带g6pd1303‑1497位点缺失的转基因斑马鱼模型及构建方法

摘要

本发明公开了一种带g6pd1303‑1497位点缺失的转基因斑马鱼模型，将g6pd基因带1303‑1497位点缺失的gata1‑g6pd

说明书

技术领域

本发明属于设计基因工程技术领域，特别涉及一种带g6pd1303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型及构建方法。

背景技术

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(gluocose-6-phosphate dehydrogenasedeficiency，简称G6PD缺乏症)俗称蚕豆病，是世界上最常见的遗传性溶血性红细胞酶缺陷病。G6PD基因突变导致G6PD酶活性降低，主要通过两种机制影响酶的活性，即影响G6PD功能结构区的作用和G6PD二聚体的形成。G6PD酶是参与红细胞酵解磷酸戊糖氧化途径的起始限速酶，主要功能是催化生成重要的还原性物质还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，而NADPH是维持机体重要抗氧化物质还原型谷胱甘肽(GSH)还原状态所必需的辅酶。当机体G6PD酶活性缺乏时，会影响NADPH的产生，NADPH是机体多种物质合成代谢的供氢体，同时维持还原型谷胱甘肽(GSH的还原状态)的生成量，从而减弱机体还原型谷胱甘肽(GSH)及过氧化氢(H₂O₂)抗氧化剂的抗氧化效果，使红细胞中的血红蛋白及红细胞膜在接触氧化性损伤时易损害。产生大量的氧自由基，此时，红细胞膜无法抵抗氧化攻击，红细胞膜蛋白间聚合键遭受破坏，受累红细胞因此失去变形能力，容易在血流的冲击及毛细血管的挤压作用下发生破溶，进而发生急性溶血。

目前全世界就G6PD缺乏症发病的详细机制尚不清楚，有待进一步的研究探讨。常见临床表现包括新生儿黄疸、药物或感染造成的急性溶血、蚕豆病和先天性非球形细胞溶血性贫血(CNSHA)等。现今，对G6PD缺乏症的治疗措施主要为早期筛查，避免诱发因素等预防治疗措施。一旦经确诊后的病例给予服禁用药物，避免诱发因紊。高胆红素血症予以蓝光照射、碱化血液、输白蛋白、输血等对症治疗，以及相关辅助治疗。国内外仍未有特异性治疗G6PD缺乏症的治疗措施，也没有一种十分理想的动物实验模型可以很好的实现G6PD基因的结构变化与功能之间关系的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种带g6pd1303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为一种带g6pd1303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型，将g6pd基因带1303-1497位点缺失的gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

本发明还提供了一种构建所述的带g6pd1303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型的方法，包括以下步骤：

(1)将g6pd^M1303-1497-EGFP-PCS²⁺，gata-1-PBSK-IsceI质粒酶切连接构建gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

(2)将所述gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

(3)通过观察24hpf期胚胎是否表达绿色荧光筛选出转基因的胚胎并孵化养至成鱼作为F0代转基因斑马鱼；

(4)以所述F0代转基因斑马鱼与野生型交配后产生的表达绿色荧光的胚胎孵化并养至成鱼作为F1代转基因斑马鱼；

(5)通过观察胚胎EGFP荧光情况和基因组PCR法鉴定转入的g6pd^M1303-1497-EGFP基因的表达和插入情况。

本发明还提供了一种带g6pd1303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型的应用，所述转基因斑马鱼模型用于筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中示踪观察到药物处理过程中红细胞的变化。所述转基因斑马鱼模型是转入1303-1497位点突变G6PD基因的转基因模型，该段基因编码斑马鱼G6PD蛋白序列中435-499位氨基酸序列，与人类G6PD蛋白序列中447-489位氨基酸序列高度保守。人类G6PD蛋白序列中447-489位氨基酸序列为NADP+的结合位点，包含了中国人G6PD缺乏症常见的G1376T、G1388A两个G6PD基因突变位点，该段氨基酸序列的完整性直接影响G6PD结构完整性及功能完整性。

gata-1是原始红系发育中的特异性的转录因子，标记早期红系细胞。在24hpf,斑马鱼的血液循环开始建立时可检测到gata-1-EGFP标记的红细胞随循环流动。48h之后gata-1表达逐渐减少。所以利用gata-1作为驱动突变的g6pd基因的启动子可以使突变型g6pd基因在红细胞中特异性表达。从而实现突变型g6pd基因在红细胞中表达的“可示踪”观察。

本发明通过生物学信息的比对，发现斑马鱼和人的G6PD蛋白同源性高达80％以上。人类G6PD蛋白序列中447-489位氨基酸序列为NADP+的结合位点并包含中国人G6PD突变的常见G1376T，G1388A两个突变位点，该段氨基酸序列的完整性直接影响G6PD结构完整性及功能完整性。对比斑马鱼G6PD蛋白序列中435-499位氨基酸序列与人类G6PD蛋白序列中447-489位氨基酸序列高度保守，随即构建敲除斑马鱼G6PD蛋白质435-499氨基酸序列对应的cDNA序列1303-1497的基因序列的斑马鱼突变型g6pd，通过分子生物学技术将突变型g6pd基因装入特定载体中，利用显微注射技术将目的质粒导入斑马鱼体内，实现显性负性效应，进而建立G6PD缺乏症的斑马鱼模型，从而进一步研究斑马鱼中g6pd的突变对其G6PD酶活性的影响，G6PD的结构及功能的变化导致红细胞受损的详细机制，为人类G6PD缺乏症的详细机制及大规模高通量药物筛选提供基础。

相比于传统的G6PD缺乏症动物模型，本发明具有如下优点：

1、gata-1是原始红系发育中的特异性的转录因子，标记早期红系细胞。在24hpf，斑马鱼的血液循环开始建立时可检测到gata-1-EGFP标记的红细胞随循环流动。利用gata-1作为驱动突变的g6pd基因的启动子可以使突变型g6pd基因在红细胞中特异性表达。

2、gata1同时驱动g6pd与EGFP基因，可实现突变型g6pd基因在红细胞中表达的“可示踪”观察。

3、斑马鱼胚胎与成鱼通体透明，构建的该动物模型可以在显微镜下示踪胚胎和鱼体内荧光标记红细胞在药物诱导下的变化规律，为筛选治疗G6PD缺乏症的药物提供可视的动物模型。

附图说明

图1为gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP转基因斑马鱼胚胎与幼鱼荧光表达情况照片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例一

基因斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-IsceI重组质粒：

将g6pd^M1303-1497-EGFP-PCS²⁺、gata-1-PBSK-Isce>

A.g6pd^M1303-1497-EGFP-PCS²⁺质粒3μL，gata-1-PBSK-Isce>

B.将重组后的gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

1)将1支感受态大肠杆菌悬液，于冰上解冻；

2)将目的连接产物用移液器加入到感受态大肠杆菌悬液中，轻轻吹吸至混匀，于冰上放置30min；

3)将混合后的感受态大肠杆菌悬液置于42℃水浴锅热击90s，迅速于冰上放置90s；

4)加入300μl LB液体培养基，37℃恒温振荡培养45min，转速160rpm；

5)取20μl及80μl培养后的感受态大肠杆菌悬液均匀涂于含Amp抗性的LB固体培养基，培养箱中37℃过夜。

6)选取类圆形的阳性的单菌落，用移液器挑取后混合入含1ul/ml Amp的LB液体培养基中，37℃恒温箱，转速140rpm培养12h以上。

C.重组gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

D.重组gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

用BamHI、EcoRI、XhoI对gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

取gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

(2)目的质粒gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-IsceI导入斑马鱼体内：

A.收集斑马鱼0.75hpf时相即单细胞期的Tuebingen野生型品系斑马鱼胚胎，在体视镜下选取形态完整的胚胎，用egg water清洗干净。将胚胎置于显微注射模具上，将胚胎动物极对准显微注射方向；

B.按以下注射体系将gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

C.将注射gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP-PBSK-Isce>

(3)F1代Tg:gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP转基因品系斑马鱼绿色荧光蛋白表达情况的观察，见图1：

将饲养至性成熟期的F0代Tg:gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP转基因品系斑马鱼与Tuebingen野生型品系斑马鱼交配，收集子代胚胎，以egg>M1303-1497-EGFP转基因品系斑马鱼饲养，同时初步筛选出对应的的F0代Tg:gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP转基因品系斑马鱼。

(4)基因组PCR法鉴定F1代Tg:gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP转基因品系斑马鱼基因组中插入的目的基因：

A.将待筛的F0代Tg:gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP转基因品系斑马鱼与Tuebingen野生型品系斑马鱼交配，收集血液循环可以表达绿色荧光蛋白的子代胚胎，提取基因组DNA：

1)收集血液循环可以表达绿色荧光蛋白的发育至36hpf的子代胚胎，随机选取2枚胚胎转移至1.5ml EPP管中，吸尽egg water，加入100μL Lysis buffer，于PCR仪中，98℃，消化10min；

2)加入proteinK(10mg/ml)10μL，于水浴锅中55℃消化过夜；

3)将消化过夜的胚胎置于PCR仪中，98℃，10min；

4)向EPP管中加入等体积的氯仿，12000rpm离心10min，吸上清至新的1.5mlEPP管中；

5)重复步骤(4)；

6)加入总体积1/10的NaAc，加入等体积同量的异丙醇，上下轻5min,12000rpm离心15min,吸弃上清；

7)加入预先配好的70％无水乙醇.2d.H2O.1mL/tube，750g离心5min；

8)重复步骤(7)；

9)超净工作台中室温下开盖干燥20min；并以One drop测定基因组DNA含量。

B.以所提取的基因组DNA作为模板，按以下扩增体系扩增鉴定子代转基因斑马鱼中g6pd^M1303-1497基因片段：

KOD–Plus 10×Buffer，1.25μL；2mM dNTPs，1.25μL；25mM MgSO4，1μL；50μmol/μlPrimer正向，0.25μL；50μmol/μl Primer反向，0.25μL；

Genomic DNA，5μL；2d.H2O，3.25μL；KOD-Plus(1.0U/μl)，0.25μL。

总体积12.5μL。向PCR管中依次加入上述样品瞬时离心混匀，PCR反应条件如下：

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小，电压100V，时间30min，缓冲液1×TAE，鉴定F1代Tg:gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP转基因品系斑马鱼基因组中扩增出外源性导入的目的突变型g6pd^M1303-1497基因。

实施例二

一种转基因斑马鱼模型的应用，采用实施例1所得转基因斑马鱼模型用于筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中示踪观察到药物处理过程中红细胞的变化。该转基因斑马鱼模型是转入1303-1497位点突变G6PD基因的转基因模型，该段基因编码斑马鱼G6PD蛋白序列中435-499位氨基酸序列，与人类G6PD蛋白序列中447-489位氨基酸序列高度保守。人类G6PD蛋白序列中447-489位氨基酸序列为NADP+的结合位点，包含了中国人G6PD缺乏症常见的G1376T、G1388A两个G6PD基因突变位点，该段氨基酸序列的完整性直接影响G6PD结构完整性及功能完整性。gata1-g6pd^M1303-1497-EGFP转基因斑马鱼胚胎与幼鱼荧光表达情况见图1，斑马鱼胚胎与成鱼通体透明，构建的该动物模型可以在显微镜下示踪胚胎和鱼体内荧光标记红细胞在药物诱导下的变化规律，为筛选治疗G6PD缺乏症的药物提供可视的动物模型。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。