一种从中国白酒发酵酒醅中提取总RNA的方法

摘要

本发明公开了一种从中国白酒发酵酒醅中提取总RNA的方法，属于生物技术领域。本发明针对白酒酒醅样品的特殊性，通过联合月桂酸钠(Sodium Laurate，SL)抽提法以及异硫氰酸胍‑酚‑氯仿抽提法(Trizol)，能在2小时内快速提取群落微生物的总RNA。利用本发明的方法提取的微生物总RNA产量高、完整性好、纯度较好，能有效提取样品中的真核和原核微生物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从中国白酒发酵酒醅中提取总RNA的方法，属于生物技术领域。

背景技术

现有技术条件下，95％以上微生物不可培养，这是传统微生物生态学在揭示自然界微生物群落结构、生态功能及其相互关系研究中的最大障碍。近年来，通过宏转录组学的方法，从mRNA水平上研究环境微生物，取得了很大的成功，且获得的结果更准确、可靠。随着对群落微生物的结构和功能研究的深入，需要提取某一种生态体系内全部微生物的总RNA作为分析群落微生物结构和功能的基本要求。

目前有的关于群落微生物的总RNA提取方法最接近的是提取土壤中群落微生物的总RNA，但是土壤微生物和中国酱香型白酒发酵酒醅相比，存在很大的不同。土壤中含丰富的腐殖酸、多糖、多酚等物质，使提取的微生物总RNA纯度不高，且环境中广泛存在着RNA酶，RNA易被其降解，给RNA提取带来了许多困难。酚类化合物在匀浆时极易被氧化成醌类物质，与RNA不可逆地结合，从而影响总RNA的分离纯化。多糖的许多理化性质与RNA相似，在提取过程中能与RNA共沉淀，难以分离。与土壤的情况不同的是，白酒酒醅中主要是各种粮食，主要是高粱。粮食中不仅富含多糖多酚，而且在微生物的利用过程中产生了更多的次级代谢产物。各种次级代谢产物更是会和RNA发生难以预料的反应。

目前RNA的提取方法主要是异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(Trizol)、十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)法、十六烷基三甲基溴化铵(CetyltrimethylammoniumBromide，CTAB)法和热硼酸法等。其中SDS法针对原核微生物的总RNA提取效果较好，但是针对有细胞壁的真核微生物，SDS的破壁效果非常不好，所以无法使用在既有真核又有原核的群落微生物总RNA提取中。而CTAB法操作需要预热，温度过高会使得RNA降解酶变得活跃导致RNA被降解，同时CTAB法好使也比较长，操作麻烦，通常还需要LiCl配合使用。热硼酸法不仅需要添加蛋白酶，KCl等配合试剂，同时还需要你预热，温度过高也会使得RNA降解酶变得活跃导致RNA被降解。

此外，这些方法都是单一的针对某一类或某一种微生物，并不适用于提取群落微生物尤其是真核和原核微生物混合在一起的情况。通过对中国白酒的发酵酒醅进行16S和ITS扩增子的鉴别，发现在中国白酒半自然发酵的发酵方式，尤其是中国酱香型白酒的发酵方式决定了白酒的发酵酒醅中存在种类和数量众多的群落微生物，包括许多常见的以及特殊的真核和原核生物，尤其是各式各样的霉菌，酵母，细菌，放线菌等等。因此，开发一种简便的、适合快速提取群落微生物的总RNA的方法，尤其是适合白酒发酵过程的群落微生物的总RNA提取方法，是非常有必要的。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的是在于提供了一种从中国白酒发酵酒醅中提取总RNA的方法，通过联合月桂酸钠(Sodium Laurate，SL)抽提法以及异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(Trizol)，能在2小时内快速提取群落微生物的总RNA。利用本发明的方法提取的微生物总RNA产量高、完整性好、纯度较好，能有效提取样品中的真核和原核微生物。

所述从白酒发酵酒醅中提取总RNA的方法，步骤如下：

(1)将酒醅样品用无菌PBS缓冲液悬浮并加入玻璃珠漩涡震荡；

(2)低速离心后取上清，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤、低速离心，合并上清；

(3)将步骤(2)得到的上清高速离心，取沉淀，冷冻；

(4)将按体积份数计，由15-25份月桂酸钠抽提缓冲液、15-25份Trizol、0.5-1.5份巯基乙醇和0.5-1.5份二硫苏糖醇(m/V)组成的抽提混合液，轻轻混匀，放置冰上；

(5)将步骤(3)的冷冻的样品置于预冷的研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末，期间不断加入液氮，防止研磨过程中RNA被降解；

(6)将研磨好的粉末移入装有抽提混合液的Rnase-free离心管中，反复缓慢的摇匀；

(7)高速离心，吸取上清液置于RNase-free离心管中；

(8)加入0.8-1.2倍体积(相对于上一步吸取得到的上清液体积而言)的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，放置冰上；

(9)高速离心，吸取上清液置于Rnase-free离心管中；

(10)加入0.5-1倍体积(相对于上一步吸取得到的上清液体积而言)的异丙醇，混匀，冰上放置；

(11)高速离心，弃去上清液；

(12)加入体积浓度为70-80％的乙醇洗涤沉淀，高速离心后弃去上清液；

(13)加入RNase-Free ddH₂O，即得到溶解的RNA。

在本发明的一种实施方式，PBS缓冲液浓度为0.1mol/L(配置方法：42.3ml 1mol/LNaH₂PO₄和57.7mL>2HPO₄，用去离子水定容至1L后121℃灭菌15min)。

在本发明的一种实施方式，PBS缓冲液中含有0.25-0.5％(v/v)的腐殖酸清除剂。添加了腐殖酸清除剂后，得到的总RNA浓度浓度不变而纯度更高。

在本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中样品与PBS按照1:2(m/v)的比例混合，玻璃珠加量为样品量的1/5；震荡时间为2-3min。

在本发明的一种实施方式，所述步骤(2)的离心时间为4-8min。

在本发明的一种实施方式，Rnase-free离心管是采用的1.5mL的。

在本发明的一种实施方式，研磨好的粉末与抽提混合液是按照1:8-1:12(m/v)的比例添加，即每1g研磨好的粉末加入8-12mL抽提混合液。

在本发明的一种实施方式，所述低速离心是指450-550rpm，高速离心是指11000-13000rpm。

在本发明的一种实施方式，所述月桂酸钠抽提缓冲液：pH 8.0的Tris-HCl0.1mol/L，NaCl0.1mol/L，pH8.0的EDTA 0.02mol/L，月桂酸钠10g/L，pH 8.0。

在本发明的一种实施方式，所述Trizol试剂可以是Invitrogen公司的Reagent，Sigma公司的TRI等，也可以是上述公司的Trizol试剂按照一定比例混合得到的。

在本发明的一种实施方式，步骤(3)、(7)、(9)、(11)的离心的时间为8-15min，步骤(12)的离心的时间为2-5min。

在本发明的一种实施方式，所述步骤(6)中反复缓慢摇匀10-25min。

在本发明的一种实施方式，步骤(7)、(9)、(11)、(12)的离心是在0-4℃的条件下进行的。

在本发明的一种实施方式，所述步骤(8)放置冰上0.5-2min。

在本发明的一种实施方式，所述步骤(10)在冰上放置15-25min。

在本发明的一种实施方式，步骤(12)加入的乙醇体积为1mL。

在本发明的一种实施方式，步骤(13)是先室温放置1-2min，加入30-50uL RNase-Free ddH₂O。

在本发明的一种实施方式，所述方法具体是：

(1)取25g样品溶于50ml无菌0.1mol/L PBS(42.3ml 1mol/LNaH₂PO₄和57.7ml1mol/L>2HPO₄，用去离子水定容至1L后121℃灭菌15min)缓冲液悬浮，加入5颗5-6mm玻璃珠，漩涡震荡2-3min；

(2)500rpm离心5min，取上清，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤三次，离心后收集全部上清；

(3)将上清12000rpm离心15min，弃掉上清液，盖好管盖，液氮冷冻；

(4)准备抽提混合液(由20份月桂酸钠抽提缓冲液，20份Trizol，1份巯基乙醇和1份二硫苏糖醇组成)，轻轻混匀，放置冰上；

(5)研钵以液氮预冷，将样品置于研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末，期间不断加入液氮，防止研磨过程中RNA被降解；

(6)将研磨好的粉末(约0.15g)移入装有混合液的1.5mL Rnase-free离心管中，反复缓慢的摇匀15-20min；

(7)12000rpm 4℃离心10min后取出，小心吸取上清液置于1.5mL Rnase-free离心管中；

(8)加入等体积的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，冰上放置1min；

(9)12000rpm 4℃离心10min后取出，小心吸取上清液置于1.5mL Rnase-free离心管；

(10)加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，冰上放置15-25min；

(11)12000rpm 4℃离心10min，弃去上清液；

(12)加入1ml 75％(v/v)乙醇洗涤沉淀，12000rpm 4℃离心离心3min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，余下的液体用枪头吸出，注意不要吸到沉淀；

(13)室温放置1-2min，加入30uL RNase-Free ddH₂O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(13)中RNase-Free ddH₂O中还含有RNA保存试剂和Dnase。

本发明具有以下优点和效果：

1)操作方便：提取过程简单、易操作；克服了现有的SDS，CTAB和热硼酸抽提法中，需要预热，需要分批添加蛋白酶，KCl等配合试剂的缺点，有效防止高温加热容易加速RNA分解酶降解RNA的机率，预先混合

2)效果优良：操作过程，操作过程中全部液体试剂预先添加了RNA酶抑制剂，全部在低温下操作，尽可能的阻碍了RNA被降解，从而使RNA浓度能在900-1200ng/uL。

3)适用范围广：适用不同地区、不同来源的中国白酒酒醅中微生物总RNA的提取，通过后续宏转录组的分析，真核和原核微生物都有良好的提取率(图2)。

附图说明

图1：不同抽提方法下的抽提效果；其中泳道1为实施例1得到的RNA，泳道2为实施例2得到的RNA，泳道3为实施例3得到的RNA，泳道4为Trizol抽提法提取得到的RNA，泳道5为利用不加巯基乙醇的抽提混合液得到的RNA，泳道6为使用RNase-Free ddH₂O代替PBS得到的RNA；

图2：宏转录组分析。

具体实施方式

试剂配置：

(1)无菌0.1mol/LPBS缓冲液：

42.3mL 1mol/L NaH₂PO₄和57.7mL>2HPO₄，用去离子水定容至1L后121℃灭菌15min。

(2)月桂酸钠抽提缓冲液：

Tris-HCl(pH8.0)0.1mol/L；NaCl 0.1mol/L；EDTA(pH8.0)0.02mol/L；月桂酸钠10g/L。准确称取NaCl 5.844g，月桂酸钠10g置于1000mL烧杯中，加入100ml Tris-HCl(1mol/L)，40mL EDTA(0.5mol/L)和800mL RNase-free ddH₂O，用盐酸调节pH至8.0，定容至1L，灭菌后室温保存。

(3)Trizol试剂使用的是Invitrogen公司的TRIzol试剂。

(4)75％(v/v)乙醇：由7.5份无水乙醇和2.5份RNase-free ddH₂O配置。

实施例1：

按照以下方法提取中国酱香型白酒发酵酒醅的微生物总RNA：

(1)取25g样品溶于50mL无菌0.1mol/L PBS(42.3ml 1mol/LNaH₂PO₄和57.7ml1mol/LNa₂HPO₄，用去离子水定容至1L后121℃灭菌15min)缓冲液悬浮，加入5g玻璃珠，漩涡震荡2-3min；

(2)500rpm离心5min，取上清，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤三次，离心后收集全部上清；通过步骤(1)和步骤(2)去除了发酵酒醅中的除微生物以外的其余杂质，包过固体粮食以及溶于液体的多糖和杂酸；

(3)将上清12000rpm离心15min，弃掉上清液，盖好管盖，液氮冷冻；

(4)准备抽提混合液(由20份月桂酸钠抽提缓冲液，20份Trizol，1份巯基乙醇和1份二硫苏糖醇组成，其中液体按照体积份数算，固体按照质量份数算，质量比体积的单位为g/mL)，轻轻混匀，放置冰上；

(5)研钵以液氮预冷，将样品置于研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末，期间不断加入液氮，使微生物细胞破碎，并防止研磨过程中RNA被降解；

(6)将研磨好的粉末(约0.15g)移入装有混合液的1.5mL Rnase-free离心管中，反复缓慢的摇匀15-20min；

(7)12000rpm 4℃离心10min后取出，小心吸取上清液置于1.5mL Rnase-free离心管中；

(8)加入等体积的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，冰上放置1min；

(9)12000rpm 4℃离心10min后取出，小心吸取上清液置于1.5mL Rnase-free离心管；

(10)加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，冰上放置15-25min；

(11)12000rpm 4℃离心10min，弃去上清液；

(12)加入1ml 75％(v/v)乙醇洗涤沉淀，12000rpm 4℃离心离心3min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，余下的液体用枪头吸出，注意不要吸到沉淀；

(13)室温放置1-2min，加入30uL RNase-Free ddH₂O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。

实施例2：

按照以下方法提取中国清香型白酒发酵酒醅的微生物总RNA：

(1)取25g样品溶于50mL无菌0.1mol/L PBS缓冲液悬浮，加入5g玻璃珠，漩涡震荡2-3min；

(2)550rpm离心4min，取上清，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤三次，离心后收集全部上清；通过步骤(1)和步骤(2)去除了发酵酒醅中的除微生物以外的其余杂质，包过固体粮食以及溶于液体的多糖和杂酸；

(3)将上清11000rpm离心8min，弃掉上清液，盖好管盖，液氮冷冻；

(4)准备抽提混合液(由15份月桂酸钠抽提缓冲液、25份Trizol、0.5份巯基乙醇和1.5份二硫苏糖醇组成)，轻轻混匀，放置冰上；

(5)研钵以液氮预冷，将样品置于研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末，期间不断加入液氮，使微生物细胞破碎，并防止研磨过程中RNA被降解；

(6)将研磨好的粉末(约0.15g)移入装有混合液的1.5mL Rnase-free离心管中，反复缓慢的摇匀20min；

(7)12000rpm 4℃离心12min后取出，小心吸取上清液置于1.5mL Rnase-free离心管中；

(8)加入0.8倍体积的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，冰上放置1min；

(9)13000rpm 4℃离心15min后取出，小心吸取上清液置于1.5mL Rnase-free离心管；

(10)加入1倍体积的异丙醇，混匀，冰上放置15-25min；

(11)11000rpm 4℃离心8min，弃去上清液；

(12)加入70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，12000rpm 4℃离心离心3min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，余下的液体用枪头吸出，注意不要吸到沉淀；

(13)室温放置1-2min，加入30uL RNase-Free ddH₂O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。

实施例3：

按照以下方法提取中国浓香型白酒发酵酒醅的微生物总RNA：

(1)取25g样品溶于50mL无菌0.1mol/L PBS缓冲液悬浮，加入5g玻璃珠，漩涡震荡2-3min；

(2)450rpm离心8min，取上清，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤三次，离心后收集全部上清；通过步骤(1)和步骤(2)去除了发酵酒醅中的除微生物以外的其余杂质，包过固体粮食以及溶于液体的多糖和杂酸；

(3)将上清13000rpm离心12min，弃掉上清液，盖好管盖，液氮冷冻；

(4)准备抽提混合液(25份月桂酸钠抽提缓冲液、15份Trizol、1.5份巯基乙醇和0.5份二硫苏糖醇组成)，轻轻混匀，放置冰上；

(5)研钵以液氮预冷，将样品置于研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末，期间不断加入液氮，使微生物细胞破碎，并防止研磨过程中RNA被降解；

(6)将研磨好的粉末(约0.15g)移入装有混合液的1.5mL Rnase-free离心管中，反复缓慢的摇匀15min；

(7)11500rpm 4℃离心8min后取出，小心吸取上清液置于1.5mL Rnase-free离心管中；

(8)加入1.2倍体积的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，冰上放置1min；

(9)13000rpm 4℃离心12min后取出，小心吸取上清液置于1.5mL Rnase-free离心管；

(10)加入0.5倍体积的异丙醇，混匀，冰上放置15-25min；

(11)12000rpm 4℃离心15min，弃去上清液；

(12)加入1mL 80％(v/v)乙醇洗涤沉淀，12000rpm 4℃离心离心3min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，余下的液体用枪头吸出，注意不要吸到沉淀；

(13)室温放置1-2min，加入50uL RNase-Free ddH₂O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。

按照实施例1-3的方法得到的RNA溶液的电泳检测结果(图1)显示，使用本发明的月桂酸钠抽提法结合Trizol抽提法提取的总RNA均具有两条完整的28S和18S核糖体RNA条带(图1的泳道1-3)，而对照Trizol抽提法提取的总RNA基本不可见(图1的泳道4)，表明本发明的方法能够提取高质量的总RNA。

对照：

对照1：采用Trizol抽提法，具体是指将步骤(4)的抽提混合液换成Trizol(即不含有月桂酸钠抽提缓冲液、二硫苏糖醇和巯基乙醇)，其他步骤与实施例1一致；得到的总RNA电泳图如图1的泳道4。

对照2：抽提混合液中不加巯基乙醇；其他步骤与实施例1一致；得到的总RNA电泳图如图1的泳道5。此外，抽提混合液中不加二硫苏糖醇，或者同时不加二硫苏糖醇和巯基乙醇，得到的总RNA电泳图与图1的泳道5的类似。

对照3：使用RNase-Free ddH₂O代替步骤(1)和(2)中的PBS缓冲液，其他步骤与实施例1一致；得到的总RNA电泳图如图1的泳道6。

表1总RNA浓度

浓度(ng/uL)总含量(ug/uL)A260/280实施例1632.830.31.71实施例2933.260.11.82实施例3417.522.71.55对照1107.63.81.43对照282.82.41.29对照354.31.51.18

将实施例1得到的RNA进行宏转录组测序，结果如图2所示。结果表明，提取所得总RNA中既有结合酵母，毕赤酵母，酿酒酵母这一类真核微生物，也有乳酸菌，链球菌，放线菌这一类原核微生物，说明本提取方法可以有效地同时提取真核以及原核微生物。而且本提取方法并没有偏好性，可以完整地保存群落微生物中真核和原核微生物的比例。

综上，本发明的方法适用于各类白酒酒醅中总RNA提取，且提取效果良好，能够得到两条完整的28S和18S核糖体RNA条带，还可以将真核微生物和原核微生物的总RNA都提取出来，得到的RNA适合用于后续宏转录组学分析。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。