法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-02-28
授权
授权
2016-11-16
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/02 申请日:20150113
实质审查的生效
2016-10-12
公开
公开
本申请要求2014年1月21日提交的美国临时申请顺序号61/929,570的优先权。前述申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请大体涉及用于检测和治疗的方法，特别是，涉及用于靶向存在于体液分泌的外来体中的生物标记物的检测和治疗感染和传染病状况的方法。
背景技术
外来体是直径40-100nm的小囊泡体，其由多种不同的细胞型分泌，通过它们所携带的蛋白质和核糖核酸与其他细胞联系。当细胞膜片段自发地内陷并被吞噬时，在细胞内产生外来体。内部化的片段断裂成小囊泡体，其随后从细胞排出。在包含很多小囊泡体的次级内体与细胞膜融合，引发囊泡体从细胞释放时，后一阶段发生。囊泡体(一旦释放即称为外来体)由脂筏构成，脂筏嵌有与原始细胞膜共有的配体。
取决于其细胞起源，外来体携带蛋白质和/或核酸(如微小RNA(miRNAs))的与众不同的图谱，其能够通过与细胞质膜外来体融合引发在其他细胞中的信号通路和/或转移外来体产物进入其他细胞。外来体的蛋白组成与其他细胞器(包括初级内体和质膜)的组成不同，与次级内体或多泡体(MVBs)的组成更接近类似。
外来体在不同的生理环境中由不同的细胞型释放。例如，B淋巴细胞释放携带II类主要组织相容性复合体分子的外来体，其发挥着抗原提呈的作用。类似地，树突状细胞产生外来体(即，外来体(dexosomes)，Dex)，其在免疫应答介导中发挥作用，特别是在细胞毒T淋巴细胞刺激中发挥作用。一些肿瘤细胞以调控的方式分泌携带肿瘤抗原的特殊外来体(即，外来体(texosomes),Tex)，其可以将这些抗原呈递给抗原提呈细胞。外来体也可以携带病原相关产物。例如，已知外来体携带源自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)感染的细胞的产物。
经常使用血清或血浆测定肝炎病毒感染。特定的病毒抗体的检测是对应病毒感染的假定的证据，并且典型地通过蛋白印迹法来确认。在尿液中的肝炎蛋白的检测可以提供检测肝炎感染和/或监测疾病的进展，特别是与病毒相关的肾脏并发症的更快速的方法。
肝炎是肝脏的炎症，大多数通常由病毒感染引起。有五种主要的肝炎病毒，称为A、B、C、D和E型。甲型肝炎和戊型肝炎是典型地由摄入污染的食物或水引起。乙型肝炎、丙型肝炎和丁型肝炎经常由于不经肠道接触感染的体液(例如，来自使用污染的器械输血或介入性医疗操作)而发生。乙型肝炎也通过性接触传播。
甲型肝炎病毒(HAV)是肠道传播的病毒疾病，其引起发热、萎靡不振、厌食、恶心、腹部不适以及黄疸。HAV通常通过粪-口途径、通过人-人接触、摄入污染的食物或水或通过合并血浆产品的传染获得。缺乏脂质包膜使得HAV非常耐受物化失活，并且该病毒可以耐受血液制品的常规的热处理。开发在受感染个体中识别HAV抗原和/或抗体的灵敏和特异的检测测定法以及检测病毒血样本以使排除它们输血的基于核酸的测试代表了对于公众健康重要的考验。
乙型肝炎病毒(HBV)感染人类并且可能产生两种临床结果。在成年人大多数的临床感染中(90-95％)，病毒在几周或几个月之后被清除，并且患者发展了抵抗再感染的终身免疫。然而，在剩下的病例中，病毒并没有从组织消除，而患者仍慢性感染。慢性感染的后遗症很严重：这些个体极大可能发展成肝组织的瘢痕(肝硬化)并且可能最终发展成肝细胞癌。HBA在运输、性行为或共用被感染的血液污染的针头的过程中经由感染的血液或其他体液(特别是唾液和精液)传播。
在世界范围内，据估计有40,000万人慢性感染乙型肝炎病毒(HBV)。慢性乙型肝炎(CHB)感染是肝硬化和肝细胞癌(HCC)最常见的起因，估计每年有500,000-900,000人死亡。连续的HBV复制提高了肝硬化和HCC进展的风险。
丙型肝炎病毒(HCV)是原始确定为非甲型肝炎、非乙型肝炎的大的慢性肝脏感染的病原体。HCV已在美国感染大约四百万人，在世界范围内感染17,000万人，并且占到归因于输血的肝炎的90％至95％。推测感染的主要途径是通过与污染的体液，特别是来自受感染个体的血液接触。HCV感染是美国和其他国家肝脏移植的主要原因之一。在美国大约40％-50％的肝脏移植基于HCV感染。这种疾病频繁发展成慢性肝脏损害。虽然HCV的病理学主要影响肝脏，但在体内的其他细胞型(包括外周血液淋巴细胞)中发现该病毒。
δ肝炎病毒(HDV)是一种依赖于乙型肝炎表面抗原以组装其包膜并且形成新的病毒体以传播感染的卫星RNA病毒。HDV具有小的1.7Kb的基因组，使其成为已知的最小的人类病毒。然而，HDV是病毒性肝炎的最严重的形式。与病毒性肝炎的其他传染原相比，急性HDV感染更经常与爆发性肝炎相关，其是一种快速进展的、大量的肝脏被破坏的经常是致命形式的疾病。慢性丁型肝炎的特征典型地为坏死炎性损伤，与慢性HBV感染类似，但是更严重，并且经常快速进展为肝硬化和肝功能衰竭，这解释了慢性HDV感染与晚期肝疾病不相称的关联。虽然HDV感染与单纯HBV相比影响更少的个体，但是产生的急性或慢性肝功能衰竭在欧洲以及北美是肝移植常见的指征。慢性HDV疾病在世界范围内影响1,500万人，其中大约70,000在美国。疾病控制中心(Centers for Disease Control)估计在美国每年有1,000人死于HDV感染。
鉴于大范围的个体受到传染原(包括各种肝炎病毒分离物)的影响，以及缺乏可靠、快速和廉价以及更少介入性检测试验品，需要检测传染原以及传染病状况的可靠、快速、廉价和更少介入的试验品。
发明内容
本申请的一个方面涉及一种检测受试者感染或传染病状况的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从来自受试者的体液样本制备外来体制备品；(b)使所述外来体制备品与一种或多种与传染原相关的生物标记物结合剂和/或适合检测至少一种与传染原相关的生物标记物的一种或多种检测试剂接触；以及(c)测定所述外来体制备品是否包含用所述一种或多种生物标记物结合剂和/或所述一种或多种检测试剂可检测的与传染原相关的生物标记物，其中在步骤(c)中测定所述与传染原相关的生物标记物存在标志在所述受试者中的感染或传染病状况，并且其中在步骤(c)中测定所述至少一种与传染原相关的生物标记物不存在标志在所述受试者中不存在感染或传染病状况。
在一个实施方式中，用于检测受试者的肝炎感染或肝炎相关疾病状况的方法包括以下步骤：(a)从来自受试者的体液样本制备外来体制备品；(b)使所述外来体制备品与至少一种肝炎病毒生物标记物结合剂接触，所述至少一种肝炎病毒生物标记物结合剂对于选自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)的肝炎病毒是选择性的；以及(c)测定所述外来体制备品是否包含至少一种肝炎病毒生物标记物，其中在步骤(c)中测定所述至少一种肝炎病毒生物标记物存在标志在所述受试者中的肝炎感染或肝炎疾病状况，并且其中在步骤(c)中测定所述至少一种肝炎病毒生物标记物不存在标志在所述受试者中不存在肝炎感染或肝炎疾病状况。
在一些实施方式中，步骤(b)进一步包括使多个外来体制备品中的每个与一种或多种不同的与传染原相关的生物标记物结合剂接触。在某些特定的实施方式中，多个外来体制备品中的每个与一种或多种不同的肝炎病毒生物标记物结合剂接触。
在一些实施方式中，所述一种或多种不同的与传染原相关的生物标记物结合剂中的每种对于常见的传染原是选择性的。在其他实施方式中，所述一种或多种不同的与传染原相关的生物标记物结合剂中的每种对于不同的传染原是选择性的。在某些特定的实施方式中，每种肝炎病毒生物标记物结合剂对于常见的肝炎病毒是选择性的。在其他实施方式中，每种肝炎病毒生物标记物结合剂对于不同的肝炎病毒是选择性的。
在一些实施方式中，在步骤(b)中的所述检测试剂选自用于RNA反转录的一种或多种试剂、用于基因组核酸或mRNA扩增和检测的一种或多种PCR试剂以及用于检测miRNA的一种或多种寡核苷酸。
在某些实施方式中，步骤(b)包括使所述外来体制备品与一种或多种与传染原相关的生物标记物结合剂以及适合检测至少一种与传染原相关的生物标记物的一种或多种检测试剂接触。在某些特定的实施方式中，步骤(b)进一步包括使一个或多个外来体制备品与能够检测用于肝脏损害的标记物的一种或多种试剂和/或能够检测用于肝细胞癌的标记物的一种或多种试剂接触。
在优选的实施方式中，所述体液是尿液。
在一些实施方式中，在步骤(a)中的所述外来体制备品包含整个外来体。在其他实施方式中，所述外来体制备品包含外来体溶解产物。
可以通过差速离心、纳米膜超滤、免疫吸收剂捕获、夹心ELISA、尺寸排阻层析、超速离心、磁激活细胞分选(MACS)或它们的组合来制备所述外来体制备品。
在一些实施方式中，所述传染原是病毒。
在其他实施方式中，所述传染原是细菌。
在其他实施方式中，所述传染原是原生动物或真菌。
在另一个实施方式中，所述传染原是朊蛋白的抗蛋白酶形式，PrPSC。
在优选的实施方式中，所述传染原是选自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)的肝炎病毒。
在某些实施方式中，检测步骤可以进一步联合施用用于所述感染的治疗药物的步骤。可以使用用于给定感染的任何常规的治疗药物(例如，抗生素等)。在其他实施方式中，检测步骤可以进一步联合对认为受到所述感染影响的组织进行活体检查的步骤。
本申请的另一个方面涉及一种用于监测受试者中感染或传染病状况的进程的方法。所述方法包括以下步骤：(a)测定在来自受试者的代表第一时间点的第一外来体制备品中的一种或多种生物标记物的水平；(b)测定在来自所述受试者的代表第二时间点的第二外来体制备品中的所述一种或多种生物标记物的水平；(c)比较在所述第一外来体制备品中的所述一种或多种生物标记物的水平和在所述第二外来体制备品中的所述一种或多种生物标记物的水平；以及(d)基于步骤(c)的结果确定在所述第一时间点和所述第二时间点之间疾病的进展或消退。在某些优选的实施方式中，所述传染病或传染病状况由选自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的肝炎病毒引起。
本申请的另一个方面涉及一种用于监测带有传染病或传染病状况的受试者治疗的有效性的方法。所述方法包括以下步骤：(a)测定在来自施用药剂之前的受试者的第一外来体制备品中的与传染原相关的生物标记物图谱；(b)测定在来自施用所述药剂之后的受试者的第二外来体制备品中的与传染原相关的生物标记物图谱；(c)比较在所述第一外来体制备品中的与传染原相关的生物标记物图谱和在所述第二外来体制备品中的所述与传染原相关的生物标记物图谱；以及(d)基于步骤(c)中生物标记物图谱的比较分析确定所述药剂的有效性。在某些优选的实施方式中，所述与传染原相关的生物标记物图谱与选自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的肝炎病毒相关。
本申请的另一个方面涉及一种用于检测受试者的传染病或传染病状况的试剂盒。所述试剂盒包括：用于制备外来体制备品的一种或多种试剂以及对于一种或多种传染病或传染病状况有选择性的一种或多种与传染原相关的生物标记物结合剂。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含一种或多种与传染原相关的生物标记物标准，以及用于检测所述一种或多种生物标记物结合剂与一种或多种与传染原相关的生物标记物的结合的一种或多种检测试剂。
在一个实施方式中，用于检测受试者中感染或与传染原相关的疾病状况的所述试剂盒包含用于制备外来体制备品的一种或多种试剂、以及对于选自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)的肝炎病毒有选择性的一种或多种肝炎病毒生物标记物结合剂。在相关的实施方式中，所述试剂盒进一步包括一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物标准，以及一种或多种用于检测所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂与一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物的结合的检测试剂。
附图说明
图1是基于外来体ELISA用于乙型肝炎检测的受者作用特征(ROC)曲线。
图2是基于外来体ELISA用于丙型肝炎检测的ROC曲线。
具体实施方式
除非另外指明，在下文中进一步详细描述的实施方式的实践将采用诊断学、分子生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学在本领的技术人员中的常规方法。在文献中完整描述这些技术。所有在此引用的出版物、专利和专利申请，不管上文或下文，通过引用方式全部以此并入。
将理解为，为了清楚而在不同的实施方式的上下文中描述的本申请的某些特征，还可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁而在单个实施方式的上下文中描述的本申请的各种的特征，也可以分别提供和/或以任意合适的亚组合提供。
定义
如本文中所使用的，参照能够用作生物体的急性传染病或慢性传染病状况的指示的任何分子实体，术语“生物标记物”和“与传染原相关的生物标记物”互换地使用。生物标记物可以是在感染之后和/或与传染病状况同时发生的体液中存在的外来体中存在的和/或差异表达的任何可检测的蛋白质、核酸(例如mRNA或微小RNA)、脂质、或任何产物，这些蛋白质、核酸(例如mRNA或微小RNA)、脂质、或任何产物的存在和/或浓度反映受试者中急性或慢性感染的存在、严重程度、类型或进展。在分子术语中，可以使用基因组学、蛋白质组学技术或成像技术在受试者中检测和定量生物标记物。
与传染原相关的生物标记物可以是自然界中的病毒、细菌、真菌、原生动物(即，由病毒、细菌、真菌、原生动物等编码)或其可以是自然界中的细胞(cellular)。因此，与传染原相关的生物标记物可以直接源自该传染原，使得该传染原编码该生物标记物。如本文中所使用的，术语“病毒生物标记物”是指直接源自病毒或由病毒编码的生物标记物。术语“与传染原相关的细胞生物标记物”和“与病毒相关的细胞生物标记物”是指细胞生物标记物，其表达响应于传染原(如病毒)或传染病状况而改变并且其与未感染的细胞相关的差异表达可以诊断由那种特定的传染原引起的感染或疾病。
如本文中所使用的，术语“基因产物”或“基因的表达产物”是指基因的转录产物，如由基因编码的mRNA和cDNA，和/或基因的翻译产物，如由基因编码的肽，及其片段。
如本文中所使用的，术语“传染病状况”是指与传染病有关的、由传染病引起的疾病。例如，肝硬化和肝细胞癌(HCC)是由病毒性肝炎引起的传染病状况。
范围在本文中表示为从“大约”一个特定值，和/或至“大约”另一个特定值。当这样表示范围时，另一个实施方式包括从所述一个特定值和/或至所述另一个特定值。类似地，当值通过使用在先的“大约”表示为近似值时，将理解为该特定值形成另一个实施方式。将进一步理解为每个范围的端点既与另一个端点相关，又独立于所述另一个端点。还理解为本文公开的许多值，而每个值除了该值本身以外还在此公开为“大约”那个特定值。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“大约10”。如技术人员适当地理解，还理解为当一个值被公开了，那么也公开了“小于或等于”那个值，“大于或等于该值”以及在这些值之间的可能的范围。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。
本申请的一个方面涉及一种用于检测受试者中感染或与传染病相关的状况的方法。所述感染可以是急性的或慢性的。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：(a)从所述受试者的体液样本分离外来体；(b)从所分离的外来体检测一种或多种与传染原相关的生物标记物的存在；以及(c)测定所分离的外来体是否表现急性或慢性感染特定传染原的个体的生物标记物图谱特征。
可以使用适合识别与传染原相关的生物标记物的任何方法进行所述检测步骤，包括但不限于一维和二维电泳凝胶分析、电泳、蛋白质印迹、HPLC、FPLC、ELISA、质谱(MS)、蛋白质测序、核苷酸测序、PCR、抗体阵列以及它们的组合。
所述测定步骤可以基于识别在从体液样本获得的分离的外来体中一种或多种与传染原相关的生物标记物的存在、不存在和/或改变的表达图谱。可以通过比较在体液样本(如尿液)中的与传染原相关的生物标记物图谱和在数据库中储存的与传染原相关的生物标记物图谱来完成所述测定步骤。测定可以基于该比较的结果。
如本文中所使用的，术语“体液样本”是指从哺乳动物受试者，优选人类受试者中获得的体液的样本。示例性的体液样本包括，但不限于，尿液、血液、血清、血浆、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰以及它们的组合。在优选的实施方式中，所述体液样本为尿液。除非另外指明，如本文中所使用的，术语“体液样本”和“样本”被认为与任一个以上所述的体液样本中同义。
生物标记物图谱可以由一种或多种生物标记物构成，所述一种或多种生物标记物直接源于传染原和/或其表达图谱对于急性或慢性感染特定传染原的个体是特征性的一种或多种细胞产物。因此，测定所述受试者是否携带传染原的步骤可以基于检测存在于所述分离的外来体中的一种或多种与传染原相关的生物标记物的存在、不存在或差异表达。如本文中所使用的，术语“差异表达”是指与对照样本相关的生物标记物表达水平的定性和/或定量变化。
术语“提高的水平”是指比习惯上定义或在相关的领域中使用的正常水平或对照水平高的表达水平。例如，来自体液样本的外来体制备品的提高的免疫染色的水平是本领域普通技术人员认为比对照外来体制备品的免疫染色的水平高的免疫染色的水平。如本文中所使用的，所述生物标记物可以表现出相对于适合的参考水平提高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍或更多的提高的表达水平。
术语“降低的水平”是指比习惯上定义或在相关的领域中使用的正常水平或对照水平低的表达水平。如本文中所使用的，所述生物标记物可以表现出相对于适合的参考水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍或更多的降低的表达水平。
术语“与传染原相关的生物标记物的表达水平”可以在转录水平测量，在这种情况下测定多核苷酸的存在和/或量，或者在翻译水平测量，在这种情况下测定多肽的存在和/或量。
可以使用任何合适的方法表征与传染原相关的生物标记物的表达水平。在mRNA水平(例如，通过RT-PCT、QT-PCT、寡核苷酸阵列等等)或在蛋白质水平(例如，通过ELISA、蛋白质印迹、抗体微阵列等等)测定表达水平和表达率。优选的用于测定mRNA或miRNA表达水平的方法包括定量反转录酶PCT(QT-PCR)、定量实时RT-PCT、寡核苷酸微阵列、抗体微阵列、或它们的组合。优选的用于测定蛋白质表达水平的方法包括使用ELISA和抗体微阵列。
在某些实施方式中，与传染原相关的生物标记物图谱可以包含从零至多个与传染原相关的生物标记物。因此，通过举例方式，健康受试者的与传染原相关的图谱可以不包含与传染原相关的生物标记物，而带有传染病的患者的与传染原相关的图谱可以包含多个与传染原相关的生物标记物。在这个方法中，还可以在测定步骤中使用来自受试者的病历卡的遗传背景和相应信息来进行检测。
在另一个方面，所述方法用于基于在从体液样本获得的分离的外来体中的一种或多种与传染原相关的生物标记物的存在、不存在和/或改变的表达图谱来监测受试者的传染病或传染病相关的状况的进展。
在相关的方面，所述方法用于监测受试者的传染病或传染病相关的状况的进程，其包括以下步骤：(a)测量在第一时间点从所述受试者获得的第一样本的外来体中的一种或多种生物标记物的水平；(b)测量在第二时间点从所述受试者获得的第二样本的外来体中的所述一种或多种生物标记物的水平；(c)比较在所述第一时间点的所述一种或多种生物标记物的水平和在所述第二时间点的所述一种或多种生物标记物的水平；以及(d)基于步骤(c)的结果确定在所述第一时间点和第二时间点之间的疾病的进展或消退。
本申请的另一个方面涉及一种用于监测治疗剂在受试者中的有效性的方法，其作为在从体液样本获得的外来体中存在的与传染原相关的生物标记物水平的函数。所述方法包括以下步骤：(a)测定在从施用所述治疗剂之前的受试者获得的样本的外来体中的与传染原相关的生物标记物图谱；(b)测定在从施用所述治疗剂之后的受试者获得的一个或多个样本的外来体中的与传染原相关的生物标记物图谱；(c)比较在施用前样本中的与传染原相关的生物标记物图谱和在施用后样本中的与传染原相关的生物标记物图谱；以及(d)基于步骤(c)中生物标记物图谱的比较分析确定所述治疗剂的有效性。
在某些实施方式中，所述方法可以进一步包括向所述受试者改变药剂的施用的步骤。根据该方法，即使不存在能观察到的表型应答，也可以使用所述与传染原相关的生物标记物图谱作为药剂的有效性的指示。
用于根据本文所述的方法的示例性哺乳动物受试者包括人、猴、猩猩、狒狒和家畜，例如牛、猪、马、兔、狗、猫、羊等等。
传染原和疾病
所述传染原可以是自然界中病毒、细菌或真菌。在一个实施方式中，所述传染原是选自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)中的肝炎病毒。
除了肝炎病毒以外，其他病毒包括，但不限于，人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)I型和II型(HTLV-I和HTLV-II)，细小病毒B19病毒，输血传播病毒(TTV)；麻疹病毒；轮状病毒，包括A，B，C，D和E型；疱疹病毒，包括EB病毒、人巨细胞病毒1型病毒(HCMV-1)、单纯疱疹病毒(HSV)1型和2型(HSV-1和HSV-2)、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、人疱疹病毒8型(HHV-8)；人类乳头状瘤病毒(HPV)和它的许多血清型；甲型流感病毒，包括H1N1和H5N1亚型；严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒；和其他杂类RNA病毒，包括沙粒病毒(例如，拉沙热病毒(LFV))、丝状病毒科(例如，埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MBGV))；布尼亚病毒科(例如，裂谷热病毒(RVFV)和克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)；和黄病毒科，包括西尼罗河病毒(WNV)、登革热病毒(DENV)、黄热病病毒(YFV)和GB病毒C(GBV-C)，原名庚型肝炎病毒(HGV)。
示例性的细菌包括，但不限于分枝杆菌属(Mycobacterium species)，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)；葡萄球菌属(Staphylococcus species)，包括表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus)；链球菌属(Streptococcusspecies)，包括肺炎链球菌(S.pneumoniae)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、变异链球菌(S.mutans)、无乳链球菌(S.agalactiae)、马链球菌(S.equi)、犬链球菌(S.canis)、牛链球菌(S.bovis)、马肠链球菌(S.equinus)、咽峡炎链球菌(S.anginosus)、血链球菌(S.sanguis)、唾液链球菌(S.salivarius)和缓症链球菌(S.mitis)；其它致病链球菌属(Streptococcal species)，包括肠球菌属(Enterococcus species)，如粪肠球菌(E.faecalis)和屎肠球菌(E.faecium)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，假单胞菌属(Pseudomonas species)，包括绿脓杆菌(P.aeruginosa)、类鼻疽假单胞菌(P.pseudomallei)和鼻疽假单胞菌(P.mallei)；沙门氏菌种(Salmonellaspecies)，包括小肠结肠炎沙门氏菌(S.enterocolitis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)，邦戈沙门氏菌(S.bongori)和猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)；志贺氏菌属(Shigella species)，包括福氏志贺氏菌(S.flexneri)、宋内志贺氏菌(S.sonnei)、痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)和鲍氏志贺氏菌(S.boydii)；布鲁氏菌属(Brucella species)，包括马尔他布鲁杆菌(B.melitensis)、猪布鲁氏菌(B.suis)、牛布鲁氏菌(B.abortus)和百日咳鲍特菌(B.pertussis)；奈瑟菌属(Neisseria species)，包括脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)和淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)；大肠杆菌(Escherichia coli)，包括肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)(ETEC)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，艰难梭菌(Clostridium difficile)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，莫拉菌属(Moraxella species)，包括卡他莫拉菌(M.catarrhalis)，弯曲杆菌属菌属(Campylobacter species)，包括空肠弯曲杆菌(C.jejuni)；棒状杆菌属(Corynebacterium species)，包括白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)、溃疡棒状杆菌(C.ulcerans)、C.pseudotuberculosis、假白喉棒状杆菌(C.pseudodiphtheriticum)、解脲棒状杆菌(C.urealyticum)、溶血性梭菌(C.hemolyticum)、马棒状杆菌(C.equi)等；李斯特菌(Listeria monocytogenes)，星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)，类杆菌属(Bacteroides species)，放线菌属(Actinomycetes species)，梅毒螺旋体(Treponema pallidum)，Leptospirosa菌属，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)；变形杆菌属(Proteus sp.)，包括普通变形杆菌(Proteusvulgaris)；沙雷菌属(Serratia species)，不动杆菌属(Acinetobacter)，耶尔森氏菌属(Yersinia species)，包括鼠疫菌(Y.pestis)和假结核菌(Y.pseudotuberculosis)；土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)，肠杆菌属(Enterobacter species)，类杆菌(Bacteriodes)菌属，军团菌属(Legionellaspecies)，伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)等。
示例性的真菌包括，但不限于，曲霉菌属(Aspergillus species)，皮肤癣菌(Dermatophytes)，Blastomyces derinatitidis，念珠菌属(Candida species)，包括白色念珠菌(C.albicans)和克柔氏念珠菌(C.krusei)；糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)，韦内斯基氏外瓶柄霉(Exophiala werneckii)，霍塔毛孢子菌(Piedraia hortai)，白吉利毛孢子菌(Trichosporon beigelii)，波氏假阿利什菌(Pseudallescheria boydii)，灰马杜拉分支菌(Madurella grisea)，组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)，申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)，组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)，癣菌属(Tinea species)，包括云芝癣(T.versicolor)、足癣(T.pedis)、甲癣(T.unguium)、T.cruris、T.capitus、T.corporis、T.barbae；毛癣菌属(Trichophyton species),包括红色毛癣菌(T.rubrum)、指间毛癣菌(T.interdigitale)、断发毛癣菌(T.tonsurans)、堇色毛癣菌(T.violaceum)、T.yaoundei、T.schoenleinii、T.megninii、T.soudanense、T.equinum、T.erinacei和疣状毛癣菌(T.verrucosum)；生殖器支原体(Mycoplasma genitalia)；小孢子菌属(Microsporum species)，包括M.audouini、M ferrugineum、犬小孢子菌(M.canis)、矮小孢子菌(M.nanum)、扭曲小孢子菌(M.distortum)、石膏样小孢子菌(M.gypseum)、叶霉小孢子菌(M.fulvum)等。
示例性的原生动物包括，但不限于恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、孢球虫(Isospora belli)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和环孢子虫(Cyclospora)属。
其他的传染原包括阮蛋白(PrP)的抗蛋白酶形式，称为羊瘙痒病相关的阮蛋白(PrPSc)，其与致命神经变性感染病理学分类相关，包括克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)，并且已知与外来体相关。
在某些实施方式中，所述传染病或传染病状况影响肾脏，例如肾盂肾炎。
在其他实施方式中，所述传染病或传染病状况影响肝脏，例如肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
生物标记物
所述与传染原相关的生物标记物可以是自然界中的病毒、细菌、真菌、原生动物(即，由病毒、细菌、真菌、原生动物等编码)。所述与传染原相关的生物标记物可以直接源自所述传染原。或者，所述与传染原相关的生物标记物可以是细胞生物标记物产物，其与未受感染细胞相关的差异表达诊断由那种特定传染原引起的感染或疾病。
在一些实施方式中，所述生物标记物是蛋白质。在其他实施方式中，所述生物标记物是核酸。示例性的核酸包括DNA或RNA的单链和双链多核苷酸或寡核苷酸。示例性的核酸包括病毒基因组DNA或RNA，包括其反转录的派生物。
在某些实施方式中，可以通过常规的RNA或DNA纯化方法运用例如用于从无细胞的体液中纯化病毒核酸的基于硅胶的核酸纯化柱(Qiagen)分离与包含在分离的外来体中的病毒颗粒(如丙型肝炎病毒(HCV))相关的病毒基因组核酸。
在其他实施方式中，所述生物标记物是病毒信使RNA(mRNA)、病毒微小RNA(miRNA)或病毒诱导的miRNA。已知mRNA和miRNA两者穿梭通过外来体。微小RNA是负责通过与信使RNA(mRNA)相互作用而转录后调控基因表达的小的非编码RNA。它们参与重要的生物过程并且经常在各种疾病(包括癌症和感染)中失调。病毒还编码他们自身的miRNA，这些miRNA可以通过阻断mRNA翻译和/或引发mRNA衰减而被载入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中用于使宿主基因和/或它们自身的基因沉默。在过去的一些年当中，积累了在胞外人体液(如血清、血浆、唾液和尿液)中细胞miRNA的存在，包括它们与外来体的共分馏物(cofractionation)(或共定位物(colocalization))。
示例性的肝炎相关miRNA包括miR-122和mrR-199。
优选的与传染原相关的生物标记物包括，但不限于与肝炎病毒(如，甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV))相关的生物标记物。如本文中所使用的，术语“与肝炎病毒相关的生物标记物”是指肝炎病毒蛋白质、核酸或其片段，以及细胞生物标记物产物，它们的与未受感染细胞相关的差异表达诊断肝炎感染。
与肝炎病毒相关的生物标记物
在其他实施方式中，所述生物标记物包括与甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和/或戊型肝炎病毒(HEV)相关的一种或多种肝炎病毒生物标记物。
甲型肝炎病毒(HAV)是小的、未包膜的、球状病毒，归属细小RNA病毒科的嗜肝病毒属。HAV基因组由编码多蛋白前体(其被加工以产生病毒复制所需的结构蛋白和酶活)的单链、线性、7.5kb RNA分子构成。HAV编码四种衣壳蛋白(A、B、C和D)，它们包含由受感染个体的抗体识别的主抗原结构域。除了衣壳蛋白以外，已报道抗原结构域在非结构蛋白(如2A)和病毒编码的蛋白酶中。已记载另一种重要的HAV抗原结构域在衣壳前体P1和2A之间的联结点中。在一些实施方式中，使用HAV多蛋白VP0、VP1和VP3(分别称为1AB、1D和1C)作为HAV生物标记物。
乙型肝炎病毒是包膜的非细胞病的双链环形DNA病毒。它是嗜肝病毒科的成员。该病毒由中心核构成，直径42nm，该中心核包含由包含表面蛋白/表面抗原(HBsAg)的包膜包围的核心抗原(HBcAg)。其还包含e抗原(HBeAg)，其与HBcAg和HBsAg一起对于识别这种疾病是有益的。在HBV病毒体中，发现其基因组呈不完全的双链形式。一旦被HBV感染，这种不完全的部分双链DNA被修复形成3.2-kb cccDNA，其用作模板以转录重叠的RNA类型，这些类型包括编码反转录酶(聚合酶)、核、PreS、S和X蛋白的3.5-kb前基因组RNA。这些RNA然后被翻译为HBV蛋白质或反转录成HBV DNA。所有这些HBV蛋白质在HBV转录调控、病毒包装、反转录和病毒DNA回收中起到重要的作用。
用于本申请的示例性的乙型肝炎病毒(HBV)生物标记物蛋白包括HBV核心抗原(HBcAg)、HBV表面抗原(HBsAg)、HBV e抗原(HBeAg)、HBV X蛋白(HBx)、HBV聚合酶和HBV包膜蛋白S、M和L。
HCV是黄病毒科肝炎病毒属的RNA病毒，并且大多数与瘟病毒、BVDV和GBV-B.密切相关。HCV基因组由单股正链RNA组成，长度大约为9.6kb。HCV基因组拥有连续的、翻译开放阅读框(ORF)，其编码大约3,000个氨基酸的多蛋白。这种结构蛋白表现为在ORF的N末端区域的大约第一个四分之一中编码，剩余部分编码非结构蛋白。这种多蛋白用作对于后代病毒颗粒的复制和组装关键的至少10个不同的病毒蛋白的前体。在HCV多蛋白中结构和非结构蛋白的构造如下：C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b。HCV生物标记物的实例包括，但不限于，HCV核心抗原(HCVcAg)、HCV C蛋白、HCV E1蛋白、HCVE2蛋白、HCV p7蛋白、HCV NS2蛋白、HCV NS3蛋白、HCV NS4a蛋白、HCV NS4b蛋白、HCV NS5a蛋白和HCV NS5b蛋白。
δ肝炎病毒(HDV)是一种依赖于乙型肝炎表面抗原以组装其包膜并且形成新病毒体以传播感染的的卫星RNA病毒。HDV具有小的1.7Kb的基因组，使其成为已知的最小的人类病毒。HDV病毒体由核蛋白核心和包膜构成。所述核心包含HDV-RNA，和δ肝炎抗原(HDAg)，该抗原是由这种病毒编码的唯一蛋白。所述包膜由辅助病毒乙型肝炎的表面抗原蛋白(乙型肝炎表面抗原或HBsAg)形成。所述包膜是由HBV提供的唯一的辅助功能体(helperfunction)。HDV能够在没有HBV的细胞内复制其RNA，但需要HBsAg以包装和释放HDV病毒体，以及需要HBsAg用于感染性。由于HDV对于HBV的依赖，HDV只感染与HBV相关的个体。
戊型肝炎病毒(HEV)是戊型肝炎的病原体，戊型肝炎是一种在世界的很多资源有限的区域的地方性的急性病毒性肝炎。据估计大约20亿人(约世界人口的三分之一)，生活在HEV病区并且面临被感染的风险。在这些地区，戊型肝炎是急性肝炎主要形式；例如在印度，大约50％的急性肝炎是由于HEV。
HEV是具有27–34nm大小的小的未包膜的病毒，并归属肝炎病毒科的戊型肝炎病毒。HEV基因组是～7.2kb的正义单链RNA，具有5′-甲基鸟嘌呤帽和3′poly(A)延伸，并且包含三个部分重叠的开放阅读框(ORF)-称为orf1、orf2和orf3。HEV orf1，一种1693个氨基酸的多蛋白，编码病毒非结构功能。在HEV非结构多蛋白中识别的功能结构域包括(从N末端开始)-甲基转移酶(MeT)、木瓜酶样半胱氨酸蛋白酶(PCP)、RNA螺旋酶(Hel)和RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)。HEV orf2编码660个氨基酸的病毒衣壳蛋白，其被认为用壳体包裹病毒RNA基因组。HEV orf3被认为表达对于体外复制非必须的一种114个氨基酸的蛋白质并被认为起到病毒辅助蛋白的作用，可能影响宿主对感染的响应。
示例性的肝炎病毒核酸序列包括，但不限于，在转录和翻译中涉及的核酸序列(例如，En1、En2、X、P)以及编码结构蛋白(例如，包括C和C相关蛋白的核心蛋白、衣壳以及包括S、M和/或L蛋白的包膜蛋白，或它们的片段)的核酸序列(例如，参见FIELDS VIROLOGY,2001,supra)。示例性的丙型肝炎核酸序列包括，但不限于，丝氨酸蛋白酶(如NS3/NS4)、螺旋酶(如NS3)、聚合酶(如NS5B)以及包膜蛋白(如E1、E2和p7)。甲型肝炎核酸序列如在Genbank Accession No.NC_001489中列出；乙型肝炎核酸序列如在Genbank Accession No.NC_003977中列出；丙型肝炎核酸序列如在Genbank Accession No.NC_004102中列出；丁型肝炎核酸序列如在Genbank Accession No.NC_001653中列出；戊型肝炎核酸序列如在GenbankAccession No.NC_001434中列出；并且庚型肝炎核酸序列如在GenbankAccession No.NC_001710中列出。通过PCR、RT-PCR等完成肝炎核酸的检测。
可以使用本文中所述的任意肝炎病毒蛋白或核酸作为根据本申请的生物标记物。在某些实施方式中，可以使用特别用于给定的肝炎基因型(如HAV、HBV、HCV、HDV、HEV)的肝炎病毒生物标记物的面板用于检测特定的肝炎病毒基因型。此外，可以使用特别用于特定的基因型的肝炎病毒生物标记物的面板以在基因型(如HCV(例如HCV 1a、1b、2a/c、2b、3、4、5和6a/b))内分类和亚分类。
细胞外来体生物标记物
外来体由于它们的细胞来源而承受内体途径的特异性蛋白标记物，如四跨膜区蛋白(tetraspanins)(CD63，CD9和CD81)，热休克蛋白(HSP70)和来自拉布家族(Rab family)的蛋白质(例如，Rab5)，Tsg101和阿利克斯(Alix)，这在其他类型的类似大小的囊泡中都没有发现。还已知外来体的组成反映了它们所衍生的特定的细胞类型。因此，使用细胞外来体标记物的外来体仿形可以在检测疾病的领域中提供与传染原生物标记物或者具有特定细胞类型的与传染原相关的细胞标记物的存在相关的信息。此外，如下文进一步所述的，细胞外来体表面标记物可以提供用于外来体的亲和纯化/检测的有用的目标。
细胞外来体标记物可以对于确定与参考样本相关的表达水平的变化提供有用的内部对照，并可以提供在检测表型组织变化(包括，例如，肝损伤，肝纤维化，炎症，肝细胞癌等)中有帮助的有用的标记物。正常外来体标记物的非限制性的实例包括CD9、CD10、CD26、CD53、CD63、CD81、CD82、Rab5、Alix、TSG101、Hsc70和Hsp90。
在一些实施方式中，反映组织损伤和/或疾病的细胞外来体标记物可以在特定的疾病状态，如肝纤维化或肝细胞癌中被专门检测到。在其他实施方式中，细胞外来体标记物可能相对于参考对照样本增加或相对于参考对照细胞降低。在外来体制备中的整体的总的表达水平方面，增加或降低可能是明显的。或者，在对于特定标记物而言是正的或负的的外来体总数中，表达水平的变化可能是明显的。
两种类型的肝上皮细胞(即，肝实质细胞和胆管细胞)，天然杀伤T(NKT)细胞，肝星状细胞，成体肝脏干细胞，和肝窦内皮细胞是外来体释放和/或外来体靶向细胞。与肝组织和肝脏疾病相关的外来体生物标记物是特别令人感兴趣的，因为它们的标记物可以说明与肝炎相关的状况，包括肝细胞癌(HCC)的预后的发生。
与其他的细胞衍生的外来体类似，肝衍生的外来体包括典型外来体标记物，其可以用于本申请中。它们包括常见的“标记物”蛋白质，如四跨膜区蛋白(例如CD9、CD10、CD26、CD53、CD63、CD81、CD82)；在MVB生源说中所涉及的与内体相关的蛋白，如Alix和TSG101；细胞质热休克蛋白，如Hsc70和Hsp90；以及肝细胞型特异性蛋白和核酸，包括mRNA，微小RNA(miRNA)和其他非编码RNA，其组成依赖于细胞的功能状态(如休止，刺激，应激，转化等)。
肝脏疾病标记物
有许多标记物可单独或结合用于检测肝脏疾病，如肝炎，肝纤维化和肝细胞癌。示例性肝脏疾病标记物包括但不限于，CD10、CD26、CD81、AST、ALT、α-甲胎蛋白(AFP)和它的各种异型体，包括AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3、AFP-P4、AFP-P5(E-PHA)和单唾液酸醣化的AFP；脱-羧基凝血酶原(des-carboxyprothrombin)(DCP)、α-1-岩藻糖苷酶(AFU)、γ-谷氨酰转移酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、高尔基体蛋白73(GP73)和粘蛋白1(MUC-1)、14-3-3γ、α-1-岩藻糖苷酶、γ-谷氨酰转移酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、鳞状细胞癌抗原、蛋白C(PROC)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、α-1-B糖蛋白(A1BG)、α-1-酸性糖蛋白(AGP)、Mac-2-结合蛋白(M2BP)、补体因子H(CFH)、胰岛素样生长因子结合蛋白酸标记的亚基(IGFALS)。
在一些实施方式中，A1BG的水平增加或CFH或IGFALS水平降低是急性或慢性肝炎的发病和/或严重性的指示。在其他实施方式中，蛋白C(PROC)和/或视黄醇结合蛋白4(RBP4)的水平降低是纤维化的严重程度增加的指示。
用于肝脏疾病(如肝纤维化)的miRNA标记物包括miR-92a、miR-122、miR-148a、miR-194、miR-155、miR-483-5p和miR-671-5p，其在较高的纤维化阶段表现出逐步增加，以及miR-106b、miR-1274a、miR-130b、miR-140-3p、miR-151-3p、miR-181a、miR-19b、miR-21、miR-24、miR-375、miR-548l、miR-93和miR-941，其在较高的纤维化阶段表现出表达的逐渐降低。
已知HCC细胞衍生的外来体含有小RNA的富集级分。示例性的与HCC相关的miRNA包括但不限于，miRNA-1、miRNA-122、miR-584、miR-517c、miR-378、miR-520f、miR-142-5p、miR-451、miR-518d、miR-215、miR-376a、miR-133b、miR-367。在一些实施方式中，检测标记物的面板包括miR-17-92群的一个或多个miRNA，这是众所周知由c-Myc反式激活的，如miR-17-5p、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a-1。
考虑到从肾上皮细胞衍生，以及在从尿液中分离的外来体中待检测方面，与肾组织和肾脏疾病相关的外来体生物标记物是引人注意的。来自正常尿液的示例性外来体生物标记物包括存在于每个肾小管段中的尖端转运子，包括近端小管(钠-氢交换体3，钠-葡萄糖共转运子1和2、以及水通道蛋白1(AQP1))、升支粗段(钠-钾氯化物共转运子2(NKCC2))、远曲小管(噻嗪敏感的Na-Cl共转运子(NCC))、以及连接小管/连接导管(AQP2，恒河猴血液C组糖蛋白(RhCG，氨通道)、液泡H+-ATP酶的亚基B1、和潘特林(pendrin))；肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物、肿瘤易感基因101、空泡蛋白分选28亚型1、空泡蛋白分选28亚型2、空泡蛋白分选37B、空泡蛋白分选37C、EAP25、EAP45、EAP30、CHMP2A、CHMP2B、CHMP3、CHMP4B、CHMP5、CHMP1A、CHMP1B、CHMP6、空泡蛋白分选因子4A、和空泡蛋白分选因子4B。基于来自肾脏和电解质代谢的NHLBI实验室的发表的和未发表的蛋白质质谱数据的来自健康人类志愿者的尿液外来体蛋白(和它们的序列)的数据库在dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/exosome/上可公开获得。
生物标记物的检测
在外来体中检测生物标记物的步骤可以使用任何适合于分离和/或检测与传染原相关的生物标记物的方法进行，包括但不限于，质谱(MS)，包括液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、高压液相色谱-质谱(HPLC-MS)和快速蛋白液相色谱(FPLC)；荧光激活细胞分选仪(FACS)分析、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)，包括夹心ELISA、从头蛋白质测序(例如，通过LC-MS/MS)、核苷酸测序、PCR、定量PCR(qPCR)或实时PCT、RT-PCR、qRT-PCR、抗体阵列、测试条、一维和二维电泳凝胶分析和它们的组合。
在一些优选的实施方式中，来自受试者的样本可以与特异性结合与传染原相关的生物标记物的抗体接触。非必须地，该抗体可被固定于固体载体以在该抗体与样本接触之前有助于洗涤和随后复合物的分离。固体载体的实例包括以微滴定板，棒，珠，或微珠形式的玻璃或塑料。在本文中包含的固体载体的实例包括部分或完全由玻璃形成的那些(例如，可控多孔玻璃，多糖(例如，琼脂糖)，聚丙烯酰胺，硅树脂，和塑料，如聚苯乙烯，聚丙烯和聚乙烯醇。在样本与抗体接触之前，可以以适当的稀释剂或洗脱剂稀释样本。
以抗体孵育样本之后，洗涤混合物并能够检测形成的抗体-生物标记物复合物。这可以通过以检测试剂孵育洗涤的混合物来实现。例如，这种检测试剂可以是标记有可检测的标签的第二抗体。示例性的可检测的标签包括磁珠(例如，DYNABEADSTM)，荧光染料，放射性标记，酶(例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶以及在ELISA中常用的其他物质)，以及比色标签如胶体金或有色玻璃或塑料珠。或者，在样本中的生物标记物可以使用间接测定法检测，其中，例如，使用第二标记的抗体以检测结合的特异性生物标记物抗体，和/或在竞争或抑制测定中检测，其中，例如，结合标记物的不同的表位的单克隆抗体与混合物同时孵育。
可以使用免疫测定法以确定样本中存在或不存在与传染原相关的生物标记物以及样本中的生物标记物的量。如果在样本中存在标记物，它会与在上述的适当的孵育条件下特异性结合标记物的抗体形成抗体-标记物复合物。可以通过与标准比较来确定抗体-标记物复合物的量。例如，标准可以是已知化合物或已知在样本中存在的另一种蛋白质。如上所述，不必以绝对单位来测量标记物的测试量，只要测量单位可以与对照相比即可。
本文所用的术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子，术语“抗体”还包括了那些免疫球蛋白分子的聚合物或片段，以及免疫球蛋白分子或其片段的人或人源化形式，只要它们因其与与传染原相关的生物标记物的相互作用的能力而被选择即可。可以使用本文所述的体外测定，或者通过类似方法对于其期望的活性来测试该抗体，之后，根据已知的临床测试方法测试其体内的治疗和/或预防活性。
示例性的抗体或源自抗体的片段可以包括由以下组成的组的任何成员：IgG，抗体可变区域；分离的CDR区域；包括通过允许在两个域之间的关联的肽连接子连接的VH和VL结构域以形成抗原结合位点的单链Fv分子(scFv)；双特异性scFv二聚体；包括结合到CH3结构域的scFv的小分子抗体(minibody)；双特异抗体(dAb)片段；由VH或VL结构域组成的单链dAb片段；由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；Fab'片段，与Fab片段不同，其在重链CH1结构域的羧基末端添加少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸；Fab'-SH片段，其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'片段；F(ab')2，包含两个连接的Fab片段的双价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；它们的衍生物；以及保留抗原结合功能的任何其他抗体片段。Fv，scFv，或双特异抗体分子可以通过连接VH和VL结构域的二硫桥的结合来稳定。当使用源自抗体的片段时，其任何或所有的靶向结构域和/或Fc区域可以是使用本领域技术人员公知的方法而“人源化的”。在一些实施方式中，修饰与传染原相关的抗体以去除Fc区域。
在一些实施方式中，使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测与传染原相关的生物标记物，所述酶联免疫吸附测定法通常使用抗体，抗原或凝集素涂覆的测试板或测试孔进行。常规使用的ELISA测定使用夹心免疫测定或者竞争结合免疫测定。
夹心ELISA可用于从小体积的体液中捕获、检测、表征和量化外来体。夹心ELISA使用两种抗体，其结合到抗原或配体上的不同位点。对抗原高度特异性的第一抗体是附着于固体表面的。然后加入抗原，接着加入被称为检测抗体的第二抗体。检测抗体与第一抗体相比结合到抗原的不同的表位。这些抗体中的每一个可以针对在相同或不同的外来体蛋白质上的不同的外来体标记物的表位，从而使第一抗体通过第一外来体蛋白捕获外来体或由其产生蛋白质，以及检测抗体有利于结合到其上的外来体蛋白质的量化。其结果是，外来体及由其产生蛋白质“夹在”两种抗体之间。夹心ELISA也可以使用外源凝集素以捕捉外来体。外源凝集素对于聚糖标记物(如糖蛋白)具有特别的亲和性，其经常出现在源自肿瘤细胞的外来体(如源自HCC的外来体)中。
用于在底物上固定化的外源凝集素的非限制性的实例包括扁豆凝集素(LCA)、雪花莲外源凝集素(GNA)、黄水仙外源凝集素(NPL)、大蒜外源凝集素(ASA)、扁豆外源凝集素(LCH)、黑接骨木外源凝集素(SNA)、山槐外源凝集素(MAL)、伴刀豆球蛋白A(Con A)、橙黄网孢盘菌外源凝集素(AAL)、翅荚百脉根外源凝集素(LTL)、莫桑比克喷毒眼镜蛇外源凝集素(NML)、双花扁豆凝集素(DBA)、螺旋蜗牛外源凝集素(HAL)、四棱豆外源凝集素II(PTL II)、多花紫藤外源凝集素(WFL)、鸡冠刺桐外源凝集素(ECL)、加纳籽外源凝集素II(GSL II)和菜豆白细胞凝集素(PHA-L)。
AFP-L3，甲胎蛋白的异型体，是HCC患者的血清中的主要糖型，并已知结合LCA。对于HCC的检测，AFP-L3标记物可以与其他的AFP糖型(包括AFP-P4、AFP-P5(E-PHA)和单唾液酸醣化的AFP)组合进行检测。与此相反，也可以使用AFP(AFP-L1)的L1亚型以检测肝脏疾病状态的非肝癌炎症。在一些优选的实施方式中，LCA外源凝集素是用于结合来自肝癌受试者的体液中的外来体。
(通过抗体或外源凝集素)对于抗原的亲合力通常是免疫测定灵敏性的主要决定因素。随着抗原浓度的增加，被结合的结合剂的量也增大，导致更高的测量响应。夹心-结合测定的标准曲线具有正的斜率。为了定量化结合的程度，可以使用不同报道分子。典型地，酶附着在二级抗体，所述二级抗体必须在与一级抗体不同种类中产生(即，如果第一抗体是兔抗体，那么二级抗体将是源自羊、鸡等而不是兔子的抗兔的)。将酶的底物加入到形成色度法读数(readout)作为检测信号的反应。生成的信号与样本中存在的目标抗原的量成比例。
用于测定结合活动的抗体连接的报道分子决定了检测方式。分光光度测量板读数器(reader)可以用于色度法检测。已经开发出许多种类的报道分子用以增大免疫测定法的灵敏性。例如，已经开发了化学发光底物，其进一步放大了信号，并且可以在发光板读数器上读出。此外，其中用荧光体标记抗体替代测定法的酶步骤可以得到荧光读数。这种读数随后通过使用荧光板读数器测定。
生物标记物板
在一些实施方式中，可以采用在微阵列中至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、40或50个肝脏疾病标记物的生物标记物板。在一些实施方式中，生物标记物板测定生物标记物蛋白的表达。在其他实施方式中，生物标记物板测定生物标记物mRNA或miRNA的表达。例如，与传染原相关的生物标记物可以使用在底物表面上的含有固定化的与传染原相关的生物标记物-特异性抗体的生物标记物微阵列面板来检测。所述微阵列可以用于“夹心”测定，其中在微阵列上的抗体捕捉实验样本中的与传染原相关的生物标记物并且捕捉的标记物用与捕捉的标记物特异性结合的标记的二级抗体检测。在优选实施方式中，二级抗体为生物素化的或者酶标记的。所述检测通过用抗生蛋白链菌素-荧光团轭合物(用于荧光检测)或者酶底物(用于色度法检测)随后孵育来实现。
典型地，微阵列测定包括多个孵育步骤，包括用样本孵育和用多种试剂(例如，一级抗体、二级抗体、报告试剂等)孵育。在孵育步骤之间，也需要重复清洗。在一个实施方式中，微阵列测定在需要唯一一个或两个孵育的快速测定方式中进行。也可以想象到，可检测免疫复合物(例如，捕捉的与传染原相关的生物标记物/抗标记物抗体/标签复合物)的形成可以通过将生物标记物微阵列暴露于样本和所有所需试剂的混合物而在单一的孵育步骤中实现。在一个实施方式中，所述一级抗体和二级抗体为相同的抗体。
在另一实施方式中，生物标记物微阵列提供竞争免疫测定。简要的说，在标记的与传染原相关的生物标记物标准物的存在下，包含固定化的抗标记物抗体的微阵列用测试样本孵育。标记的与传染原相关的生物标记物在测试样本中与未标记的与传染原相关的生物标记物竞争从而结合至固定化的抗原特异性抗体。在这一竞争设置中，测试样本中的特异性与传染原相关的生物标记物浓度的增大将导致标记的与传染原相关的生物标记物标准物与固定化的抗体结合的降低，并且因此减少源自标签的信号强度。
在一些实施方式中，检测可以包括用于检测和量化miRNA表达水平的寡核苷酸微阵列。寡核苷酸微阵列由阵列系列的多个寡核苷酸的微小斑点(称为特点)组成，每个都包含少量(通常在皮摩尔范围内)的特异性寡核苷酸序列。特异性寡核苷酸序列可以是被用作在高严格条件下与cDNA或cRNA杂交的探针的一小段基因或其他寡核苷酸元件。通常通过荧光团标记靶的基于荧光的检测来检测和量化探针-靶杂交，以确定靶标中的核酸序列的相对丰度。寡核苷酸探针是通过与化学基质(通过环氧硅烷，氨基硅烷，赖氨酸，聚丙烯酰胺或其他)的共价键而典型地附着到固体表面。固体表面可以是玻璃或硅芯片或微小珠。寡核苷酸阵列与其他类型的微阵列的不同仅在于它们是测量核苷酸还是使用寡核苷酸作为其检测系统的一部分。
所述生物标记物微阵列板可以以手工、半自动或者自动模式进行。手工模式是指手工操作所有测定步骤，包括将试剂和样本递送至微阵列上，样本孵育和微阵列清洗。半自动模式是指手工操作将样本和试剂递送至微阵列上，同时自动运行孵育和清洗步骤。在自动模式中，三个步骤(样本/试剂递送、孵育和清洗)可以通过具有小键盘的计算机或者集成实验电路板单元控制。例如，所述微阵列可以通过ProteinArray Workstation(PerkinElmer Life Sciences,Boston,Mass.)或者Assay 1200TM.Workstation(Zyomyx,Hayward,Calif.)进行。利用荧光、色度法和化学发光法的扫描器可以用于检测微阵列信号并且捕捉微阵列图像。基于微阵列的测定的量化也可以通过其他方式(如质谱法和表面等离子体共振)实现。捕捉的微阵列图像可以通过独立的图像分析软件来进行分析或者利用图像采集和分析软件包来进行分析。例如，抗原微阵列的量化可以利用基于荧光PMT的扫描器--ScanArray>
患者的治疗
在一些实施方式中，检测步骤可以进一步与以用于治疗感染或传染病状况的充足量的施加治疗药物的步骤相结合。对于给定的感染，可以采用任何常规治疗药物(例如，抗生素等)。
治疗剂可以靶向对于给定的传染原特异性的的任何蛋白质、酶或核酸，包括本文所述的任何传染原组分。治疗剂是基于小分子化合物、多肽、蛋白质或核酸的药物(例如，反义寡核苷酸，适体，siRNA，核酶等)。治疗剂可以是未修饰的，或者其可以被修饰以通过，例如，聚乙二醇化等来增加其稳定性、半衰期和/或生物利用度。治疗剂可以使用标准方法制备或从商业来源获得。
示例性抗菌剂或抗生素包括红霉素、克林霉素、四环素、甲硝唑、万古霉素、泰迪唑胺(tedizolid)、利奈唑胺、达托霉素喹诺酮(daptomycinquinolone)、β-内酰胺类、头孢氨苄、复方新诺明/甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、达托霉素、头孢洛林、头孢比普(ceftabiparole)、替考拉宁、替加环素、妥布霉素、左氧氟沙星、头孢比普(ceftobiprole)、头孢洛林、达巴万星、特拉万星、奥罗格雷(aurograb)、特地唑胺(torezolid)、艾拉普林、奈诺沙星、平板霉素，包括光学异构体、非对映体、对映体、水合物和它们的药学上可接受的盐，以及它们的混合物。
示例性的抗真菌剂包括但不限于，特比萘芬、伊曲康唑、咪康唑硝酸盐(micronazole nitrate)、噻苯哒唑(thiapendazole)、托萘酯、克霉唑和灰黄霉素辛乙二醇、三氯生、苯氧基乙醇、制霉菌素或克霉唑(clortrimazole)。
示例性的抗病毒剂包括但不限于、阿昔洛韦、溴夫定、西多福韦、地昔洛韦、去羟肌苷、泛昔洛韦、5-氟尿嘧啶、2-脱氧和5-脱氧-5-氟尿苷、更昔洛韦、碘苷、拉米夫定、洛布卡韦、喷昔洛韦、立妥威(retrovir)、索立夫定、三氟胸苷、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、阿糖腺苷、扎西他滨、齐多夫定、咪喹莫特(imiquiod)、二十二烷醇、溴呋啶(brivudin)、干扰素、泛昔洛韦、西多福韦、鬼臼树脂、鬼臼毒素及其组合。
在一些优选的实施方式中，被诊断为被急性或慢性感染HCV的患者可以以一种或多种HCV定向治疗剂进行治疗。示例性的HCV治疗剂包括但不限于，HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂，如波普瑞韦(boceprevir)(SCH-503034、SCH-7)、特拉匹韦(VX-950)、阿那匹韦(asunaprevir)(BMC-650032)、丹诺普韦(RG-7227)、法达普韦(faldaprevir)(BI-201335)、那拉普韦(narlaprevir)、西米普韦(simeprevir)(TMC435)、凡尼普韦(vaniprevir)(MK-7009)、VX-813、ABT-450、ACH-1625、ACH-2684、BI-1230、MK-5172、SCH-900518、VBY-376、VX-500、GS-9256、GS-9451、BMS-790052、BMS-605339、PHX-1766、AS-101、IDX320、YH-5258、YH5530和YH5531；丙型肝炎病毒NS5B聚合酶的核苷或核苷酸抑制剂，如索非布韦、非利布韦(filibuvir)(PF-868554)、mericitabine(RG7128)、伐洛他滨(NM-283)、PSI-7977、R1626、IDX184、IDX-102、PSI-7851、BCX-4678、VX-135和MK-0608；丙型肝炎病毒NS5B聚合酶的非核苷抑制剂，如特哥布韦(tegobuvir)、ABT-333、ABT-072、BI-207127、VCH-759、VCH-916、JTK-652、MK-3281、VBY-708、VCH-222、VX-222、A848837、ANA-598/司屈布韦(setrobuvir)、GL60667、GL59728、A-63890、A-48773、A-48547、BC-2329、VCH-796(奈司布韦)、GSK625433、BILN-1941和XTL-2125；丙型肝炎病毒NS5A抑制剂，如AZD-2836(A-831)、AZD-7295(A-689)、达卡他韦(daclatasvir)、GS-5885、GSK2336805、ABT-267、PPI-668和BMS-790052；干扰素，例如聚乙二醇化的重组干扰素-α2b的(佩乐能)、聚乙二醇化的重组干扰素-α2a(派罗欣)、重组干扰素-α2b(甘乐能)、重组干扰素-α2A(罗荛愫)、干扰素α(MOR-22、OPC-18、Alfaferone、Alfanative、Multiferon、苏巴林(subalin))、干扰素alfacon-1(干复津)、干扰素α-nl(惠福仁(Wellferon))、干扰素α-N3(Alferon)、干扰素β(Avonex、DL-8234)、干扰素Ω(Ω-DUROS、Biomed 510)、albinterferonα-2b(Albuferon)、IFNαXL、BLX-883(Locteron)、DA-3021、糖基化干扰素α-2b(AVI-005)、PEG-干复津、聚乙二醇化的干扰素λ(聚乙二醇化的IL-29)和belerofon；利巴韦林和其类似物，例如，利巴韦林(Rebetol，Copegus)和他立韦林(韦拉米啶)；α-葡萄糖苷酶1抑制剂，如西戈斯韦(celgosivir)(MX-3253)、米格列醇、和UT-231B；DBPR110、二噻唑类似物；亲环蛋白抑制剂，如DEB-025、SCY-635、NIM811和阿拉泊韦(alisporivir)；保肝药，如emericasan(IDN-6556)、ME-3738、GS-9450(LB-84451)、silibilin和的MitoQ；TLR-7激动剂，如咪喹莫特、852A、GS-9524、ANA-773、ANA-975、AZD-8848(DSP-3025)、PF-04878691和SM-360320；以及它们的组合，如NS3蛋白酶抑制剂特拉匹韦或波普瑞韦与peg-IFN和利巴韦林的组合。
治疗剂的适当的剂量(“治疗有效量”)将取决于，例如，待治疗的状况，状况的严重程度和病程，给药方式，抗体或试剂是否被施用于预防或治疗目的，特定试剂的生物利用度，以前的治疗，患者的年龄和体重，患者的临床史和对治疗剂的反应，使用的治疗剂的种类，主治医生的医嘱等而决定。所述治疗剂适于向患者一次或在一系列治疗下使用，并且可以在从诊断开始的任何时间向患者施用。所述治疗剂可以以单独治疗或者联合在治疗正被讨论的状况中有用的其他药物或疗法进行施用。
可以以公知的方法(例如，以推注或通过在一段时间内连续输注的静脉内施用)，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、外用或吸入途径，将治疗剂施用到患者。作为一般的建议，无论通过一次或多次施用，治疗剂的治疗有效量将在约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的范围内。在一个具体的实施方式中，各个抗炎剂在从约1ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的范围内给药。
外来体的分离
可以通过各种方法分离外来体，包括但不限于，密度梯度离心，差速离心，纳米膜超滤，免疫吸附捕获，亲和捕获，尺寸排阻层析，超速离心，以及超速离心之后尺寸排阻层析(UC-SEC)，磁激活细胞分选(MACS)，它们的组合等。
在一个实施方式中，通过经由离心而在体液样本中沉淀外来体而完成分离步骤。以适当的浓度洗涤并再悬浮沉淀的外来体以用于进一步分析。在一些实施方式中，样本可以在100,000×g以上进行离心10-120或60-120分钟以沉淀外来体。
在一些实施方式中，在体液样本中的外来体由两步离心的过程沉淀，包括一个低g力离心以除去尿中的细胞(call)和其他的大颗粒以及高g力离心以沉淀外来体。在一个实施方式中，样本首先在5,000-25,000×g离心5-30分钟。然后将上清液转移到另一管中，在100,000×g以上再次离心30-120分钟以沉淀外来体。在一个优选的实施方式中，体液样本首先在20,000-22,000×g离心10-20分钟。然后将上清液转移到另一管中，在100,000×g再次离心30-90分钟以沉淀外来体。然后在液体介质中再悬浮沉淀的外来体以用于进一步分析。
所述液体介质可以是等渗的、低渗的或高渗的。在一些实施方式中，所述液体介质含有缓冲剂和/或至少一种盐或盐的组合。缓冲剂可以维持pH值在特定范围内，例如1和12之间，并且也被称为pH稳定剂。更典型地，pH值将在约pH 5.0至约pH 12.0的范围内。pH稳定剂的具体实例是两性离子。pH稳定剂的具体的非限制性实例包括三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(TRIS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、N-三[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-[羧甲基]-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-[2-乙酰氨基]-2-亚氨基二乙酸(ADA)、N,N-双[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸(BES)、N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-羟基丙磺酸](HEPPSO)、N-三[羟甲基]甲基甘氨酸(TRICINE)、N、N-双[2-羟乙基]甘氨酸(BICINE)、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-(环己基氨基-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(3-丙磺酸)(EPPS)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸(PIPES)、[(2-羟基-1,1-双[羟甲基]乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、3-[(1,1-二甲基-2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、乙醇胺和3-氨基-1-丙磺酸。pH稳定剂的额外的具体非限制性实例包括氯化钾、柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾、硼酸、磷酸二氢钾、二乙醇胺、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、碳酸钠、四硼酸钠、二甲胂酸、咪唑、2-氨基-2-甲基-1-丙二醇、三(羟甲基)甲基甘氨酸、Gly-Gly、N,N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、和磷酸盐缓冲液(例如、磷酸钠或磷酸钠-钾，等等)。
缓冲剂或pH稳定剂典型地在约0.1mM至约500mM的范围内、在约0.5mM至约100mM的范围内、在约0.5mM至约50mM的范围内、在约1mM至约25mM的范围内、在约1mM至约10mM范围内使用。更具体而言，缓冲剂可以具有约(即，在10％以内)1mM、2mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM或50mM的浓度。
所述液体介质可进一步包含螯合剂。螯合剂通常与金属离子形成多重键，并且是可与金属螯合的多齿配体。金属螯合可以进而减少或防止微生物生长或者使生物分子(例如，肽或核酸)降解，这反过来又可以提高吸附到底物的生物分子的保存。螯合剂的具体非限制性实例包括EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-O,O'-双(2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸)、GEDTA(乙二醇醚二氨基四乙酸)、HEDTA(N-(2-羟基乙基亚乙基二胺-N,N',N'-三乙酸)((N-(2-hydroxyethypethylenediamine-N,N',N'-triacetic acid))、NTA(次氮基三乙酸)、水杨酸、三乙醇胺和卟吩。螯合剂的典型浓度是在约0.1mM至约100mM的范围内、在约0.5mM至约50mM的范围内、或在约1mM至约10mM范围内。
所述液体介质还可包含变性剂。变性剂和去垢剂通常形成疏水性和亲水性环境之间的化学桥，进而破坏或减少维持天然蛋白质结构所需的疏水力。变性剂和去垢剂特定的非限制性的化学类别包括阴离子表面活性剂，非离子表面活性剂，阳离子表面活性剂和两性表面活性剂。去垢剂的具体非限制性实例包括硫氰酸胍、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、NP40、Triton X-100、吐温、胆酸钠、脱氧胆酸钠、氯化苄乙氧铵、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、十六烷基三甲基铵溴化物，以及N,N-二甲基癸基胺-N-氧化物。
所述液体介质可进一步包含变性剂。还原剂和抗氧化剂通常抑制微生物的生长和减少生物分子的氧化。这类试剂的具体非限制性种类包括自由基清除剂。还原剂和抗氧化剂的具体非限制性实例包括DTT(二硫苏糖醇)，二硫赤藓糖醇，尿素，尿酸，2-巯基乙醇，半胱氨酸，维生素E，维生素C，连二硫酸盐，巯基乙酸和焦亚硫酸盐。
所述液体介质可进一步包含防腐剂或稳定剂。如果期望抑制或延迟与肝炎病毒相关的生物标记物的降解，可以使用防腐剂或稳定剂。防腐剂和稳定剂的具体非限制性实例包括叠氮化钠和聚乙二醇(PEG)。防腐剂和稳定剂的典型浓度在约0.05％至约1％的范围内。
所述液体介质可进一步包含一种或多种蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂抑制肽降解。蛋白酶抑制剂的具体非限制性种类包括结合蛋白酶的底物(例如，肽)的可逆的或不可逆的抑制剂。蛋白酶抑制剂的具体非限制性种类包括丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的具体的非限制性实例包括PMSF、PMSF Plus、APMSF、抗凝血酶III、抑氨肽酶素、抗蛋白酶素(antipain)、抑肽酶、苯丁抑制素、苄脒、糜蛋白酶抑素、钙蛋白酶抑制剂I和II、E-64,3,4-二氯异香豆素、DFP、弹性蛋白酶抑制剂(elastatinal)、亮肽素、胃酶抑素、1,10-菲咯啉、磷酸阿米酮(phosphoramidon)、TIMP-2、TLCK、TPCK、胰蛋白酶抑制剂(大豆或鸡蛋白)、水蛭素(hirustasin)、α-2-巨球蛋白、4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)和Kunitz型蛋白酶抑制剂。
在另一个实施方式中，体液样本中的外来体中通过将体液样本经过具有孔径比外来体的平均尺寸更小的过滤器而收集。然后，外来体被从过滤器去除，并在适当的浓度下再悬浮以用于进一步分析。在一些实施方式中，所述体液样本中的外来体用具有约500kd至50kd之间的分子量截留的离心机过滤器收集。在一个实施方式中，所述体液样本中的外来体用具有约100kd的分子量截留的离心机过滤器收集。
在其他实施方式中，体液或其无细胞上清液可以以在外来体颗粒的表面上涂覆有一种或多种抗体识别标记物蛋白的珠来孵育。示例性外来体表面标记物包括但不限于，MHC II类标记物，包括HLA DP，DQ和DR单倍体的那些；CD9，CD63，CD81和CD82。
在一个实施方式中，针对外来体表面标记物的抗体附着到磁性珠，如由
可以向使用体积排除聚合物制备的外来体样本加入抗体涂覆
一旦已经制备了分离的外来体样本，外来体的内容可以被直接分析，或被进一步提取以用于额外的研究和表征。可以从外来体提取的生物材料包括蛋白质，肽，RNA和DNA，脂质。例如，可以使用mirVanaTM>TM试剂盒(AM1556，Life>
可以使用酸-苯酚：氯仿提取来提取总RNA。然后可以使用玻璃纤维过滤器在回收包含小RNA的总RNA的条件下，或者在从较长的RNA种类(如mRNA)分离长度小于200个核苷酸的小RNA种类的条件下纯化RNA。因为RNA以小体积被洗脱，可能不需要醇沉淀步骤来分离RNA。
试剂盒
本申请的另一个方面涉及一种试剂盒，以用于检测与传染原相关的疾病或监测在受试者中的与传染原相关的疾病的进展。所述试剂盒包含用于制备外来体制备品的一种或多种试剂；对一种或多种传染病或传染病状况选择性的一种或多种与传染原相关的生物标记物的结合剂；一种或多种与传染原相关的生物标记物标准，以及一种或多种检测试剂，用于检测所述一种或多种生物标记物结合剂和一种或多种与传染原相关的生物标记物的结合。
用于检测所述一种或多种生物标记物结合剂和一种或多种与传染原相关的生物标记物的结合的所述检测试剂可以包括抗体试剂，包括辣根过氧化物酶(HRP)-抗体偶联物等，以用于检测和量化蛋白水平，以及扩增引物或寡核苷酸探针，以用于检测和量化与传染原相关的基因组核酸、mRNA水平和miRNA。
在一些实施方式中，试剂盒包括用于收集在体液样本中的外来体的一个或多个离心过滤器。在一个相关的实施方式中，所述一个或多个离心过滤器具有500kd-50kd的分子量截留。在另一个相关的实施方式中，所述一个或多个离心过滤器具有100kd、200kd、300kd、400kd、500kd、600kd、700kd、800kd、900kd或1,000kd的分子量截留。
上述的试剂盒可以另外包括适用于使从体液样本分离的外来体再悬浮的液体，以及用于收集体液样本一个或多个容器，和/或用于从所述体液样本分离外来体的离心过滤器。此外，上述的试剂盒通常包括标签或包装插入物，包括组分或使用说明的说明。示例性的说明包括，用于收集体液样本的说明，从样本收获外来体的说明，以及用于检测与传染原相关的生物标记物的说明。
本申请通过如下实施例进一步进行解释，其不应解释为对本申请的限制。所有通过本申请引用的参考文献、专利和公开专利申请以及图和表的内容在此以引用方式并入本文。
实施例1：材料和方法
患者
从亚特兰大都会区中的四个临床场所招募肝炎患者以用于这项研究。根据由机构审查委员会和人体试验研究委员会在茅赫斯医学院批准的协议收集所有样本，并根据该机构审查委员会制定的指导方针，从所有患者和健康志愿者获得知情同意书。还从患者的医疗记录收集相关信息。
样本采集和存储
从日常的就诊患者收集尿样。从患者的医疗记录获得临床数据。在无菌容器中收集尿液，并运回到实验室。使用Multistix 10SG试剂条(Bayer公司，埃尔克哈特，印第安纳州)和由Siemens Clinitek微量白蛋白试纸(Bayer公司)测定的白蛋白肌酸比值在各试样上进行尿分析。在Siemens Clinitek Status仪(Bayer公司)上读取这些条。在2000×g离心样本10分钟以除去完整细胞和沉淀物。其余尿样等分入4ml体积并在-80℃储存直到分析它们。
外来体的分离
两种方法用于评价外来体的分离，高速超速离心或者使用分子量截留过滤器的超滤。对于超速离心法，将4ml尿液转移到聚碳酸酯离心管中，并在21000×g离心15分钟。除去上清液并在100,000×g下再次离心60分钟以沉淀外来体。倾析过量的尿液并将颗粒在100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重建，并在4℃储存。对于超滤法，向Amicon超离心过滤装置(Ultracel，100k截留，Millipore公司)加入4ml尿液，并在吊桶式转子中在4000×g离心20分钟。使用一百μl的PBS以冲洗过滤器和稀释截留物。使用双金鸡宁酸蛋白质测定法(Pierce)测定蛋白质浓度。
表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)
使用通过亲水性和带电残基结合蛋白质的常规相芯片(蛋白质芯片NP20；Ciphergen Biosystems公司，弗里蒙特，加利福尼亚州)用于分析。重复施加五μl的囊泡制备品到芯片并在潮湿室中孵育30分钟。用5μl高效液相色谱(HPLC)级水清洗芯片三次，并用空气干燥10分钟。根据生产商的说明书在50％的乙腈/0.5％的三氟乙酸中制备饱和芥子酸(SPA，CiphergenBiosystems，CA)。对每个点以一μl的基质溶液(SPA)并风干，随后使用以下设置以ProteinChip Reader II(Ciphergen Biosystems)读取：激光强度250；探测器灵敏度10；高质量300Kda，优化从3Kda至50Kda。数据采集方法设置为自动激光调节，且峰值为从3Kda和50Kda自动识别。
液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)
使用LTQ质谱仪(ThermoFinnigan)通过LC/MS分析收集的外来体。首先以分析当天新鲜制备的2D凝胶上样缓冲液(Q-biosciences公司)提取颗粒状的外来体。然后将溶解的颗粒使用四个体积的冰冷(-20℃)丙酮沉淀，并在-20℃下孵育过夜。通过在19,200×g下离心收集沉淀物。将颗粒干燥并重新溶解于50mM的碳酸氢铵(AmBIC)中。首先在56℃下使用2μl的500mM的DTT原液(Q biosciences，单次使用)还原该蛋白质溶液30分钟。然后通过加入2μl的1M的碘乙酸原液(IAA，Q-biosciences，单次使用)并在室温下在黑暗中孵育30分钟以使溶液烷基化。将新鲜小瓶的胰蛋白酶(Promega Gold mass spec grade)8μl在50mM的AmBic中稀释至312μl并在冰上保持。然后，向反应加入十微升的稀释的胰蛋白酶，并将其在37℃振荡下孵育4小时。然后加入50μl的0.5％的甲酸，并将该混合物直接分析或存储在-20℃以进行分析。使用自动采样器将十微升的样本以10μl每分钟的流速注入到captrap(Michrom)C18肽阱。10分钟后，流动被切换到0.5mm x50微米的C18柱(Microm)。在50分钟内使用在水中的5-40％的线性梯度的乙腈洗脱肽。使用微喷雾电离(Michrom Advance)以约3μl每分钟的流动速率将洗脱的肽直接引入到LTQ质谱仪。使用被设置为在数据依赖的扫描模式中分析离子的Excalibur2.2软件分析样本。前体的扫描之后接着三个最激烈的离子的数据依赖的扫描。
外来体ELISA
涂覆有100ul的μg/ml GNA并以封闭缓冲液封闭的Nunc 96条井ELISA板以250μl的洗涤缓冲液(PBS中的0.1％吐温-20)洗涤一次。阳性对照(来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的甘露聚糖)和样本以100μl/孔的量加入到该板中，并在室温下孵育1小时。将所述板用250μl的洗涤缓冲液洗涤1次。将100μl的HRP标记的GNA(1ug/ml)或对于在目的外来体上的标记物有特异性的抗体加入到各个孔并在室温下孵育1小时。将所述板用250μl的洗涤缓冲液洗涤4次。将100μl的四甲基联苯胺(TMB)加入到各个孔中，并在室温下孵育30分钟或直到空白孔开始显示颜色。通过向每个孔加入100μl的1M H2SO4来停止该反应。将所述板在450nm下用ELISA板读数器中读数。用稀释缓冲液(在PBS中的1％BSA，0.1％吐温-20)进行样本或抗体的系列稀释。标记物特异性抗体包括以下内容：
抗丙型肝炎NS4b抗原抗体，小鼠单克隆(MA1-7358，Thermo Scientific)；
抗丙型肝炎NS3抗原抗体，小鼠单克隆(MA1-7357，Thermo Scientific)；
抗丙型肝炎核心抗原抗体，小鼠单克隆(ab2582，Abcam)；
抗丙型肝炎抗体-核心抗原，小鼠单克隆(MA1-080，Thermo Scientific)；
抗丙型肝炎NS3抗原抗体，小鼠单克隆(MA1-21376，Thermo Scientific)；
抗丙型肝炎NS4抗原抗体，小鼠单克隆(MA1-91550，Thermo Scientific)；
抗丙型肝炎NS5a抗原抗体，小鼠单克隆(MA1-7368，Thermo Scientific)；
抗甲型肝炎病毒抗体，山羊多克隆(LS-C103171，Lifespan Biosciences)；
抗乙型肝炎病毒抗体，山羊多克隆(LS-C5624，Lifespan Biosciences)；
抗ALG6(α-1,3-葡萄糖基转移酶或多萜醇焦磷酸酯(Dolichylpyrophosphate)Man9GlcNAc2α-1,3-葡糖基转移酶)抗体-小鼠单克隆，重组片段：SYSGAGKPPM FGDYEAQRHW QEITFNLPVK QWYFNSSDNNLQYWGLDYPP LTAYHSLLCA YVAKFINPDW IALHTSRGYESQAHKLFMRT，对应于人类ALG6的氨基酸25-115(ab57112，Abcam)；
抗ALG6抗体-兔多克隆，对应于人类ALG6的N端氨基酸36-85(GDYEAQRHWQ EITFNLPVKQ WYFNSSDNNL QYWGLDYPPLTAYHSLLCAY)中的区域的合成肽(NP_037471)(ab80873，Abcam)；
以及抗ALG3(α-1,3-甘露糖转移酶或多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖转移酶)抗体-兔多克隆，重组片段，对应于人类ALG3的氨基酸69-122(ab151211，Abcam)。
实施例2：来自患者的尿外来体中的乙肝病毒生物标记物的夹心ELISA分析
对从肝炎患者和正常对照患者中分离的尿的外来体进行分析，以通过外来体ELISA分析甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)以及丙型肝炎病毒(HCV)相关的生物标记物的存在。
图1示出了在外来体ELISA中使用抗乙型肝炎的抗体检测乙型肝炎的受者作用特征(ROC)曲线。
图2是在外来体ELISA中使用HCV核心抗原和HCV NS3蛋白作为用于丙型肝炎的生物标记物检测丙型肝炎的ROC曲线。
以上的描述是出于教导本领域的技术人员如何实践本申请的目的，并且不意图详细说明所有的对于阅读了说明书的本领域技术人员变得显而易见的那些明显的修改和变化。然而，可以预期所有这些显而易见的修改和变化都包括在由以下权利要求中限定的本申请的范围之内。除非上下文中明确地相反指示，否则权利要求书意图有效地满足期望目的的任意顺序的组成和步骤。在说明书中引用的所有参考文献在此通过引用以其全文并入。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于检测受试者中肝炎病毒感染或与肝炎病毒相关的疾病状况的方法，包括：
(a)从来自所述受试者的尿液样本制备细胞外囊泡体制备品；
(b)使所述细胞外囊泡体制备品与一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或适合检测对HVA、HBV、HCV、HDV或HEV选择性的至少一种与肝炎病毒相关的生物标记物的一种或多种检测试剂接触；以及
(c)基于至少一种与肝炎病毒相关的生物标记物的存在或不存在确定所述受试者是否具有或不具有由肝炎病毒引起的感染或疾病状况，
其中在步骤(c)中至少一种与肝炎病毒相关的生物标记物存在标志由HAV、HBV、HCV、HDV或HEV引起的感染或传染病状况，并且
其中在步骤(c)中至少一种与肝炎病毒相关的生物标记物不存在标志不存在由HAV、HBV、HCV、HDV或HEV引起的感染或传染病状况。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞外囊泡体制备品包含整个细胞外囊泡体。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞外囊泡体制备品包含细胞外囊泡体溶解产物。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞外囊泡体制备品通过差速离心、纳米膜超滤、免疫吸收剂捕获、尺寸排阻层析、超速离心、磁激活细胞分选(MACS)或它们的组合分离。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或一种或多种检测试剂包含至少一种对于所述与肝炎病毒相关的生物标记物选择性的抗体。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂被固定在固体载体上并且所述细胞外囊泡体被捕获在所述固体载体上，然后检测所述至少一种与肝炎病毒相关的生物标记物。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或一种或多种检测试剂包含用于RNA反转录的一种或多种试剂、用于基因组核酸或mRNA扩增和检测的一种或多种PCR试剂、或用于检测miRNA的一种或多种寡核苷酸。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂对HBV是选择性的。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂对HCV是选择性的。
10.如权利要求9所述的方法，其中步骤(b)包括使所述细胞外囊泡体制备品与对于选自核心抗原、C蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4a蛋白、NS4b蛋白、NS5a蛋白和NS5b蛋白的HCV蛋白选择性的一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂接触。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中步骤(b)进一步包括使所述细胞外囊泡体制备品与适合检测选自miR-92a、miR-122、miR-148a、miR-194、miR-155、miR-483-5p和miR-671-5p、miR-106b、miR-1274a、miR-130b、miR-140-3p、miR-151-3p、miR-181a、miR-19b、miR-21、miR-24、miR-375、miR-548l、miR-93、和miR-941、miRNA-1、miRNA-122、miR-584、miR-517c、miR-378、miR-520f、miR-142-5p、miR-451、miR-518d、miR-215、miR-376a、miR-133b和miR-367的miRNA的一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂接触。
12.如权利要求9或10所述的方法，其中步骤(b)进一步包括使所述细胞外囊泡体制备品与能够检测肝损伤和/或肝细胞癌的一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂接触，其中所述一种或多种试剂选自CD10、CD26、CD81、AST、ALT、α-甲胎蛋白(AFP)、AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3、AFP-P4、AFP-P5(E-PHA)、单唾液酸醣化的AFP、脱-羧基凝血酶原(des-carboxyprothrombin)(DCP)、α-1-岩藻糖苷酶(AFU)、γ-谷氨酰转移酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、高尔基体蛋白73(GP73)和粘蛋白1(MUC-1)、14-3-3γ、α-1-岩藻糖苷酶、γ-谷氨酰转移酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、鳞状细胞癌抗原、蛋白C(PROC)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、α-1-B糖蛋白(A1BG)、α-1-酸性糖蛋白(AGP)、Mac-2-结合蛋白(M2BP)、补体因子H(CFH)和胰岛素样生长因子结合蛋白酸标记的亚基(IGFALS)。
13.如权利要求1所述的方法，包含多个对常见的肝炎病毒选择性的与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂。
14.如权利要求1所述的方法，包含对多个不同的肝炎病毒选择性的多个与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂。
15.如权利要求1-7中任一项所述的方法，进一步包括以对于治疗由HAV、HBV、HCV、HDV或HEV引起的肝炎病毒感染或与肝炎病毒相关的疾病状况有效的量施用治疗药物的步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述肝炎病毒感染或与肝炎病毒相关的疾病状况由HCV引起。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述肝炎病毒感染或与肝炎病毒相关的疾病状况由HBV引起。
18.一种用于监测受试者中肝炎病毒感染或与肝炎病毒相关的疾病状况的进程的方法，包括：
(a)测定在来自受试者的代表第一时间点的第一细胞外囊泡体制备品中的一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物的水平；
(b)测定在来自受试者的代表第二时间点的第二细胞外囊泡体制备品中的一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物的水平；
(c)比较在所述第一细胞外囊泡体制备品中的所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物的水平和在所述第二细胞外囊泡体制备品中的所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物的水平；以及
(d)基于步骤(c)的结果确定在所述第一时间点和所述第二时间点之间疾病进展的程度，其中所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物对于选自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的一个或多个成员是选择性的。
19.一种用于监测在带有肝炎感染或与肝炎疾病相关的状况的受试者中治疗的有效性的方法，包括：
(a)测定在来自受试者的代表第一时间点的第一细胞外囊泡体制备品中的一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物的水平；
(b)测定在来自受试者的代表第二时间点的第二细胞外囊泡体制备品中的一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物的水平；
(c)比较在所述第一细胞外囊泡体制备品中的所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物的水平和在所述第二细胞外囊泡体制备品中的所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物的水平；以及
(d)在基于步骤(c)中的结果确定在所述第一时间点和所述第二时间点之间疾病进展的程度的基础上，确定在所述受试者中治疗的有效性，其中所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物对于选自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的一个或多个成员是选择性的。
20.一种用于检测受试者中肝炎病毒感染或与肝炎病毒相关的疾病状况的试剂盒，包括：
用于制备细胞外囊泡体制备品的一种或多种试剂；
一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂，其对于选自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的一种或多种肝炎病毒是选择性的，以及
一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物标准，其对于选自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的一种或多种肝炎病毒是选择性的。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述用于制备细胞外囊泡体制备品的试剂包含具有500kd-50kd的分子量截留的一种或多种离心机过滤器。
22.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述用于制备细胞外囊泡体制备品的试剂包括涂覆有抗体的珠，所述抗体针对选自CD9、CD63、CD81和CD82的一种或多种细胞外囊泡体标记物。
23.如权利要求20-22中任一项所述的试剂盒，其中所述传染原是HCV。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂对于选自核心抗原、C蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4a蛋白、NS4b蛋白、NS5a蛋白、NS5b蛋白和它们的组合的一种或多种HCV蛋白是选择性的。
25.如权利要求23所述的试剂盒，包含适合检测选自miR-92a、miR-122、miR-148a、miR-194、miR-155、miR-483-5p和miR-671-5p、miR-106b、miR-1274a、miR-130b、miR-140-3p、miR-151-3p、miR-181a、miR-19b、miR-21、miR-24、miR-375、miR-548l、miR-93、和miR-941、miRNA-1、miRNA-122、miR-584、miR-517c、miR-378、miR-520f、miR-142-5p、miR-451、miR-518d、miR-215、miR-376a、miR-133b、miR-367以及它们的组合的miRNA的一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂。
26.如权利要求23所述的试剂盒，包含适合检测肝损伤和/或肝细胞癌的一种或多种与肝炎病毒相关的生物标记物结合剂和/或检测试剂，其中所述一种或多种检测试剂选自CD10、CD26、CD81、AST、ALT、α-甲胎蛋白(AFP)以及它的各种异型体，包括AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3、AFP-P4、AFP-P5(E-PHA)以及单唾液酸醣化的AFP；脱-羧基凝血酶原(des-carboxyprothrombin)(DCP)、α-1-岩藻糖苷酶(AFU)、γ-谷氨酰转移酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、高尔基体蛋白73(GP73)和粘蛋白1(MUC-1)、14-3-3γ、α-1-岩藻糖苷酶、γ-谷氨酰转移酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、鳞状细胞癌抗原、蛋白C(PROC)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、α-1-B糖蛋白(A1BG)、α-1-酸性糖蛋白(AGP)、Mac-2-结合蛋白(M2BP)、补体因子H(CFH)、胰岛素样生长因子结合蛋白酸标记的亚基(IGFALS)以及它们的组合。
机译： 外来体介导的感染和疾病检测
机译： 外来体介导的感染和疾病检测
机译： 外来体介导的感染和疾病检测
