一种获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系的方法

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系的方法。所述方法包括以下步骤：BtTRP基因突变品系的获得、获得亲本F0代、获得杂交F1代、自交F2代；高温胁迫检测，及低温胁迫检测，获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系的方法。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)属半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，小粉虱属Bemisia，属于世界性的入侵害虫。烟粉虱MED隐种自2003年首次在中国云南昆明发现，至今为止，已几乎遍布全国各省，并逐渐取代烟粉虱MEAM1隐种，成为危害我国农作物的主要烟粉虱隐种。对于烟粉虱MED隐种快速入侵适应并在我国成为优势种的机制研究备受研究者的青睐，其中入侵机制的分子生物学研究是研究热点之一。但由于烟粉虱是非模式物种，相关的基因组信息比较少，能进行机理研究的实验工具和手段也比较缺乏，因此对其发生机制仍不清楚。Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)技术的诞生打破了模式物种与非模式物种之间的壁垒，使得在非模式物种中进行遗传修饰变成现实。

CRISPR/Cas是细菌特有的一种获得性免疫系统，其原理是通过在生物基因组特定位点制造DNA双链断裂(double-strand break，DSB)损伤，从而激活机体自身的DNA损伤修复机制，在此过程中引发各种变异。CRISPR/Cas9技术的诞生打破了模式物种与非模式物种之间的壁垒，使得在非模式物种中进行遗传修饰变成现实。然而，CRISPR/Cas9系统存在脱靶效应的问题，限制其从核基因水平抑制目的基因表达的技术效果，难以达到持久稳定的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系的方法。

根据本发明的获得CRISPR/Cas9系统诱导的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系的方法包括以下步骤：

(1)BtTRP基因突变品系的获得，包括以下步骤：

(1-1)BtTRP基因sgRNA引物的设计：

基于烟粉虱MED隐种的BtTRP基因序列，设计sgRNA的靶标位点，引物序列如下：

MED-F：

GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGA

AATAGC；

sgRNA-R：

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAAC

TTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC，

(1-2)合成BtTRP基因sgRNA，

(1-3)合成Cas9mRNA，

(1-4)显微注射，将步骤(1-2)获得的BtTRP基因sgRNA和步骤(1-3)获得的Cas9mRNA混合，摩尔比为2:1，注射至烟粉虱MED隐种红眼期伪蛹，培育获得BtTRP基因突变品系；

(2)获得亲本F0代；

(3)获得杂交F1代；

(4)获得自交F2代；

(5)高温胁迫检测，及低温胁迫检测，获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系。

根据本发明的获得CRISPR/Cas9系统诱导的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系的方法，其中，在步骤(1-4)中，注射后的烟粉虱MED隐种红眼期伪蛹的培育条件为：温度为26±1℃，相对湿度60-80％，光周期为16L:8D。

本发明基于烟粉虱CRISPR/Cas9系统平台，研究CRISPR/Cas9系统诱导烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变的遗传性分析。

本发明通过CRISPR/Cas9系统构建的烟粉虱MED隐种突变品系和烟粉虱MED隐种野生型品系进行杂交，对杂交后代的高低温胁迫检测，进而探究CRISPR/Cas9系统诱导基因突变的可遗传性。本发明使用CRISPR/Cas9系统所诱导的基因突变可通过种系间遗传给后代，形成稳定的突变品系，为进一步利用诱导基因突变来实现害虫的生物防治提供理论基础。

附图说明

图1不同杂交组合F2代烟粉虱之间耐热性表型值差异，即观察高温胁迫后击倒时间。数据为均值±标准误，单个处理样本量为500头。小写字母表示耐热性存在显著差异。(P＜0.05)

图2不同杂交组合F2代烟粉虱之间耐寒性表型值差异，即观察低温胁迫后恢复时间。数据为均值±标准误，单个处理样本量为500头。小写字母表示耐热性存在显著差异。(P＜0.05)

具体实施方式

实施例1：烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变品系的获得

1、BtTRP基因sgRNA引物的设计：

基于烟粉虱MED隐种的BtTRP基因序列，设计sgRNA的靶标位点，引物序列如下：

MED-F：

GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGA

AATAGC；

sgRNA-R：

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAAC

TTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC。

2、合成BtTRP基因sgRNA：

3、合成Cas9mRNA

4、显微注射

注射试剂：在30μL体系中，将0.5μg sgRNA和10μg Cas9mRNA混合(大约摩尔比为2:1)，溶于3μL 3M的醋酸钠溶液中(pH 5.2)，并用3倍体积的无水乙醇沉淀浓缩(-20℃过夜沉淀)。12000rpm离心30min，加75％的乙醇，12000rpm离心5min，重复一次，注射前用11μL水重悬。

注射方法：收集烟粉虱MED隐种红眼期伪蛹，排列并粘附在事先贴有透气双面胶的盖玻片表面上。使用Femtojet Express(Eppendorf)，femtotip II针(Eppendorf)和InjectMan NI 2显微注射仪，从尾端注射，注射压强为1100hPa左右，注射时间为0.1s。

培育方法：将盖玻片放置在琼脂培养基上，放入人工气候箱中使其完成发育。温度为26±1℃，相对湿度60-80％，光周期为16L:8D。

5、BtTRP基因突变品系获得

上述所获得的显微注射sgRNA和Cas9mRNA混合液诱导形成的突变型烟粉虱即为烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变品系。

实施例2：CRISPR/Cas9系统诱导的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变品系的遗传性分析

通过CRISPR/Cas9技术获得烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变品系：sgRNA引物的设计和合成、Cas9mRNA的合成、显微注射和BtTRP基因突变品系的获得，同实施例1。

(1)亲本F0代的获得：室温下收集初羽化的BtTRP基因突变品系(显微注射sgRNA和Cas9mRNA混合液诱导形成的突变型烟粉虱)(＜3h)于离心管，每管一头，在显微镜下观察并区分雌雄，进行分组并记录，作为基因突变品系的亲本F0代，“培育方法”同实施例1。同理，收集初羽化的野生型烟粉虱(＜3h)于PCR管，每管一头，在解剖镜下观察并区分雌雄，进行分组并记录，作为野生型F0代，“培育方法”同实施例1。

(2)杂交F1代的获得：将辨明雌雄并分组的F0代烟粉虱按照表1的组合进行杂交后，放置于棉花上产卵3天，产卵后的棉花置于人工气候箱内饲养(温度为26±1℃，相对湿度60-80％，光周期为16L:8D)。3天后，收集烟粉虱于PCR管。每个组合5个重复，每个重复100对成虫。培养25天左右，收集小于3天虫龄的烟粉虱作为F1代。

表1杂交组合处理

(3)自交F2代的获得：收集F1代初羽化的烟粉虱(＜3h)于PCR管，每管一头成虫，在解剖镜下观察区分雌雄进行分组，在同一杂交组合的F1代中选取雌雄个 体，放置于棉花上产卵3天，产卵后的棉花置于人工气候箱内饲养(温度为26±1℃，相对湿度60-80％，光周期为16L:8D)。3天后，收集烟粉虱于PCR管。每个组合5个重复，每个重复100对成虫。培养25天左右，收集小于3天虫龄的烟粉虱作为F2代。

(4)杂交后代高温胁迫处理统计击倒时间：用吸虫器收集初羽化烟粉虱成虫(＜3h)，放入PCR管，管口塞已消毒的脱脂棉团，每管1头成虫，分别编号。将装有烟粉虱的PCR管5个一组，同时插入漂浮板，将漂浮板置于由德国Huber温度控制器(CC-106A,Germany,HuberGmbH)控温的水浴槽内，温度提前设置为恒温45℃，保持液面与脱脂棉团下端齐平，使整个PCR管腔体都浸没水中。在PCR管置于水浴槽内1min后，开始计时，观察管内烟粉虱的活动状态，以烟粉虱失去对身体的控制能力，无法自主站立作为热击倒计时结束的标准，并将这段时间作为高温击倒时间TKD(heat knockdown time)。

如图1所示，不同杂交组合F2代烟粉虱之间耐热性表型值差异，即观察高温胁迫后击倒时间。数据为均值±标准误，单个处理样本量为500头。小写字母表示耐热性存在显著差异。(P＜0.05)。

(5)杂交后代低温胁迫处理统计恢复时间：用吸虫器收集初羽化烟粉虱成虫(＜3h)，放入PCR管，管口塞已消毒的脱脂棉团，每管1头成虫，分别编号。将装有烟粉虱的PCR管10个一组，同时插入塑料泡沫制成的漂浮板，将漂浮板置于由德国Huber温度控制器(CC-106A,Germany,HuberGmbH)控温的内置温控腔体内，腔体内温度提前设置恒温于-5℃，保持液面与脱脂棉团下端齐平，使整个PCR管腔体浸没水中，并将低温腔体盖严。在PCR管置于水浴槽内10min后，迅速将其取出，擦干管壁上的水，置于室温26℃环境下，开始计时。观察管内烟粉虱的活动状态，以烟粉虱逐渐恢复对身体的控制能力，能够自主站立作为冷击倒恢复计时的标准，将这段时间作为冷致昏恢复时间TRC(chillcomarecovery time)。

如图2所示，不同杂交组合F2代烟粉虱之间耐寒性表型值差异，即观察低温胁迫后恢复时间。数据为均值±标准误，单个处理样本量为500头。小写字母表示耐热性存在显著差异 (P＜0.05) 。