一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法及其试剂盒与应用

摘要

本发明提供一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建两个神经胶质生长因子的病毒表达载体，共转染人少突胶质祖细胞，可高表达该两个神经胶质生长因子，即生长相关因子43和神经胶质生长因子2，发挥两者共同作用促进少突胶质细胞的修复，抑制少突胶质细胞损伤后的增生反应和胶质瘢痕形成，而造成的神经二次损伤；同时也利用了少突胶质祖细胞自身增殖分化能力，参与神经功能的修复，无成瘤性；并提供一种制备该抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的试剂盒。本发明提供的人少突胶质祖细胞将对神经系统疾病有着很好的治疗效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法以及通过所述方法获得抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞，特别地，本发明涉及构建含两个神经胶质生长因子的病毒表达载体，使得人少突胶质祖细胞能稳定表达该两个神经胶质生长因子，共同发挥两者生物学功能；并提供一种制备该抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的试剂盒。本发明提供的人少突胶质祖细胞保持良好的增殖能力，参与神经功能的修复，而无成瘤性，可望用于临床治疗神经系统疾病，促使受损神经细胞的修复。

背景技术

神经系统疾病在缺血、缺氧和损伤等情况下，造成星形胶质细胞损伤后钙离子浓度明显变化，激活细胞内钙离子信号传导并参与星形胶质细胞损伤后的增生反应，星形胶质细胞异常增殖造成了胶质瘢痕的形成，阻碍了损伤神经轴突有效再生和生长，主要为中枢神经损伤性疾病，即外伤性脑损伤、脑出血、脑缺血和脊髓损伤等。

神经损伤早期星形胶质细胞处于成熟早期，可以分泌细胞因子维持和促进神经元功能发挥，并起到神经组织支架的作用；但其成熟以后，早期具有的多种有益功能逐渐消失，反而分泌有害因子，形成化学性胶质屏障，影响神经再生，阻碍轴突延长。位于损伤界面内成熟的星形胶质细胞显示有抑制轴突生长的蛋白聚糖表达，并且在瘢痕组织的形成中起主要的作用。胶质细胞过度增生和胶质瘢痕形成，导致机械性障碍，影响轴突的再生、延长和融合，并且可以形成微血管套，压迫微血管，影响局部的血液供应，这些均对神经细胞造成了二次损伤作用。

本发明申请人意外发现，成体干细胞分泌的神经胶质生长因子在神经二次损伤抑制中发挥了重要的作用，其可以改善机体微环境，促进干细胞和内源性的干细胞修复作用，但是干细胞分泌的神经胶质生长因子是非常有限的，有研究认为实际上干细胞移植治疗，真正发挥作用的是其分泌的神经胶质生长因子。

本发明将构建好的含两个神经胶质生长因子片段，重组到病毒载体上，共转染人少突胶质祖细胞后表达两个神经胶质生长因子，共同发挥两者的生物学功能，而无成瘤性，具有良好的协同效果。人少突胶质祖细胞来源方便，主要包括脐血、胎盘血、骨髓和流产胎脑等，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以使用免疫原性低的异体细胞。因而，本发明表达两个神经胶质生长因子的人少突胶质祖细胞制备简单，高表达两个神经胶质生长因子，抑制星形胶质细胞异常增殖和胶质瘢痕形成，共同创造有利于神经再生的微环境，抑制神经的二次损伤，有望对中枢损伤性疾病产生更佳的治疗效果。

发明内容

近年来干细胞治疗神经系统疾病的临床疗效得到广泛的认可，干细胞移植促进了神经细胞修复及神经再生，改善神经轴突和行为功能恢复。中枢神经损伤性疾病后期因小胶质细胞激活引发了星形胶质细胞成熟和异常增殖，导致胶质瘢痕形成和神经炎症反应，对神经细胞造成了二次损伤。

本发明基于我们前期研究工作基础，利用人少突胶质祖细胞增殖分化和“归巢”的特性，将构建的两个神经胶质生长因子基因片段的重组病毒载体进行转染，可高表达这两个神经胶质生长因子，协同发挥神经胶质生长因子的生物学作用和少突胶质祖细胞本身的功能，可以填充损伤的界面、抑制胶质瘢痕形成、重新排列受体组织和延迟轴突生长抑制因子蛋白聚糖的表达，抑制神经二次损伤。

其中，所述神经胶质生长因子为生长相关因子43(growth-associatedprotein-43，GAP-43)和神经胶质生长因子2(glial growth factor 2，GGF-2)；GAP-43表达上调促进神经元生长，抑制胶质瘢痕形成；GGF-2表达升高有助于神经功能恢复，并改善神经炎症反应，控制对神经细胞的损伤作用。两者协同作用，可以填充损伤的界面、抑制胶质瘢痕形成、重新排列受体组织和延迟轴突生长抑制因子蛋白聚糖的表达，抑制神经二次损伤。

本发明经我们研发工作中发现了神经胶质生长因子慢病毒载体转染的人少突胶质祖细胞(Oligodendrocyte precursor cells，OPCs)，其稳定表达的神经胶质生长因子能抑制神经二次损伤，而且无成瘤活性。这一研究结果提示了我们可以通过该两个神经胶质生长因子构建慢病毒载体转染人少突胶质祖细胞，使得人少突胶质祖细胞经多次传代培养后仍稳定表达该两个神经胶质生长因子，具有发挥其各自生物学功能的能力。在保证了临床治疗使用的细胞数量的同时，也保持了干细胞很强的增殖、分化、归巢活性，可能在临床治疗中枢神经损伤疾病中发挥着更佳的作用。

本发明提供了一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建两个神经胶质生长因子的病毒表达载体上，共转染人少突胶质祖细胞，制备成可高表达该两个神经胶质生长因子的少突胶质祖细胞，抑制胶质细胞增生造成神经二次损伤促进神经损伤修复；其中，所述神经胶质生长因子为生长相关因子43(GAP-43)和神经胶质生长因子2(GGF-2)。

在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了重组GAP-43和GGF-2病毒载体的OPCs传代培养到第10代后，其表达GAP-43和GGF-2基因均高于未转染的第1代OPCs，分别高于至少45和67倍；

脊髓损伤大鼠模型中，GAP43/GGF2病毒共转染的OPCs移植后28天BBB(Basso Beattie Bresnahan)运动功能评分改善值为20.00±5.00，皮层体感诱发电位CSEP波幅改善值6.00±1.00；所述GAP43/GGF2-OPCs在治疗脊髓损伤大鼠中，其抑制星形胶质细胞增殖和胶质瘢痕形成。

本发明所述人少突胶质祖细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，能做到个体化应用。人少突胶质祖细胞来源人废弃脐带血、胎盘血、自体骨髓和流产胎脑等，优选地，来源于人自体骨髓。

本发明所述人少突胶质祖细胞制备方法，即从骨髓经淋巴细胞分离液分离纯化得到的单个核细胞，用无血清少突胶质细胞培养基(即DMEM/F12(1∶1)含1％N2、2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、1-50ng/ml成纤维生长因子4，1-100ng/ml干细胞生长因子和1-100ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体)在10-200μg/ml多聚赖氨酸包被的75cm²细胞培养瓶中原代和传代培养，获得人少突胶质祖细胞；优选地，无血清少突胶质细胞培养基为DMEM/F12(1∶1)含1％N2、2mM>2细胞培养瓶。

人少突胶质祖细胞经流式细胞技术检测，OPCs标志物A2B5、O4和Sox10均表达95％以上。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明提供一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法，其特征在于，将人GAP-43和GGF-2序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，得到了GAP-43和GGF-2目的片段。将该两个目的DNA片段连接到表达质粒上构建成重组质粒后，经阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定后，构建好的质粒可以保存在-80℃超低温冰箱中。再将GAP-43和GGF-2基因片段克隆到慢病载体上，包装成重组GAP-43和GGF-2慢病毒载体，两者共转染人少突胶质祖细胞，制备成GAP43/GGF2慢病毒转染的人少突胶质祖细胞。

转染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，少突胶质祖细胞GFP显色超过90％以上，表明共转染了GAP-43和GGF-2慢病毒转染人少突胶质祖细胞成功，获得持续表达GAP-43和GGF-2的人少突胶质祖细胞；

通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了GAP-43和GGF-2慢病毒转染人少突胶质祖细胞传代培养到第10代后，其表达GAP-43和GGF-2基因分别高于未转染的OPCs 45.89和67.98倍。

本发明所述的抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞，可以体外传代培养，即转染了GAP-43和GGF-2慢病毒载体转染的OPCs通过完全培养液DMEM/F12体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶消化传代；

本发明所述的人少突胶质祖细胞与未转染GAP-43和GGF-2双慢病毒载体的OPCs相比，具有更强的增殖速度，传代培养到第10代其增殖倍数达到500倍以上，并具有分化为少突胶质细胞的能力。

本发明所述的人少突胶质祖细胞传代培养10代后，仍高表达生长相关因子43和神经胶质生长因子2，与未转染GAP-43和GGF-2双慢病毒载体的OPCs相比，均具有相似的星形细胞形态，可以分化少突胶质细胞。

脊髓损伤大鼠模型中，本发明所述的GAP43/GGF2慢病毒共转染的OPCs移植后BBB运动功能评分和皮层体感诱发电位改善明显高于未转染的OPCs，促使了脊髓损伤大鼠的神经功能恢复；神经胶质纤维酸性蛋白免疫组化显示GAP43/GGF2慢病毒共转染的OPCs与未转染的OPCs移植相比，阳性细胞表达数量显著减少，胶质瘢痕范围也明显变小。

体内、体外成瘤实验中未发现成瘤现象，保证了其安全性。

本发明还提供一种制备的抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)人少突胶质祖细胞基础培养基；

2)包装好的生长相关因子43和神经胶质生长因子2高表达病毒；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括上述的方法。

本发明还提供所述抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的应用，保证了体外培养获得足够数量的人少突胶质祖细胞，并具有稳定表达两个神经胶质生长因子，共同发挥其生物学功能，促进神经轴突再生和保护神经的生理功能，而且能够有效诱导新生的星形胶质细胞成线性排列，为神经轴突再生和生长提供理想的通道，调控星形胶质细胞的过度增殖和胶质瘢痕的形成，从而抑制了对神经的二次损伤作用。

附图说明

图1表示为实施例2制备的人少突胶质祖细胞经流式细胞检测流式图

图2表示为重组GAP-43和GGF-2慢病毒在转染OPCs后免疫荧光图

图3表示为第10代重组GAP-43和GGF-2慢病毒共转染OPCs后基因表达水平图

图4表示为第10代重组GAP43/GGF2慢病毒共转染的OPCs分化为少突胶质细胞免疫荧光图

图5表示为脊髓损伤大鼠模型GAP43/GGF2-OPCs移植后GFAP表达与胶质瘢痕改善结果图

具体实施方式

本发明提供了一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建两个神经胶质生长因子的病毒表达载体上，共转染人少突胶质祖细胞，制备成可高表达该两个神经胶质生长因子的少突胶质祖细胞，抑制胶质细胞增生造成神经二次损伤促进神经损伤修复。

本发明所述人少突胶质祖细胞来源方便，可以从人废弃脐带血、胎盘血、自体骨髓和流产胎脑等，优选地，来源于人自体骨髓。

本发明所述人少突胶质祖细胞制备方法，即：取从20ml骨髓经淋巴细胞分离液分离纯化得到的单个核细胞，用无血清少突胶质细胞培养基(即DMEM/F12(1∶1)含1％N2、2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、1-50ng/ml成纤维生长因子4，1-100ng/ml干细胞生长因子和1-100ng/mlFMS样酪氨酸激酶3配体)重悬到2-5×10⁶/ml，吸取10ml加入到10-200μg/ml多聚赖氨酸包被的75cm²细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时。更换新鲜含细胞因子的无血清少突细胞培养基再连续培养，直到细胞生长融合达到90％左右，使用0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.02％EDTA)进行消化，进行传代培养，即1瓶传代2瓶，补充新鲜含细胞因子的无血清少突胶质细胞培养基继续培养，获得人少突胶质祖细胞。

优选地，无血清少突胶质细胞培养基为DMEM/F12(1∶1)含1％N2、2mM L-谷氨酰胺、30ng/ml碱性成纤维生长因子、5ng/ml碱成纤维生长因子4，10ng/ml干细胞生长因子和5ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体；使用50μg/ml多聚赖氨酸包被的75cm²细胞培养瓶。

人少突胶质祖细胞经流式细胞技术检测，OPCs标志物A2B5、O4和Sox10均表达95％以上。

本发明所述的两个神经胶质生长因子的基因片段是通过PCR技术扩增并重组到表达质粒上，然后重组到病毒表达载体上，再包装293T细胞制备成高表达目的基因的病毒。

本发明所述的抑制神经二次损伤的神经胶质生长因子，为生长相关因子43(GAP-43)和神经胶质生长因子2(GGF-2)。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统，均为商业化产品，从商业公司可以购买到。

将人GAP-43和GGF-2序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增获得，GAP-43和GGF-2目的片段分别和XhoI/Nde I双酶切的pET28a载体片段，在T4DNA连接酶作用下，于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合GAP-43和GGF-2大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存；所述GAP-43和GGF-2大小分别约为706bp和1268bp；

分别将GAP-43、GGF-2DNA片段和GV358载体进行XhoI/Nde I双酶切，在T4DNA连接酶作用下，将GAP-43片段和酶切GV358载体以及GGF-2片段和酶切GV358载体分别于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；

取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml>2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h；

根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，包装好的GAP-43和GGF-2慢病毒按照50μl 2E+8TU/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱；

将重组GAP-43和GGF-2慢病毒各10μl lE+7TU/ml加入到人少突胶质祖细胞的10-200μg/ml多聚赖氨酸包被的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液DMEM/F12(1∶1)，所述完全培养液含1％N2、2mM>2培养瓶中生长，1孔对应1个培养瓶，在25cm²培养瓶中融合达到90％时继续消化传代培养；生长转染分为3组：未转染对照组，空白慢病毒转染组，共转染了GAP-43和GGF-2慢病毒转染组；

转染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的发光情况，少突胶质祖细胞GFP显色超过90％以上，表明共转染了GAP-43和GGF-2慢病毒转染人少突胶质祖细胞成功，获得持续表达GAP-43和GGF-2的人少突胶质祖细胞；

通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了GAP-43和GGF-2慢病毒转染人少突胶质祖细胞传代培养到第10代后，其表达GAP-43和GGF-2基因分别高于未转染的OPCs 45.89和67.98倍。

本发明所述的抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞，可以体外传代培养，即转染了GAP-43和GGF-2慢病毒载体转染的OPCs通过完全培养液DMEM/F12体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶消化传代；

本发明所述的人少突胶质祖细胞与未转染GAP-43和GGF-2双慢病毒载体的OPCs相比，具有更强的增殖速度，传代培养到第10代其增殖倍数达到500倍以上，并具有分化为少突胶质细胞的能力。

本发明所述的人少突胶质祖细胞传代培养10代后，仍高表达生长相关因子43和神经胶质生长因子2，与未转染GAP-43和GGF-2双慢病毒载体的OPCs相比，均具有相似的星形细胞形态，可以分化少突胶质细胞。

脊髓损伤大鼠模型中，本发明所述的GAP43/GGF2慢病毒共转染的OPCs移植后BBB运动功能评分和皮层体感诱发电位改善明显高于未转染的OPCs，促使了脊髓损伤大鼠的神经功能恢复；神经胶质纤维酸性蛋白免疫组化显示GAP43/GGF2慢病毒共转染的OPCs与未转染的OPCs移植相比，阳性细胞表达数量显著减少，胶质瘢痕范围也明显变小。

本发明所述的抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞，裸鼠体内皮下注射后，未发现成瘤现象，保证了其安全性，而接种的乳腺癌细胞系MCF-7阳性对照出现了成瘤。

本发明还提供一种制备的抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)人少突胶质祖细胞基础培养基；

2)包装好的生长相关因子43和神经胶质生长因子2高表达病毒；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括上述的方法。

本发明还提供抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的应用，高表达GAP-43和GGF-2的人少突胶质祖细胞可以填充损伤的界面，抑制胶质瘢痕形成，重新排列受体组织和延迟轴突生长抑制因子蛋白聚糖的表达；从而能够非常有效地改善轴突再生的微环境，促进急性脊髓损伤后轴突的生长；抑制神经的二次损伤，即抑制轴突切断后神经元的萎缩和促进行为能力显著地恢复。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1重组GAP-43和GGF-2慢病毒载体的构建和包装

将人GAP-43和GGF-2序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，GAP-43和GGF-2目的片段分别和XhoI/Nde I(日本TAKARA公司)双酶切的pET28a载体(美国Invitrogen公司)片段，在T4DNA连接酶(日本TAKARA公司)作用下，于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a(美国Invitrogen公司)后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；鉴定GAP-43和GGF-2基因片段大小分别约为706bp和1268bp，符合GAP-43和GGF-2大小和序列。将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存。

分别将GAP-43、GGF-2DNA片段和GV358载体(上海吉凯)进行XhoI/Nde I双酶切，在T4DNA连接酶作用下，将GAP-43片段和酶切GV358载体以及GGF-2片段和酶切GV358载体分别于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。

取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞(美国Invitrogen公司)，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml>2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h；

根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，包装好的GAP-43和GGF-2慢病毒按照50μl 2E+8TU/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱；

实施例2人少突胶质祖细胞的制备

采集捐献志愿者20ml骨髓，经淋巴细胞分离液分离纯化得到的单个核细胞，苔盼兰计数为3×10⁷个，用无血清少突胶质细胞培养基(即DMEM/F12(1∶1)(美国Gibco公司)含1％N2、2mM>6/ml，吸取10ml加入到50μg/ml多聚赖氨酸包被的75cm²细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时。

培养48小时后更换新鲜含细胞因子的无血清少突细胞培养基再连续培养，此后间隔2天更换新鲜含细胞因子的无血清少突细胞培养基，直到细胞生长融合达到90％左右，使用0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.02％EDTA)(美国Gibco公司)进行消化，进行传代培养，即1瓶传代2瓶，补充新鲜含细胞因子的无血清少突胶质细胞培养基继续培养，获得人少突胶质祖细胞。

取苔盼兰染色计数后的0.6×10⁶OPC细胞，分三组，第一组分别添加到有20μL鼠抗人A2B5单抗(美国Millipore公司)，二抗羊抗鼠IgM-FITC(美国Invitrogen公司)；20μL鼠抗人O4单抗(美国Millipore公司)，二抗羊抗鼠IgM-PE(美国Invitrogen公司)；第二组分别添加20μL鼠抗人Sox10单抗(美国Millipore公司)，二抗羊抗鼠IgM-FITC(美国Invitrogen公司)；20μL兔抗人GFAP单抗(美国Millipore公司)，二抗羊抗鼠IgG-PE(美国Invitrogen公司)；第三组为同型对照，分别添加到有20μL>

实施例3重组GAP-43和GGF-2慢病毒转染人少突胶质祖细胞的制备

将重组GAP-43和GGF-2慢病毒各10μl 1E+7TU/ml加入到人少突胶质祖细胞的50μg/ml多聚赖氨酸包被的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液DMEM/F12(1∶1)，所述完全培养液含1％N2、2mM>2培养瓶中生长，1孔对应1个培养瓶，在25cm²培养瓶中融合达到90％时继续消化传代培养；生长转染分为3组：未转染对照组，空白慢病毒转染组，共转染了GAP-43和GGF-2慢病毒转染组。

图2为重组GAP-43和GGF-2慢病毒在转染OPCs后免疫荧光图片。重组GAP-43和GGF-2慢病毒载体携带绿色荧光蛋白(GFP)，转染了重组GAP-43和GGF-2慢病毒的OPCs荧光倒置显微镜下呈绿色，表明重组GAP-43和GGF-2慢病毒转染OPCs构建成功。

图3为GAP-43和GGF-2在转染重组GAP-43和GGF-2慢病毒了的第10代OPCs中的表达水平。在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书(美国Invitrogen公司)检测，转染了重组GAP-43和GGF-2慢病毒载体的OPCs传代培养到第10代后，其表达GAP-43和GGF-2基因均高于未转染的第1代OPCs，分别高于45.89和67.98倍。

实施例4制备的抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的试剂盒

抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞试剂盒包括：

1)人少突胶质祖细胞基础培养基，即DMEM/F12(1∶1)；

2)包装好的生长相关因子43和神经胶质生长因子2高表达病毒；

3)消化细胞的酶，0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.02％EDTA)；

4)细胞因子，即1％N2、2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、1-50ng/ml成纤维生长因子4，1-100ng/ml干细胞生长因子和1-100ng/mlFMS样酪氨酸激酶3配体；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括实施例1-3中描述的方法。

实施例5重组GAP43/GGF2慢病毒转染的人少突胶质祖细胞成少突胶质细胞分化

取第10代重组GAP43/GGF2慢病毒转染的OPCs接种到预先置有50μg/ml多聚赖氨酸涂布盖玻片的6孔培养板，待细胞生长至完全融合后诱导液(DMEM/F12(1∶1)含10ng/ml神经营养因子3(美国PeproTech公司)和50ng/mlβ-巯基乙醇(美国Invitrogen公司))，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，去除诱导液，加入分化完全培养液DMEM/F12(1∶1)(含2mM>2培养箱中培养，每隔72h换液1次，培养7天时间。培养7天后用4％多聚甲醛将细胞用固定，进行神经胶质纤维酸性蛋白(glial>

GAP43/GGF2-OPCs经4％冷的多聚甲醛固定15分钟后，避光。吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。0.5％Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。与二抗相同宿主的进口胎羊血清室温封闭30分钟。配制一抗：兔抗人GFAP(美国Millipore公司)用胎羊血清稀释200倍，加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。次日：取出细胞复温至室温约1h。冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。配制荧光标记二抗：PE标记的羊抗兔免疫球蛋白G(Goat anti-rabbitIgG(H&L)TRITC，美国Abcam公司，Ab50598)，用PBS或FBS配制，浓度1∶200。加入二抗，室温孵育1小时(避光)。冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。加入防荧光淬灭封片剂，避光。上机共聚焦免疫荧光显微镜观测、拍照。

图4为第10代重组GAP43/GGF2慢病毒转染的OPCs分化为少突胶质细胞免疫荧光图。图为4倍物镜观察的少突胶质细胞免疫荧光图，图中可以观察到绿色星状的GFAP染色的少突胶质细胞，表明第10代重组GAP43/GGF2慢病毒转染的OPCs可以分化为少突胶质细胞。

实施例6脊髓损伤大鼠模型GAP43/GGF2-OPCs移植体内实验

购自军事医学科学院动物中心的20只实验SD大鼠，以3％戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔注射麻醉大鼠后，俯卧位固定于手术台上，脱毛，消毒，铺巾，以大鼠背部最高处定位T12并正中后路纵形切开，长约1.5cm，向两侧牵开椎旁肌，显露T12棘突及椎板，咬除T12棘突与椎板，形成后方直径4.0mm的骨窗，充分暴露椎管及硬脊膜，深达椎管硬脊膜，用一根重10.0g圆形金属冲击棒(金属冲击棒下端直径约2.5mm，与脊髓直径几乎吻合)，通过内径为4.0mm的中空管，距脊髓7cm高处，使金属杆在中空管指定位置，垂直自由落下，造成脊髓损伤，局部脊髓血肿示打击成功，观察鼠双后肢是否具有应激反射，并在术后行体感诱发电位检测，进一步评估脊髓撞击试验的可信性，撞击失败动物予以剔除。

建立的脊髓损伤大鼠模型随机分为A、B和C三组，每组6只，A组为实施例3制备的重组GAP43/GGF2慢病毒转染的OPCs移植组，B组实施例2制备的OPCs移植组，C组为生理盐水移植组。

脊髓损伤大鼠模型分笼饲养72小时后，A组进行尾静脉移植GAP43/GGF2-OPCs>6/kg，100μl；B组进行尾静脉移植OPCs>6/kg，100μl；C组进行尾静脉注射100μl生理盐水；移植当天、1d、3d、5d、7d、14d、28d对所有大鼠进行Basso>

表1

说明：BBB运动功能评分0-7分评判动物后肢各关节活动；8-13分评判后肢的步态及协调功能；14-21分评判运动中爪的精细动作，三项满分为21分，分值越高损伤越小。

从表1可已看出，移植后3天开始C组与A或B组相比*p值和^#p值均远小于0.05，并且移植后14天开始A组与B组相比p值远小于0.05；A和B组的BBB评分明显高于C组，其中A组的BBB评分明显高于B组，即用于移植脊髓损伤的本发明的GAP43/GGF2慢病毒转染的OPCs具有优异的治疗效果，并且免疫排斥很小，GAP43/GGF2慢病毒转染的OPCs和未转染的OPCs促使了脊髓损伤大鼠的神经功能恢复，其中GAP43/GGF2慢病毒转染的OPCs效果更显著。

实施例7脊髓损伤大鼠模型GAP43/GGF2-OPCs移植皮层体感诱发电位分析

取实施例5的脊髓损伤大鼠模型，经实施例3制备的重组GAP43/GGF2慢病毒转染的OPCs和实施例2制备的OPCs移植后，应用诱发电位仪(上海海神医疗电子仪器有限公司)检测，刺激电极置于胫前肌中部，参考电极置于远侧1cm处，刺激强度为1.5～4mA，波宽0.2mA，频率1.9Hz连续方波刺激叠加20～40次。记录电极置于头顶部中线与冠状缝交点处头皮下，参考电极置于其后方0.5cm处。地线紧贴于生理盐水浸湿的动物尾部。以大鼠后肢出现轻微抽动为准，分别观察大鼠伤前、移植当天、移植后14d及移植后28d时皮层体感诱发电位(cortical somatosensory evoked potentials，CSEP)P1-N1波幅的变化。

表2

从表2中可以发现大鼠脊髓损伤后当天CSEP波幅明显降低。移植后14d，A组的波幅明显上升，与B组和C组相比，差异具有统计学意义(*p＜0.05)。移植后28d，C组CSEP波幅明显上升，且与14d时比较差异有统计学意义(&p＜0.05)；同时A组CSEP波幅较14d时明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，与同期B组和C组相比亦有统计学意义(*p＜0.05)；而且B组移植后14d和28d CSEP波幅明显升高，与同期C组相比亦有统计学意义(#p＜0.05)。表明GAP43/GGF2-OPCs移植脊髓损伤大鼠具有神经功能恢复的作用，并明显好于单纯的OPCs。

实施例8脊髓损伤大鼠模型GAP43/GGF2-OPCs移植胶质瘢痕分析

实施例5中脊髓损伤大鼠模型在OPCs移植28天后，将大鼠断颈处死后立即取出1cm脊髓组织，4％多聚甲醛中固定48小时。石蜡包埋，脊髓组织切片(5μm)，进行免疫组化检测GFAP表达水平。石蜡切片粘附在多聚赖氨酸处理过的玻片上，脱蜡前在室温中放置60分钟。石蜡切片依次二甲苯I，10分钟；二甲苯II，10分钟；无水乙醇，5分钟；95％乙醇，五分钟；75％乙醇，五分钟；50％乙醇，五分钟；去离子水，五分钟。PBS洗3次各5分钟。样品用0.1％胰酶在37℃湿盒中消化30分钟进行抗原修复；弃酶液后用PBS洗3次各5分钟；3％H2O2去离子水处理10分钟，使内源过氧化酶失活。PBS洗3次各5分钟，滴加一抗兔抗鼠GFAP(1∶500)(美国Millipore公司)50μl，4℃过夜后PBS洗3次每次5分钟；滴加碱性磷酸酶标记的抗小鼠二抗(1∶1000)50μl(购买北京中杉公司)，37℃静置1小时；PBS洗3次各5分钟，滴加新鲜配置DAB显色10分钟，在显微镜下掌握染色程度；PBS冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10分钟；脱水、透明、中性树脂封片，显微镜观察拍照。

从图5中我们可以看到C组28d脊髓损伤处损伤节段与A和B组GFAP阳性细胞表达数量更多，阳性细胞胞体更大，突起更粗更长，相互缠结交织成网状，形成致密的胶质瘢痕；A组中GFAP阳性细胞表达数量在28d时与B组和C组比较均明显减少，且GFAP阳性细胞体积变小，突起变少，染色变淡，胶质瘢痕范围变小，表明移植了GAP43/GGF2-OPCs治疗脊髓损伤大鼠抑制星形胶质细胞增殖和胶质瘢痕形成。