大豆MYB转录因子基因提高大豆异黄酮生物合成的应用

摘要

本发明涉及一种大豆MYB转录因子基因提高大豆异黄酮生物合成的应用，属于基因工程技术领域。GmMYB9基因大小为1188bp，编码395个氨基酸；酵母单杂交实验结果表明GmMYB9具有转录激活活性，亚细胞定位结果证明GmMYB9定位在细胞核中；实时荧光定量PCR结果表明GmMYB9在大豆未成熟胚向成熟种子发育过程中的表达趋势与异黄酮的积累趋势一致，在高异黄酮品种中的表达量高于异黄酮含量低的品种；转化GmMYB9基因的T

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及大豆MYB转录因子GmMYB9基因提高大豆异黄酮生物合成的应用。

背景技术

大豆含有丰富的蛋白质和油脂，是重要的粮食和经济作物。大豆中的异黄酮能够提高植物防御非生物胁迫的能力，同时在人类的营养和健康方面具有诸多功效。异黄酮合成途径是植物苯丙烷类代谢途径的分支途径，苯丙烷类代谢在植物中普遍存在，但异黄酮主要在豆科植物中合成，它的积累受遗传因素和环境因素共同决定。

异黄酮代谢途径由多个关键酶共同催化完成，单独调节某一个关键酶无法获得预期的结果。但是MYB转录因子基因通过与异黄酮合成途径关键酶基因的启动子结合，能够调控多个关键酶基因的表达和mRNA转录的起始，进而参与调控异黄酮的生物合成。因此，研究大豆的MYB转录因子，分析其在转录水平上对异黄酮生物合成的调控，阐明其相关功能，有助于进一步了解大豆异黄酮的调控机理。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆MYB转录因子GmMYB9基因提高大豆异黄酮生物合成的应用。

大豆异黄酮含量属于数量性状，是定量遗传类型。近年来，已有研究报道显示位于数量性状位点(Quantitative Trait Locus,QTL)附近的基因能够调控相应的数量性状，如玉米籽粒行数QTL附近的FASCIATED EAR2通过调控每穗玉米的籽粒行数来提高玉米产量，所以我们将目标聚焦在位于大豆异黄酮QTL附近的MYB类转录因子。为了降低遗传因素及环境因素对大豆异黄酮含量的影响，我们比较分析前人的研究结果，选取不同品种的自交系在不同年份、不同地点定位到的位于大豆第6号染色体上游、与大豆异黄酮合成相关的2个QTL，GLY1和qGm06，在qGm06的closet marker下游0.3cM处找到候选MYB转录因子基因GmMYB9，到目前为止，关于GmMYB9的作用还未见报道。

本发明利用gateway技术构建GmMYB9的植物表达载体，通过农杆菌介导的大豆胚尖遗传转化方法将GmMYB9转入大豆中，获得T₂代转基因大豆，用高效液相法(HPLC)测量T₂代转基因大豆的叶片及种子中的异黄酮含量，与野生型相比，转基因植株种子异黄酮含量提高了1.11倍，叶片异黄酮含量提高了1.56倍，叶片中的异黄酮含量提升幅度更高，说明GmMYB9基因主要在叶片中调控异黄酮的生物合成。在前人的研究中，R1-MYB转录因子GmMYB176能够在发根中调控大豆异黄酮的生物合成；玉米的CRC基因(玉米R2R3-MYB类转录因子与bHLH类转录因子的基因融合序列)在大豆种子中超表达，总异黄酮的含量提高了3倍多，若表达CRC的同时抑制与IFS竞争底物的酶基因F3H(flavanone>

本发明所提供的大豆MYB转录因子GmMYB9，编码基因如SEQ ID No.1所示，它是由395个氨基酸残基组成的蛋白质，序列如SEQ ID No.2所示，属于典型的R2R3型大豆MYB转录因子。

本发明所提供的大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酮生物合成中的应用。

本发明所提供的大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆叶片中异黄酮生物合成中的应用。

利用任何一种能够引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的GmMYB9编码基因导入植物细胞，可获得异黄酮含量提高的转基因细胞系及转基因植株。使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)。携带有本发明GmMYB9的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因对改良豆科植物异黄酮代谢，特别是培育高异黄酮大豆品种具有重要意义。

附图说明

图1是GmMYB9的PCR扩增结果图，M.DNA Marker(DL2000)，1.PCR结果；

图2是GmMYB9在酵母系统中的激活能力分析图；

图3是亚细胞定位载体转化农杆菌菌液PCR图，M.DNA Marker(DL2000)，1-2PCR结果；

图4是GmMYB9的亚细胞定位结果图；

图5是GmMYB9在大豆不同组织中的表达图；

图6是连接CHS8启动子序列的pCAMBIA1301载体转化农杆菌电泳图，M.DNA Marker(DL2000)，1-2PCR结果；

图7是烟草叶片GUS活性分析图，A:CK；B:CaMV 35S；C:CHS8promoter；D:CHS8promoter+GmMYB9；

图8是植物表达载体转化农杆菌菌液PCR电泳图，M.DNA Marker(DL2000)，1-4PCR结果；

图9是部分T₀、T₁、T₂代转基因植株的PCR检测结果图，M：DNA>

图10是部分T₂代转基因植株的Southern>

图11a是野生型与T₂代转基因植株的种子异黄酮含量图，WT：野生型大豆；1-3：转化pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的植株；

图11b是野生型与转化基因GmMYB9的T₂代转基因植株的新鲜叶片异黄酮含量图，WT：野生型大豆；1-3：转化pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的植株；

图12是GmMYB9在转基因植株中的表达量图，WT：野生型大豆；1-3：转化pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的植株；

图13是转GmMYB9基因T₂代叶片中异黄酮合成关键酶基因的表达量分析图；WT：野生型大豆；1-3：转化pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的植株。

具体实施方式

实施例1、大豆GmMYB9基因的克隆

用RNAiso Plus(购自TaKaRa)提取大豆品种Williams 82的20d胚总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H^-)的说明书进行。根据GmMYB9的全长序列设计引物，引物为：

GmMYB9-F：AACAACATAGAGAGCCATAATACCC

GmMYB9-R：CATAGACTCCTCTTTCAAACACCTC

按照表1反应体系进行PCR扩增：

表1PCR扩增反应体系

PCR反应程序为：95℃4min；94℃30s，57℃50s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。经PCR扩增得到GmMYB9基因，如图1所示，由1188个碱基对组成，读码框自5'端第1位到第1188位碱基，编码一个由395个氨基酸残基组成的蛋白质，其中自氮端第13-63和66-114个氨基酸残基保守结构域是典型的MYB结合域。

实施例2、大豆GmMYB9基因在酵母中的表达

在基因的5'端和3'端分别设计含EcoR I和Sal I酶切位点的引物，以测序鉴定正确的pMD18-T-GmMYB9的质粒为模板，进行PCR扩增，pMD18-T购自TaKaRa公司。引物如下(用下划线标出酶切位点)：

GmMYB9-HF：5'-CCGGAATTCATGGGAAGGAGTCCTTGC-3'，EcoR>

GmMYB9-HR：5'-ACGCGTCGACCTACAGATACTGAATGTA-3'，Sal>

将扩增产物经琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(购自BioTeke公司)纯化后，用EcoRI和Sal I双酶切，回收纯化后，与同样用EcoR I和Sal I双酶切的pGBKT7(购自clontech)载体连接。连接产物转化埃希氏大肠杆菌(E.coli)DH5α，经验证后，转入酵母AH109(购自clontech)中表达。

酵母感受态制备及转化方法参照Matchmaker^TMOne-HybridLibraryConstruction&Screening>

重组质粒pGBKT7-GmMYB9转入酵母AH109后，能够在含有5mM 3-AT的营养缺陷型培养基SD/-Trp/-His/-Ade(图2)上生长，说明GmMYB9具有转录激活活性，是转录激活子。

实施例3、大豆GmMYB9基因的亚细胞定位研究

去掉GmMYB9的终止密码子，采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法构建GmMYB9与绿色荧光蛋白基因eGFP的融合基因，在5'端和3'端分别设计含Xba I和SacI酶切位点的引物，以鉴定正确的pMD18-T-GmMYB9及peGFP-X1为模板，分别以O-F3和O-R3、O-F4和O-R4为成对引物进行普通PCR扩增，PCR产物回收后做好标记。引物如下(用下划线标出酶切位点)：

GmMYB9-SOE-F(O-F3):5'-GCTCTAGAATGGGAAGGAGTCCTTGC-3',Xba>

GmMYB9-SOE-R(O-R3):

5'-CACCATCAGATACTGAATGTACTT-3'(波浪线代表连

接目的基因与报告基因之间的Linker)

eGFP-SOE-F(O-F4):

5'-GTATCTGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3'

eGFP-SOE-R(O-R4):5'-CGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTC-3',SacI

以回收的GmMYB9和eGFP作为模板，O-F3和O-R4为引物，选用高保真酶Primer Star(购自TaKaRa)进行SOE-PCR，以获得GmMYB9:eGFP融合基因。反应体系如表2所示：

表2SOE-PCR扩增体系

反应程序为：94℃5min

95℃10s，68℃-1℃/cycle 20s,68℃3min，10cycles

95℃10s

46℃20s，68℃3min，22cycles

68℃10min

10℃forever

将扩增产物经琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(购自BioTeke公司)纯化后，用XbaI和SacI双酶切，回收纯化后，与同样用Xba I和SacI双酶切的pBI121(本实验室保存)载体连接。连接产物转化埃希氏大肠杆菌(E.coli)DH5α，经验证后，转入根癌农杆菌EHA105(本实验室保存)中表达。

根癌农杆菌EHA105感受态的制备采用常规的CaCl₂法。

重组质粒pBI121-GmMYB9:eGFP转入根癌农杆菌EHA105后(图3)，转化洋葱表皮细胞，制作临时装片，在激光共聚焦显微镜下观察GmMYB9的定位情况，结果表明GmMYB9定位在细胞核中(图4)。

实施例4、大豆GmMYB9基因的组织特异性表达

分别提取大豆Williams 82根、茎、叶、花、荚及20d、30d、40d、50d未成熟胚，大豆Williams 82成熟种子、大豆垦鉴35成熟种子的总RNA，并反转录成cDNA，方法同实施例1。利用实时荧光定量PCR对GmMYB9基因在大豆Williams 82不同组织及大豆垦鉴35成熟种子中的表达情况进行检测。按照SYBR Premix Ex Taq(购自TaKaRa)说明书，在实时荧光定量PCR仪ABI 7500中进行。以大豆β-tubulin为内参基因，引物如下：β-Tublin-F：5'-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3'

β-Tublin-R：5'-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3'

GmMYB9-Q-F：5'-TAAGCCAAGAAGAAGAGCAGAC-3'

GmMYB9-Q-R：5'-CGTTATCAGTTCGCTTTGGTA-3'

PCR反应体系如表3：

表3实时荧光定量PCR反应体系

反应程序为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，72℃30s，40个循环。

采用2^-ΔΔCT法分析数据，确定基因的相对表达量。试验共设3次技术重复，3次生物学重复。

结果(图5)表明GmMYB9基因在大豆Williams 82各组织部位均有表达，在叶片中的表达量最高，是成熟种子中的10倍。随着大豆未成熟胚生长时间的延长，GmMYB9基因的表达量也随之升高，这与前人研究的异黄酮在大豆未成熟胚中的积累趋势一致。同时在不同品种大豆种子中的表达量也不同，在异黄酮含量较高的Williams82中的表达量要高于异黄酮含量较低的垦鉴35，表明GmMYB9基因在大豆异黄酮合成途径中可能具有调控作用。

实施例5、大豆GmMYB9基因对CHS8基因的调控作用

植物表达载体的构建方法与实施例2方法相同。将GmMYB9亚克隆于植物表达载体pCAMBIA1301中，用CHS8的启动子(CHS8P)替换pCAMBIA1301的CaMV35S启动子构建表达载体pCAMBIA1301-CHS8P，鉴定正确后，转化农杆菌EHA105(图6)。

采用农杆菌介导法转化烟草叶片。用去掉针头的1ml注射器，将分别含有pCAMBIA1301空载体，pCAMBIA1301-CHS8P载体，及pCAMBIA1301-CHS8P与pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9两种载体质粒的农杆菌EHA105的重悬液及不含载体的重悬液(菌体重悬后OD600约为0.2)，从烟草叶片背部缓慢注入，用记号笔做好标记，侵染后，在16h光照、8h黑暗光周期，22℃条件下，保湿培养2d。

GUS荧光测定

5.1GUS酶提取

1)取0.1g烟草叶片，去掉主叶脉，放入研钵中，加入液氮研磨成粉末；

2)将研磨好的粉末放入预先称重且过液氮预冷的离心管中，再次称重，记录加样前和加样后离心管的重量(两次差值即为样品重量)，向离心管中加入600μl的酶提取缓冲液，涡旋混匀；

3)4℃，12000rpm离心10min，取上清，-80℃保存备用。

5.1Bradford法测定GUS提取液的蛋白含量

1)按照表4配置BSA浓度梯度液，按照1:5的比例与考马斯亮蓝G250溶液混匀，室温放置5min，在波长595nm处测定吸收值，以蛋白浓度为横坐标、吸收值为纵坐标制作标准曲线：

表4BSA梯度溶液

2)吸取20μl GUS提取液，补水至4ml，混匀后吸出1ml，加入考马斯亮蓝G250溶液5ml，混匀后室温放置5min，在波长595nm测定吸收值，根据回归方程计算样品中蛋白含量。

5.3荧光测定

1)标准曲线的制作：配制10μm 4-MU母液，用反应终止液对其进行线性稀释，浓度依次为1000nmol/L、500nmol/L、250nmol/L、125nmol/L、62.5nmol/L，在激发光365nm、发射光455nm，狭缝3nm条件下用荧光分光光度计测定各荧光强度，制作标准曲线；

2)取6支1.5mL离心管，各加入900μl反应终止液，编号；

3)取1支1.5mL离心管，加入1mL在37℃预热的检测液2mmol/LMUG，加入适量GUS提取液(以测定的蛋白浓度为依据)，迅速充分混合，取出100μl加入1号管中，记录此时反应时间为0，严格计时；

4)反应管放入37℃水浴保温进行酶反应，分别于5、10、15、30、60min时各取出100μl加入装有900μl反应终止液的2-6号管中混匀，分别为酶反应5、10、15、30、60min时的样品，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝3nm条件下测定各荧光强度，通过标准曲线读取2-6号管中4-MU含量。

5.4GUS酶活性计算

1)酶活力单位定义：每分钟水解4-MUG生成1nmol或1mg、1μg、1ng 4-MU的酶量为一个活力单位，根据定义求出各样品的酶活力；

2)GUS基因表达活性：以每毫克蛋白的酶活力表示，以每毫克蛋白每分钟催化MUG生成1pmol 4-MU作为GUS的一个活性单位。

荧光测定结果(图7)显示，侵染重悬液的烟草叶片荧光值较低；侵染含有CaMV35S启动子与CHS8启动子的pCAMBIA1301质粒载体的烟草叶片的GUS荧光值提高；共侵染pCAMBIA1301-CHS8P与pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9质粒载体的烟草叶片的GUS荧光值比单独侵染pCAMBIA1301-CHS8P质粒载体的要高。这就表明，转入了GmMYB9基因确实对CHS8基因有调控作用，使共转化的烟草叶片GUS荧光活性升高。而CHS8基因是植物异黄酮合成途径中的关键酶。

实施例6、GmMYB9在大豆中的表达及对异黄酮生物合成途径调控的分析

利用gateway技术构建植物表达载体pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9，参照invitrogen公司提供的方法。采用农杆菌介导的大豆胚尖遗传转化将植物表达载体pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9(图8)转化大豆吉林35，并对转基因植株进行PCR、Southern blot鉴定，同时检测阳性植株中目的基因表达量、大豆异黄酮含量及异黄酮合成路径上关键酶基因的表达量，具体方法及结果如下：

6.1大豆胚尖的遗传转化及筛选

1)种子消毒：挑取籽粒饱满、表面光滑的大豆吉林35种子平铺于干净的培养皿中，在通风橱内，将培养皿敞开放在干燥器中，将装有52ml水和44ml次氯酸钠的250ml烧杯也放入干燥器中，沿烧杯内壁缓慢加入4ml浓盐酸，迅速合上干燥器的盖子密封，灭菌12h。灭菌结束后，用保鲜膜密封培养皿的接缝处，置于超净工作台中打开培养皿，吹20-30min去除多余的氯气；

2)挑取含有pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的农杆菌单克隆于2ml附加50mg/L rif和50mg/L Km的液体YEP培养基中，28℃160rpm振荡培养24h；

3)取1ml上述菌液倒入200ml含同样抗生素的液体YEP中，28℃250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右；

4)将培养后的菌液转入50mL无菌离心管中，室温5000rpm离心10min弃上清、收集菌体，将菌体重悬于附加0.02％silwet77的1/2MS液体培养基中(pH 5.4)，冰浴1h活化菌液；

5)将灭菌后的大豆转入附加2mg/L 2,4-D的液体MS培养基中，25℃暗培养12-16h；

6)在超净工作台中，用手术刀和镊子分离大豆胚尖，放置于活化好的菌液中，真空侵染15min，将侵染后的胚尖置于附加5mg/L 6-BA的1/2MS固体培养基上(pH5.4)，25℃黑暗条件共培养2-3d；

7)将共培养后的大豆胚尖转入附加0.6mg/L Basta、250mg/L Cef的1/2MS固体诱芽筛选培养基中(pH 5.7-5.8)，25℃/22℃16/8h光照/黑暗条件下培养，2周后将胚尖转移到新的诱芽筛选培养基中；

8)经过4周筛选后，用剪刀剪取幼芽部分转入附加0.5mg/L IBA、100mg/L Cef的3/8MS固体生根培养基中；

9)4周后，将生根的幼苗炼苗2-3d，洗净根部的培养基移入装有大田土：草炭：蛭石(1:1:1)的营养钵中，在28℃/22℃16/8h光照/黑暗条件的人工气候室中培养。

6.2转基因植株的PCR检测

1)提取转化植株的叶片总DNA，方法参照Universal Genomic DNA ExtractionKit Ver.3.0(购自TaKaRa)说明书进行。

2)将大豆叶片总DNA稀释30倍，取1μl作模板，以未转化的野生型大豆为阴性对照，质粒pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9为阳性对照，以bar-F、bar-R为引物进行PCR扩增验证，引物序列如下：

bar-F：5'-AAACCCACGTCATGCCAGCTC-3'

bar-R：5'-CGACAAGCACGGTCAACTTC-3'

3)收获PCR检测为阳性的植株种子，即T₀代种子，

4)将T₀代种子种植后在人工气侯室中培养，按上述方法继续筛选后收获T₁代种子；

5)将T₁代种子种植在吉林大学植物科学学院转基因安全释放基地，对T₂代植株及其种子做进一步研究。

图9为GmMYB9在部分T₀、T₁、T₂代转基因大豆中的PCR鉴定结果。结果表明，GmMYB9基因已经整合到大豆基因组中。

6.3T₂代转基因植株的Southern>

首先对种植在转基因安全释放基地中的T₂代植株叶片进行PCR检测，记录好阳性植株。然后提取阳性植株的叶片总DNA，参照Soutern杂交试剂盒DIG>2代植株进行Southern>2代植株的Southern>

6.4转基因大豆植株异黄酮含量的检测

T₂代转基因植株的种子收获后，用高效液相法(HPLC)测量PCR及Southern>

表5野生型与T₂代转基因植株的种子异黄酮含量

表6野生型与转化基因GmMYB9的T₂代转基因植株的新鲜叶片异黄酮含量

6.5转基因植株中GmMYB9的表达量检测

提取GmMYB9转基因T₂代阳性植株及野生型的叶片RNA，反转录成cDNA后，以GmMYB9-Q-F、GmMYB9-Q-R为引物，利用实时荧光定量PCR检测GmMYB9在转基因植株及野生型中的表达量。结果如图12所示，与野生型相比，GmMYB9在转基因株系中表达量均有显著提高，说明GmMYB9成功转入大豆中，并能稳定遗传。

6.6转基因植株中异黄酮合成途径上各关键酶基因的表达分析

分别提取野生型及转GmMYB9基因T₂代叶片的总RNA，反转录成cDNA作模板，利用实时荧光定量PCR检测异黄酮合成途径中的关键酶基因PAL1(Phenylalanine>

GmPAL1-F：5'-TCAGAGTCAGCGAGAGAAGGAG-3'

GmPAL1-R：5'-GGTGGTGACGCCGTAACTG-3'

GmCHS8-F：5'-ATCCGCCAGGCACAAAGG-3'

GmCHS8-R：5'-TGAAGTAGTAGTCAGGATAGGTGCT-3'

GmIFS2-F：5'-AAGCCTCGTCTTCCCTTCATAG-3'

GmIFS2-R：5'-CAAAGTAGAGAGAGAATAAGGGACC-3'

GmCHI-F：5'-TGTATCAGCGGCGGTCTTG-3'

GmCHI-R：5'-TCAATACCGCAGGCAATCG-3'

GmF3H-F：5'-TTCATTGTCTCCAGCCATCTCC-3'

GmF3H-R：5'-CGCTGTATTCCTCAGTCACCG-3'

结果如图13所示，我们可以看到在转GmMYB9基因的T₂代叶片中，与野生型相比，PAL1的表达量略有降低，IFS2的表达量略有升高，但都不具有统计学意义；F3H的表达量几乎没有变化；CHS8和CHI的表达量在各转基因株系中的表达量都达到了极显著水平，说明GmMYB9通过上调异黄酮合成路径上关键酶基因CHS8和CHI的表达量来调控异黄酮的生物合成。