一种抗菌肽Nisin及其提取方法与应用

摘要

本发明涉及一种抗菌肽Nisin及其提取方法与应用，提取方法主要包括：(1)将购买的乳酸乳球菌菌种经活化、平板划线、种子液培养、扩大培养后，得到乳酸乳球菌发酵液；(2)将乳酸乳球菌发酵液经调节pH为2.0，水浴，离心处理后，弃沉淀得上清，再用0.22μm滤膜过滤除菌得到Nisin悬浮发酵液；(3)用离子液体双水相[Bmim]Cl‑K2HPO4处理发酵液，制得Nisin富集液；(4)将Nisin富集液经CH2Cl2萃取，除去离子液体，制得Nisin精提液。本发明提取工艺简单，成本低，污染小，适用于规模化生产高纯度的Nisin。得到的高纯度抗菌肽Nisin，可有效抑制革兰氏阳性细菌的生长，抑菌活性强，可作为天然、绿色的食品防腐剂进行推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及天然产物深加工技术领域，具体涉及乳酸乳球菌ATCC 11454发酵液中的抗菌肽Nisin及其提取方法与应用。

背景技术

Nisin是由乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcu.lactis.subsp.lactis)分泌的一种具有抗菌活性的多肽，由34个氨基酸残基组成，分子量为3510，通常以二聚体形式存在。在天然状态下，Nisin有Nisin A和Nisin Z两种形式，后者的抑菌能力比前者强。研究认为，Nisin对细菌的营养细胞和孢子都有作用，它对于营养细胞的主要作用点是细胞质膜，抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，从而使细胞壁质膜和磷脂化合物合成受阻，造成细胞内物质外泄，引起细胞裂解。对芽孢的作用是在孢子出现膨胀的起始阶段抑制其发芽。Nisin在60多个国家得到广泛应用，主要作为乳制品、肉制品、罐藏食品以及饮料的天然防腐剂。与其他防腐剂相比，Nisin具有安全无毒、抗菌性强、水溶性好、热稳定性好等优点，但Nisin也存在抑菌谱较窄的弊端。细菌素在pH 6.0-6.5的条件下能吸附在产生菌的细胞上，离心收集菌体，再在pH＝2条件下使细菌素从菌体上解离下来。

Nisin的生产，主要是以乳酸乳球菌作为生产菌，经过发酵获得，发酵产物的提取方法主要有有机溶剂法、吸附法和柱层析法。有机溶剂法是利用正丙醇、丙酮、乙酸等有机溶剂沉淀Nisin，利用KH₂PO₄等进行盐析，是一种经典的方法，但其缺点是回收率低，回收产物活性低。吸附法是利用菌体对Nisin在高pH吸附、低pH解析附的特性进行纯化，但当Nisin的浓度非常高时，会超过细胞吸附Nisin的能力，只能回收部分Nisin。柱层析法是利用一些层析介质对Nisin进行分离纯化，其优点是操作简便、分离效果好，缺点是处理量小、分离时间较长。

发明内容

本发明目的在于提供一种抗菌肽Nisin及其提取方法与应用解决现有Nisin回收率低，回收产物活性低等问题。

为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：

一种抗菌肽Nisin的提取方法，包括以下步骤：

(1)将购买的乳酸乳球菌菌种经活化、平板划线、种子液培养、扩大培养后，得到乳酸乳球菌发酵液；

(2)将乳酸乳球菌发酵液经调节pH为2.0，水浴，离心处理后，弃沉淀得上清，再用0.22μm滤膜过滤除菌得到Nisin悬浮发酵液；

(3)用离子液体双水相[Bmim]Cl-K₂HPO₄处理发酵液，制得Nisin富集液；

(4)将Nisin富集液经CH₂Cl₂萃取，除去离子液体，制得Nisin精提液。

CH₂Cl₂萃取主要作用是回收[Bmim]Cl，可以使抗菌肽Nisin与[Bmim]Cl分离开，[Bmim]Cl价格昂贵，回收后可循环使用。Nisin得到进一步纯化，可应用与食品领域。

进一步的，步骤(1)中，所述菌种的活化为将购买的菌种ATCC 11454干粉用0.5mL液体培养基溶解，再以5％(v/v)的比例接入5mL液体培养基中，活化22-24h；所述平板划线为用接种针取少许活化好的菌液，划线接种于平板上，静置培养18-20h；所述种子液培养为从平板上挑取单菌落，接种于30mL液体培养基中，恒温培养19-21h；所述扩大培养为将培养好的种子液以3％(v/v)的比例接种于新鲜的200mL液体培养基中，恒温培养16-18h得到乳酸乳球菌发酵液，所有培养温度维持在29-31℃。

进一步的，步骤(2)所述水浴为在80-85℃水浴20min，所述离心处理为4000rpm的条件下离心5min。

进一步的，步骤(3)所述离子液体双水相[Bmim]Cl-K₂HPO₄中[Bmim]Cl的质量分数为27.6％-28.6％，K₂HPO₄的质量分数为14％-15％。质量分数处于这个范围是获得稳定萃取体系的质量分数。[Bmim]Cl和K₂HPO₄的质量分数过多或过少都会影响萃取体系的萃取性能和稳定性，主要影响双水相体系的形成，不会形成本发明保护的萃取体系性能。

进一步的，步骤(3)所述离子液体双水相[Bmim]Cl-K₂HPO₄与所述发酵液的重量比为2:0.8-1.2。处于这个比例才有利于获得稳定的萃取体系，过多或过少都不能形成稳定的萃取体系。

进一步的，步骤(4)中所述Nisin富集液与所述CH₂Cl₂的重量比为1:1.5-2。处于此比例可得到最佳的[Bmim]Cl回收效果，过多或过少均没有本发明保护的此最佳效果。

一种上述制备方法制得的Nisin精提液。

进一步的，上述Nisin精提液的抑菌效价为3037IU/mL。

本发明制得的Nisin精提液经蛋白浓度检测，回收率为95-97％。

本发明所得的Nisin精提液经Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定在5.8KDa、7.8KDa附近有条带。本发明利用牛津杯测抑菌圈的方法检测提取物的抑菌活性，以Nisin标准品作为对照；以BCA法测蛋白浓度，在562nm处测其吸光值，以Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定提取物的分子量，以超低分子蛋白标准为maker。

一种上述Nisin精提液的应用，作为天然、绿色的食品防腐剂。

与现有技术相比，本发明采用高温浓缩、离子液体双水相处理、CH₂Cl₂萃取出去离子液体[Bmim]Cl可以回收，Nisin可单独被纯化出来，避免了传统方法高成本、低回收的弊端，提取工艺简单，离子液体相对于传统的有机溶剂毒性和污染性较低，适用于大规模化生产。而且本发明制得的Nisin精提液具有良好的抑菌效果，可有效抑制革兰氏阳性细菌的生长，可应用于食品领域可以作为天然、绿色的食品防腐剂。

附图说明

图1是本发明的Nisin精提液提取工艺流程图；

图2是Nisin标准品抑菌效价标准曲线；

图3是Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定结果，1为Maker；2为标准品Nisin；3为Nisin悬浮液；4为[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系上相；

图4是[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系分配发酵液的抑菌试验结果，a为上相，b为下相，c为标准品5000IU/mL，d为Nisin悬浮液；

图5是蛋白回收率结果；测定的是Nisin悬浮液在离子液体双水相[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系萃取后，总蛋白的回收率，白色柱子对应离子液体双水相体系上相的蛋白回收率，黑色柱子对应离子液体双水相体系下相的蛋白回收率。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

制备Nisin精提液，如图1所示，主要包括以下步骤：

(1)制备乳酸乳球菌发酵液：按表1配制乳酸乳球菌培养基将pH调至6.8，若是固体培养基，则还需加入1.5％的琼脂，115℃灭菌15min；将购买的菌种ATCC 11454干粉用0.5mL液体培养基溶解，再以5％(v/v)的比例接入5mL液体培养基中，在培养箱中培养24h；用接种针取少许活化好的菌液，划线接种于平板上，在培养箱中静置培养18h；从平板上挑取单菌落，接种于30mL液体培养基中，在培养箱中培养19h。将培养好的种子液以3％(v/v)的比例接种于新鲜的200mL液体培养基中，培养箱中静置培养16h，培养箱温度为29℃。

表1 乳酸乳球菌ATCC 11454培养基配方

(2)制备Nisin悬浮液：将乳酸乳球菌发酵液调节pH至2以下，在80℃水浴20min，4000rpm的条件下离心5min，弃沉淀取上清液，用0.22μm滤膜过滤一次除菌，得到Nisin悬浮液。

(4)制备Nisin富集液：利用离子液体双水相[Bmim]Cl-K₂HPO₄处理分配Nisin悬浮液，其中离子液体双水相体系包含27.6％(wt)K₂HPO₄+14％(wt)[Bmim]Cl；萃取条件为20g的双水相体系中加入9g发酵液，充分混匀30min后，4000rpm离心20min分相；Nisin富集在上相，制得Nisin富集液；

(5)制备Nisin精提液：将Nisin富集相与CH₂Cl₂以1:1.5的比例充分混匀，静置1h，CH₂Cl₂溶解离子液体在下相，取上相即为Nisin精提液。

实施例2

制备Nisin精提液，如图1所示，主要包括以下步骤：

(1)制备乳酸乳球菌发酵液：按表1配制乳酸乳球菌培养基将pH调至6.8，若是固体培养基，则还需加入1.5％的琼脂，115℃灭菌15min；将购买的菌种ATCC 11454干粉用0.5mL液体培养基溶解，再以5％(v/v)的比例接入5mL液体培养基中，在3培养箱中培养22h；用接种针取少许活化好的菌液，划线接种于平板上，在培养箱中静置培养19h；从平板上挑取单菌落，接种于30mL液体培养基中，在培养箱中培养20h。将培养好的种子液以3％(v/v)的比例接种于新鲜的200mL液体培养基中，培养箱中静置培养17h，培养箱温度为30℃。

(2)制备Nisin悬浮液：将乳酸乳球菌发酵液调节pH至2以下，在83℃水浴20min，4000rpm的条件下离心5min，弃沉淀取上清液，用0.22μm滤膜过滤两次除菌，得到Nisin悬浮液。

(4)制备Nisin富集液：利用离子液体双水相[Bmim]Cl-K₂HPO₄处理分配Nisin悬浮液，其中离子液体双水相体系包含28.1％(wt)K₂HPO₄+14.5％(wt)[Bmim]Cl；萃取条件为20g的双水相体系中加入9g发酵液，充分混匀30min后，4000rpm离心20min分相；Nisin富集在上相，制得Nisin富集液；

(5)制备Nisin精提液：将Nisin富集相与CH₂Cl₂以1:1.7的比例充分混匀，静置1h，CH₂Cl₂溶解离子液体在下相，取上相即为Nisin精提液。

实施例3

制备Nisin精提液，如图1所示，主要包括以下步骤：

(1)制备乳酸乳球菌发酵液：按表1配制乳酸乳球菌培养基将pH调至6.8，若是固体培养基，则还需加入1.5％的琼脂，115℃灭菌15min；将购买的菌种ATCC 11454干粉用0.5mL液体培养基溶解，再以5％(v/v)的比例接入5mL液体培养基中，在培养箱中培养24h；用接种针取少许活化好的菌液，划线接种于平板上，在培养箱中静置培养20h；从平板上挑取单菌落，接种于30mL液体培养基中，在培养箱中培养21h。将培养好的种子液以3％(v/v)的比例接种于新鲜的200mL液体培养基中，培养箱中静置培养18h，培养箱温度为31℃。

(2)制备Nisin悬浮液：将乳酸乳球菌发酵液调节pH至2以下，在85℃水浴20min，4000rpm的条件下离心5min，弃沉淀取上清液，用0.22μm滤膜过滤三次除菌，得到Nisin悬浮液。

(4)制备Nisin富集液：利用离子液体双水相[Bmim]Cl-K₂HPO₄处理分配Nisin悬浮液，其中离子液体双水相体系包含28.6％(wt)K₂HPO₄+15％(wt)[Bmim]Cl；萃取条件为20g的双水相体系中加入9g发酵液，充分混匀30min后，4000rpm离心20min分相；Nisin富集在上相，制得Nisin富集液；

(5)制备Nisin精提液：将Nisin富集相与CH₂Cl₂以1:2的比例充分混匀，静置1h，CH₂Cl₂溶解离子液体在下相，取上相即为Nisin精提液。

实施例4

将按照实施例1、实施例2和实施例3所述方法制备的抗菌素做如下检测。

一、抑菌活性实验

本实例中以金黄色葡萄球菌为指示菌，根据Nisin标准品的抑菌效价标准曲线来计算样品的效价。

1.根据表2配制金黄色葡萄球菌，将pH调至7.5。若是固体培养基，则还需加入1.5％的琼脂，115℃灭菌15min；以10％(v/v)的比例在5mL液体培养基中接入保存在甘油中的菌种，在37℃恒温摇床中以200rpm转速振荡培养12h；用接种针取活化好的菌液划线接种于平板上，在37℃恒温培养箱中静置培养8h以获得单菌落；挑取单菌落接种于30mL液体培养基中，在37℃，200rpm转速的摇床中振荡培养12h；然后以3％(v/v)的比例接入100mL新鲜液体培养基中，在相同条件下振荡培养6h后，将菌液用0.02M PBS稀释至浓度为1×10⁸cfu/mL左右的菌悬液。

表2 金黄色葡萄球菌培养基配方

2.抑菌实验：取10mL培养基平铺于平板中，待其凝固之后取稀释后的1mL金黄色葡萄球菌菌悬液与15mL培养基混匀，倾倒于平板中，效价培养基中琼脂的含量为1％。将牛津杯放置于平板上，在牛津杯中加入100μL的标准品或样品。加入后先在无菌操作台中通风扩散30min，然后在4℃冰箱中扩散24h，最后将平板放入37℃恒温培养箱中培养24h，培养完毕后用游标卡尺测量并记录抑菌圈的大小。

标准品与样品的牛津杯放置方法。选用的标准效价从高到低依次为80000IU/mL、40000IU/mL、20000IU/mL、10000IU/mL、5000IU/mL、2500IU/mL以及1250IU/mL，分别对应S1～S7，S4为中间浓度。每个浓度的标准品需准备三个平板，实验结束后分别求出六个中间浓度标准品与六个Si(i为1、2、3、5、6或7)抑菌圈大小的平均值，并计算标准偏差与相对标准偏差。然后进行平板间差异校正，计算公式如下：

X_C＝X_S-(X_R-P)

XC为标准品平均值的校正值，X_S为原始标准品平均值，X_R为六个中间浓度标准品的平均值，P为所有中间浓度标准品的平均值。

计算出X_C后，即可绘制Nisin抑菌标准曲线，如图2所示，y＝1.373x+0.648，R²＝0.993。样品效价的测定与标准曲线的绘制类似，用样品(U1)替代其他标准品溶液与中间浓度标准品进行实验即可。

二、Tricine-SDS-Page

1、TCA-丙酮沉淀：取未开封的500g TCA药品，加入227mL超纯水，用磁力搅拌器混匀溶解，配制成100％的TCA溶液；取1.35mL Nisin悬浮液与体系[Bmim]Cl-K₂HPO₄上相与0.15mL>

2、Tricine-SDS-PAGE电泳

2.1、用超纯水清洗电泳玻璃板和胶条，烘干后按仪器说明进行安装，然后用1.5％的琼脂封胶。

2.2、电泳试剂及胶的配制：按表3与表4的配方配制电泳试剂和电泳胶，从下至上依次为分离胶、夹层胶、浓缩胶，插入样品梳，凝胶聚合后，在上、下电泳槽内分别加入阴极缓冲液与阳极缓冲液，小心拔出梳子，可准备上样。

表3 电泳试剂配方

表4 凝胶配方

2.3、样品与Marker的处理及上样：将30μL蛋白质样品与10μL4×loading buffer混匀后，与Marker一同放入沸水浴中加热5min后即可用微量进样器依次上样。

2.4、电泳：上样完成后，插上电极，接通电源进行电泳。先将电压调至20V电泳20min，以利于胶孔疏松。然后以60V电压进行电泳，样品进入分离胶后，将电压调至80-100V。当溴酚蓝迁移至分离胶底部时，停止电泳，关闭电源，撬开玻璃板取出凝胶。由于电压加大时缓冲液温度会升高，小分子蛋白易被降解，所以电泳过程宜在4℃冰箱中进行。电泳完成后，取出凝胶，进行固定、染色和脱色处理。

如图3所示，Nisin的分子量为3.5kDa，但是在电泳图中标准品与样品均在5.8-6kDa有条带，原因是Nisin抑菌作用需要一条前导肽辅助吸附在细胞表面，才能发挥抑菌效果，这条前导肽的大小为2.35kDa，说明电泳图中发酵液与[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系上相有Nisin的目的条带，而7.8-10kDa处的条带可能是Nisin作为二聚体或四聚体的存在形式，说明离子液体双水相体系对Nisin具有一定的富集纯化效果。

三、[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系分配发酵液的抑菌试验结果

如图4所示，对[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系分配发酵液的抑菌试验，其中a为上相，b为下相，c为标准品5000IU/mL，d为Nisin悬浮液，其中a和b都经过CH₂Cl₂萃取过[Bmim]Cl的溶液，c和d未经什么处理。从图4可以看出发酵液中具有抑菌效果的Nisin富集在[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系上相中。

四、蛋白回收率结果

测定的是Nisin悬浮液在离子液体双水相[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系萃取后，总蛋白的回收率如图5所示，测定的是Nisin悬浮液在离子液体双水相[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系萃取后，总蛋白的回收率，白色柱子对应离子液体双水相体系上相的蛋白回收率，黑色柱子对应离子液体双水相体系下相的蛋白回收率，说明蛋白质成分富集在[Bmim]Cl-K₂HPO₄体系的上相中。回收率为95-97％。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。