代树脂，Dowex SD2具有更广谱的截留。用E209J基质进行这些试验，该基质具有类似于E1242的污染概况。

在这种情况下，Raw-Blue细胞的应答与阴性对照相同，这证明净化已经是有效的。

尽管如此，TLR2应答仍高于非污染对照，这表明仍存在痕量的PGN。

应答中的差异确定地关系到以下事实：对于PGN，与Raw-Blue细胞相比，HEK-TLR2细胞具有更低检测阈值。

在穿过SD2后，NOD2应答减少，并且在超滤后该应答被抑制，这提示对于消除PGN的降解产物，这一树脂具有最少的互补作用。

结论

这一数据表明，在消除所有PGN方面，树脂的变化并未改进该程序的有效性。

-程序3：E5248基质；然后用C-EXTRA>进行处理穿过Dowex>

细胞试验的结果在图9中给出。

在这一最终组合中，将A-SUPRA EUR碳与作为ENO-PC的替代的C-EXTRA USP组合。

与后者相反，A-SUPRA EUR碳优先消除高分子量的分子。

对于净化加载有PGN或β-葡聚糖型的、聚集的大复合物的样品，这一组合应是有效的。

在E5248基质上进行试验，该基质在不同细胞系中诱导低强度炎性应答，同时SLP-HS和LAL的测定提示存在PGN和/或β-葡聚糖的强污染。

可以用高质量的炎性分子解释这一差异，这些炎性分子将减小其溶解度，并且因此减小其在试验细胞中诱导应答的可及性。

在该程序的第1步骤后，在不同细胞系中观察到细胞应答的强增加。

这一结果确认，在解聚细菌复合物或碎片，由此释放用于TLR2、TLR4和NOD2的激动剂分子方面，用进行酶处理是有效的。

在用碳进行处理后，Raw细胞和HEK-TLR2细胞的应答已经显著降低，但是仍高于阴性对照。

同样，TLR4和NOD2应答仍然很大，并且必须等待穿过树脂和最终超滤步骤，以获得在不同细胞类型中，与非污染对照一样的信号。

结论

这些结果表明，对于净化程序，A-SUPRA-EUR碳仍未提供任何显著益处。

最终结论

尽管完全可想象，但是这些净化程序都没有给出完全令人满意的结果。

实例6：优化程序的呈现

选择在E3063基质上连续进行以下步骤：

-用进行处理，然后

-用C-EXTRA USP+ENO-PC活性碳进行处理，然后

-穿过Dowex SD2树脂，并且最终

-进行5kDa超滤

细胞试验的结果在图10中给出。

为了增加目的在于消除PGN的程序的有效性，在其他步骤上游引进用进行酶处理的步骤。

对于这些试验，使用非常大量地加载有PGN的E3063基质。

在该程序的不同步骤后，Raw-Blue细胞的应答与阴性对照相同，这证明净化已经是有效的。

此外，酶+碳处理的组合特别适合消除PGN，因为TLR2应答从处理前的饱和信号发展到与非污染对照一样的信号。

最终，在消除痕量的LPS(TLR4应答)和NOD2激动剂方面，其他步骤是有效的。

为了证明这一组合的确有效，除去ENO-PC碳，以便验证是否其使用真的对该净化程序提供了益处。

细胞试验的结果在图11中给出。

在另一基质、E1565基质上进行这些试验，该基质被TLR2、TLR4和NOD2的不同激动剂污染。

在该程序结束时，Raw-Blue细胞的应答显著降低，但是仍略大于非污染对照。这一非常弱的应答与残余PGN的存在无关，而是与痕量LPS和痕量NOD2激动剂有关，并且与这两个分子家族之间的可能的协同效应有关。

对于分子量<100kDa的分子(LPS和PGN的降解产物)，ENO-PC碳具有广谱的截留。

结论

观察到，当它不存在时，已经降低了该净化程序的有效性，尤其是如果该基质被这两个家族的炎性分子严重污染的情况下。

总之，在这一研究中获得的结果示出，在消除可能存在于葡萄糖聚合物溶液中的炎性分子方面，小心地选择并且按顺序排列的若干净化步骤的组合证明是有效的。

该组合包括以下步骤：

-用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂，例如进行处理，

-用具有等于C-EXTRA USP的孔隙率的活性碳进行处理，

-任选地，用等于用于加载有降解的LPS和/或PGN的基质的ENO-PC的孔隙率的第二活性碳进行处理，

-穿过Dowex-SD2型的吸附树脂，

-进行连续的5kDa超滤。

选择的步骤使得可能靶向不同家族的污染物，并且提供没有炎性反应性的产物。

附图

图1：Raw-Blue^TM细胞对标准激动剂的应答。

图2：HEK-Blue^TM>

图3：HEK-Blue^TM>

图4：HEK-Blue^TM>

图5：HEK-Blue^TM裸细胞对标准激动剂的应答。

图6：由葡萄糖聚合物基质诱导的细胞应答。

图7：在根据程序1的净化后，由E1242基质诱导的细胞应答。

图8：在根据程序2的净化后，由E209J基质诱导的细胞应答。

图9：在根据程序5的净化后，由E5248基质诱导的细胞应答。

图10：在根据程序3的净化后，由E3063基质诱导的细胞应答。

图11：在根据程序4的净化后，由E1565基质诱导的细胞应答。

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