一种提高规模化培养斜生栅藻的采收效率的方法

摘要

本发明涉及一种提高规模化培养斜生栅藻的采收效率的方法，在斜生栅藻培养液中添加大型溞代谢物，同时在15℃‑20℃温度范围内培养。并且进一步优化大型溞的培养方法和获取方法，优化代谢物添加比例，在促使栅藻由单细胞形态转变为四细胞、八细胞等群体形态的同时，有效延长了群体维持时间；增加多细胞群体比例，从而大大改善藻体整体沉降特性，便于通过过滤、离心等方法进行藻细胞大规模采收。本发明的方法有效增加了栅藻藻体体积，提高微藻规模培养中的下游采收效率，降低整个生产过程的能量消耗。另外，添加的大型溞代谢物，是浮游动物正常代谢释放物质，对藻细胞无毒性效应，不影响其在食药加工等领域的应用价值及养殖水体的再循环利用。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体说是基于牧食者信息化学物质诱导微藻表型转变原理，通过优化培养牧食者及其代谢物添加比例，延长微藻群体维持时间，同时降低微藻培养温度，增强藻体整体沉降性能，从而提高规模化培养栅藻的采收效率的方法。

背景技术

单细胞微藻广泛分布在淡水和海洋中，是生物圈中初级生产力的重要组成部分，也是水生态系统中水产动物生长发育过程的直接或间接的活饵料。微藻种类繁多，在生态分布、种质资源、生化组成、代谢途径等方面具有复杂性和多样性，进而决定了其在食品、营养和保健等领域的潜在价值，开发微藻资源可获得人类大量需求的高附加值生物活性物质。同时，很多微藻细胞可在不良环境(如养殖废水、工业废水)中生长，有效去除氮、磷、金属等元素的同时，可积累大量蛋白质、油脂等物质，加之微藻具有生长速率快、代谢速率高、生长周期短等良好特性，利用微藻净化污水也正快速发展起来。

鉴于上述微藻资源的开发利用价值，微藻将成为新一代可再生生物资源库，其大规模开发利用正受到国内外各级政府和科技界的高度关注。但是，在微藻资源的规模化培养过程中，生产成本过高，整个生产过程中能源输入与输出不平衡，是限制微藻资源工业化应用的重要问题。其中，规模化培养中的藻体采收是制备微藻生物质能或获得微藻高附加值产品的关键步骤，是决定生产过程中能量投入的重要影响因素，对该阶段的技术改进将对降低生产成本有重要意义。

目前国内外关于微藻藻液浓缩与藻体采收已发展了几种方法，鉴于不同方法的原理区别，其有各自的应用范围与效率，主要技术概述如下：

1)絮凝沉降技术：该方法主要通过絮凝使藻体聚集成团从而依赖重力作用沉降，也是目前应用比较广泛的微藻采收技术。依据絮凝机制可分为电场介导絮凝、pH值介导絮凝、阳离子介导絮凝等方法。采用Fe³⁺、Al³⁺等阳离子絮凝剂已广泛应用于栅藻、小球藻等藻体采收，采收效果受藻液酸碱度影响较大，但因金属离子残留问题，在食品、药品级微藻领域的应用受到极大限制；由pH介导的藻体自发絮凝相比絮凝剂的使用操作要简单，絮凝效率也相对较高，但采收过程中易导致细胞发生解体及胞内成分外泄，严重影响后续附加值物质的提取工艺；电场介导的藻体絮凝由于无需在培养液中添加化学絮凝剂，受到药用及食用级藻体采收的青睐，但采收过程中由于电势差等因素的维持会显著增加培养过程的总能耗。

2)絮凝气浮法：该方法通过首先使水体中空气呈饱和状态，然后压力骤降促使其析出，形成上浮的微小气泡，从而带动微藻团浮于水面。与絮凝沉降法相比，该方法能在较短时间内进行藻体采收，但收率受气泡大小、气液混合效率、藻体团等影响较大，在除蓝藻等水体净化领域有所应用，大规模操作中对工程设备要求较高。

3)过滤法：该方法在个体较大如呈丝状藻体的螺旋藻的采收中应用广泛，通过加压操作有利于提高采收效率；对于细胞直径相对较小的栅藻、小球藻等，则通过选择合适的滤膜进行微滤和超滤，加压或抽真空过程中藻体易堵塞膜孔降低通量。

4)离心法：该方法是一种快速的细胞采收方法，其采收效率决定于离心力大小、藻细胞沉降特性、藻液在离心机内停留时间及沉降距离等因素，离心后藻细胞往往能保持相对较高的细胞活性。规模培养的单细胞藻类，由于其沉降性能低，离心收集时所需要的离心力往往较大，离心时间长，采收过程能耗较高。

综合以上藻液浓缩及藻体采收方法，实际应用中往往针对不同藻种特性和用途选择适宜的采收方法，如用于食药用途的微藻适于过滤、离心等机械采收方法，而化学絮凝法则往往用于水体处理过程中藻体去除或非食药用途藻体采收。总体来看，无论哪种收集方法，藻体采收效率都与藻体大小、细胞沉降特性、细胞表面电荷分布等属性密切相关，因此，如何优化以上因素，便直接影响着藻体采收过程中的能量及成本投入，进而对微藻规模化应用产生重要影响。

针对上述影响藻体采收效率因素的优化问题，近些年生态学相关研究发现许多浮游藻类具有表型可塑性特征，即在受到来自牧食者释放的化学物质刺激下，可发生单细胞到多细胞群体的表型转变。相比单细胞形态，多细胞群体的形成可增加浮游藻类的藻体大小，增加藻细胞沉降速率，在一定程度上有利于提高通过沉降、离心或过滤方法对藻体的整体采收效率。但目前该类方法在微藻规模化培养中并未得到有效应用。其重要的限制因素便是基于生态学研究的藻类表型转变诱导方法存在转变效率低、群体形态维持时间短等缺点，远远达不到微藻工业化培养中藻体规模化采收的需求。若能有效改进上述生态学方法诱导微藻表型转变的不足，则有望加快该生物学方法的规模化应用，对提高微藻培养行业的规模化采收具有重要应用价值。

发明内容

本发明目的在于提供一种提高规模化培养斜生栅藻的采收效率的方法。

为实现上述目的，本发明从牧食者释放化学物质和藻类培养温度两方面对该生物学方法进行优化，大大提高了藻类由单细胞转变为群体的比例，有效延长群体维持时间，增大藻体体积，提高藻体整体沉降性能，进而方便于过滤、离心等技术进行规模化培养栅藻的采收，降低成本投入。

本发明的技术方案为：基于生物学原理，利用牧食者释放化学物质诱导斜生栅藻表型转变。在斜生栅藻培养液中添加优化培养后的大型溞代谢物，同时在15℃-20℃温度范围内培养。

本发明所提供的方法中牧食者为枝角类中的成年大型溞，其诱导栅藻表型转变的代谢物来源于在优化培养基中对藻类的有效摄食活动，为保证高效摄食，大型溞应提前饥饿24h；

为延长栅藻群体维持时间，本发明中大型溞的优化培养基为添加矿物质元素后的不含N、P的BG11培养基，添加的矿物质元素及含量分别为SrCl·6H₂O(0.527mg/L)、NiCl₂(0.007mg/L)和Se(0.001mg/L)。

本发明中制备优化的大型溞代谢物时成年大型溞的培养密度为400ind/L，控制有效摄食活动时间为24h。

有效摄食活动之后大型溞培养液分别经60μm孔径筛娟和0.10μm玻璃纤维滤膜过滤去除藻类、细菌等，得到本发明中优化的大型溞代谢物。

本发明中斜生栅藻培养液中一次性添加优化的大型溞代谢物的体积百分比为5％，添加一次，添加后应充分搅拌或通气，保证大型溞代谢物在藻液中的均匀性。

在上述延长栅藻群体维持时间的基础上，为达到最佳沉降性能，应依据生产中栅藻培养方式将藻液培养温度尽快控制在15℃-20℃范围内，其最佳培养温度为15℃。

栅藻培养液中添加枝角类代谢物并降低培养温度后，5-6天后栅藻群体体积达到最大值，此时沉降性能最好，为最佳采收时间。

制备的大型溞代谢物可冷冻保存1-2个月。

本发明技术优点：

本发明针对斜生栅藻规模化培养过程中藻细胞体积小、沉降性能差，从而导致采收效率低、能耗大的问题，以浮游藻类表型可塑性，即藻类在受到来自牧食者释放的化学物质刺激下，可发生单细胞到多细胞群体的表型转变为理论基础。针对生态学研究中藻类表型转变效率低、群体维持时间短等缺点，本发明首先从牧食者培养及代谢物添加两方面进行优化，有效延长微藻群体维持时间；在此基础上通过降低藻类培养温度进一步增加多细胞群体比例，提高藻体整体沉降性能，因此，本发明在延长藻体群体维持时间，方便于该方法在规模化采收中应用的同时，进一步扩大了群体比例，增强藻体整体沉降性能，从而降低规模化培养过程中的下游能耗；优化的大型溞代谢物及低温培养范围对斜生栅藻藻体生长无抑制损伤，对收获藻体的后续加工利用无影响；另外，大型溞代谢物无任何环境毒性，在水体中可快速降解，不影响培养水体的再循环利用。

附图说明

图1是优化大型溞培养方式及其代谢物添加比例后斜生栅藻不同形态群体比例随时间变化趋势图。

图2是优化大型溞培养方式及其代谢物添加比例后斜生栅藻每群体细胞数随时间变化趋势图。

图3是不同培养温度下对照组和处理组中斜生栅藻不同形态群体比例随时间变化趋势图。

图4是不同培养温度下对照组和处理组中斜生栅藻每群体细胞数随时间变化趋势图。

图5是处理组中斜生栅藻最大每群体细胞数随温度变化趋势图。

具体实施方式

实施例1大型溞培养及代谢物添加优化后斜生栅藻表型转变

本实施例采用斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)，编号为FACHB-416，由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供，采用BG-11培养基(常规配方)于恒温光照培养箱内培养。

牧食者代谢物诱导栅藻表型转变：以枝角类中大型溞(Daphnia magna)作为藻类牧食者，分两组进行实验：

实验组A，按生态学研究中常用诱导方式：选取状态良好的大型溞用不含N、P的BG-11培养基培养，其初始密度300ind/L，培养温度25℃，光照强度50μmol photons m^-2s^-1，光照周期Light:Dark＝14h:10h，投喂2×10⁶cells>-1密度的斜生栅藻培养24h；之后将上述大型溞培养液以0.1μm微孔滤膜进行抽滤得到大型溞滤液；另外，采用相同过滤方法过滤BG-11培养基作为对照添加液。调整大型溞滤液和对照滤液中N、P含量至相同水平。分别将大型溞滤液和对照滤液以2％体积比添加至对数生长期斜生栅藻培养体系内，观察斜生栅藻的群体形成变化-及群体维持时间。

实验组B，本发明中优化大型溞培养及其代谢物添加：选取状态良好的成年大型溞，首先饥饿24h，一方面去除其可能的排泄物质带来的外源营养盐，另一方面使大型溞充分饥饿以保证后期的高效摄食；饥饿后的大型溞用添加矿物质元素且不含N、P的BG-11培养基(具体配方见表1)培养24h，其初始密度400ind/L，其他培养条件同实验组A。将大型溞液首先采用60μm筛娟过滤，之后用0.1μm玻璃纤维微孔滤膜进行抽滤，得到本发明中大型溞代谢物，所述大型溞代谢物制备完成后可冷冻保存1‐2个月；另外，采用相同过滤方法过滤BG-11培养基作为对照添加液；调整大型溞代谢物和对照添加液中N、P含量至相同水平。分别将大型溞代谢物和对照添加液以5％体积比添加至对数生长期斜生栅藻培养体系内，观察斜生栅藻的群体形成变化及群体维持时间。

表1

以上实验容器均为100mL锥形瓶，每组3个平行。实验光照强度50μmol photons m^-2s^-1，光暗周期Light:Dark＝14h:10h，每天摇瓶3-4次，25℃下共培养9天。

如图1-2所示，结果表明：

1.如图1所示，对照滤液添加组中，培养期间斜生栅藻种群以单细胞形态为主；不论以A或者B方式培养大型溞并添加其代谢物后，均观察到微藻种群中有群体形成，A方式中第三天微藻种群中八细胞群体比例达60％，但第五天其比例明显降低至28％；B方式中第三天八细胞群体比例达71％，且后续五天内其比例均维持在58％以上(图1)；

2.以每群体细胞数表示藻体整体群体形成强度，发现A处理方式中，栅藻平均每群体细胞数在第三天达到最大值3.4，第五天开始每群体细胞数明显减小至2左右，群体维持时间较短(1-2天)；B处理方式中，栅藻平均每群体细胞数在第三天达到最大值5.7，且在随后的5-6天内均维持在5以上，即相比A处理方式，B方法不仅明显提高了每群体细胞数，更延长了群体维持时间，由于微藻大规模采收往往持续3-4天，群体维持时间长是该方法得以在生产中应用的重要前提。

实施例2不同温度培养下添加5％优化的大型溞代谢物后栅藻表型转变

本实施例采用斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)，编号为FACHB-416，由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供，采用BG-11培养基(常规配方)于恒温光照培养箱内培养。

参考技术方案及实施例1中本发明方法优化培养大型溞并制备其代谢物。另外，采用相同过滤方法过滤常规BG-11培养基作为对照添加液。

取一定体积的对数生长期斜生栅藻添加至150mL锥形瓶内，并分别添加大型溞代谢物(处理组)或对照添加液(对照组)，使其体积百分比达到5％。每组3个平行。将上述对照组和处理组分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养，光照强度50μmol photonsm^-2s^-1，光暗周期Light:Dark＝14h:10h，每天摇瓶3-4次，共培养7天，观察斜生栅藻的群体形成变化。

如图3-5所示，结果表明：

1.相比对照组，添加大型溞代谢物后处理组斜生栅藻种群中单细胞比例明显下降，有大量四细胞、八细胞群体出现(图3)，其每群体细胞数显著高于对照组(图4)；但随栅藻培养温度的差异，其多细胞群体比例有所不同：

(1)15℃下，处理组培养三天后栅藻种群中四细胞和八细胞群体比例分别维持在13％和62％以上；培养期间最高比例可分别达到32％和84％；

(2)20℃下，处理组培养两天后栅藻种群中四细胞和八细胞群体比例分别维持在13％和61％以上；培养期间最高比例可分别达到36％和82％；

(3)25℃下，处理组培养两天后栅藻种群中四细胞和八细胞群体比例分别维持在19％和58％以上；培养期间最高比例可分别达到38％和76％；

(4)30℃下，处理组培养两天后栅藻种群中四细胞和八细胞群体比例分别维持在31％和44％以上；培养期间最高比例可分别达到62％和61％；

(5)35℃下，处理组培养两天后栅藻种群中四细胞和八细胞群体比例分别维持在20％和22％以上；培养期间最高比例可分别达到61％和71％；

2.添加优化的大型溞代谢物后栅藻种群均发生由单细胞到群体的表型转变，以最大每群体细胞数表示微藻整体的群体形成强度(图5)，发现在15℃-20℃温度范围内，处理组最大每群体细胞数已趋于稳定，且无显著差异，但明显高于25℃-35℃培养下的数值，表明相比高温条件培养，15℃-20℃的低温培养有利于增强栅藻整体的群体形成强度；进一步的，虽然15℃-20℃范围内微藻整体群体强度相似，但15℃下体积更大的、具有更好沉降性能的八细胞群体比例要高于20℃下比例，意味着15℃下藻体可达到最大沉降速率，即是添加优化的大型溞代谢物诱导表型转变后的最佳栅藻培养温度。