一种两栖类动物来源缓激肽及其应用

摘要

本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种海南湍蛙缓激肽bradykinin‑AH及其应用。海南湍蛙缓激肽bradykinin‑AH为直链多肽，分子量1269.4Da，等电点9.6。本发明克隆得到海南湍蛙缓激肽bradykinin‑AH的编码基因，并利用化学合成的方法合成了bradykinin‑AH。该缓激肽具有极强的促进离体豚鼠回肠肌收缩的活性。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH及其应用。

背景技术

缓激肽是激肽释放酶-激肽系统中一种主要的激肽类物质，在体内参与多系统器官的功能调节和病理生理过程，如心血管、肾脏、中枢神经系统的调节，葡萄糖代谢、细胞增殖、平滑肌收缩、炎症、疼痛休克和组织损伤等过程。人体中缓激肽为一种血管活性九肽，由激肽释放酶直接降解激肽原或者由赖氨酰舒缓激肽转变而来。缓激肽通过与靶细胞缓激肽受体结合发挥作用。人体中缓激肽受体有B1和B2两种，B1受体在正常生理情况下不存在，但在炎症和组织损伤后可诱发表达，参与炎症过程。B2受体在外周分布较广，血管/非血管平滑肌及心肌细胞上均有分布，缓激肽与B2受体的结合能够促进平滑肌收缩，促进血管扩张，降血压。

两栖类动物皮肤中含有丰富的激肽类物质，目前为止从两栖类动物中发现多种均有缓激肽功能的多肽。虽然与哺乳动物缓激肽结构差异较大，但两栖动物缓激肽同样具有促进平滑肌收缩和降血压的功能，具有一定的药物开发潜力。

海南湍蛙(Amolops hainanensis)属于两栖纲无尾目蛙科湍蛙属，主要分布于海南省。到目前为止尚无关于海南湍蛙缓激肽的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH，海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH为直链多肽，分子量1269.4Da，等电点9.6。

所述海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH氨基酸序列为：

Arg¹>2>3>4>5>6>7>8>9>10>11>12。

所述编码海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH前体为SEQ ID No.1所示碱基序列。

所述编码海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH前体的基因由303个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:

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一种海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH的应用，其特征在于：所述海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH在用于制备促血管扩张和降血压药物中的应用。

本发明所具有的优点：本发明克隆得到海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH的编码基因，并利用化学合成的方法合成了bradykinin-AH。该缓激肽具有极强的促进离体豚鼠回肠肌收缩的活性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的不同浓度bradykinin-AH促进离体豚鼠回肠肌收缩的作用曲线图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH基因克隆：

1)海南湍蛙皮肤总RNA提取：

①取300mg海南湍蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1m1总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Invitrogen公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为海南湍蛙皮肤总RNA。

2)海南湍蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TMDirectional>

(1)cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

①经DEPC处理(DEPC处理是在含0.1％(V/V)DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干)的离心管中加入1μl海南湍蛙皮肤总RNA、1μl 3’端一链合成引物(3’In-Fusion SMARTer CDS Primer)和2.5μl经DEPC处理(DEPC处理是将含0.1％(V/V)DEPC的水，放置过夜，高压灭菌)的水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂(均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TMDirectional>

(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TM>

①将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl 50×Advantage 2Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。

②在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。

(3)海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH基因克隆筛选：

根据蛙科缓激肽编码基因信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5’-CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TM>2-MgCl₂法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied>

测定结果：

编码海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH前体的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No.1所示：

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(a)序列特征：

*长度：303碱基对(有效长度为130-165碱基对)

*类型：核苷酸

*链型：单链

*拓扑结构：直链状

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：海南湍蛙

实施例2

海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH的化学合成：

Ⅰ、海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH的化学合成方法：根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。

Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。

Ⅲ、纯化的海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH是基因编码的一种直链多肽，含有十二个氨基酸残基，1269.4Da，等电点9.6。海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH全序列为：Arg¹Ala²Asp³Gly⁴Pro⁵Pro⁶Gly⁷Phe⁸Ser⁹Pro¹⁰Leu¹¹Arg¹²。

实施例3

海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH活性实验：

1.海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH促回肠肌收缩活性检测：

取豚鼠(体重在150-250g，性别随机)约10cm长的末端回肠肌，迅速放入台式液中(台式液为137mM NaCl,2.7mM KCl,1.36mM CaCl₂,0.49mM>2,0.36mM>2PO₄,11.9mM>3,5.04mM>

结果如图1所示，bradykinin-AH具有极强的促进离体豚鼠回肠肌收缩的活性，且其活性具有浓度依赖性，随着多肽浓度的升高，其活性逐渐增强。

2.海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH溶血活性测定：

将离体人血与阿氏液按1:1混合抗凝得混合液，而后采用生理盐水洗涤2次，并用生理盐水重悬上述抗凝的混合液成10⁷-10⁸cell/ml的悬浮液。上述悬浮液(红细胞悬液)与溶解于生理盐水的海南湍蛙缓激肽bradykinin-AH样品混合，使样品终浓度为200μg/ml，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton>样品-A_阴性对照/A_阳性对照×100％。

结果表明样品浓度为200μg/ml时，bradykinin-AH的溶血百分比为4.5％，说明bradykinin-AH具有极低的溶血活性，不会引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在医药领域进一步的开发应用。