一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法

摘要

本发明涉及一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法，本发明是利用重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切和DNA连接等方法将100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp等长度的小的DNA序列构建到一个质粒上。这种质粒经单一的限制性酶完全酶切后，可以酶切出七条亮度均一的条带。本发明用于制备DNA标准参照物，用于在琼脂糖电泳中指示DNA分子量的相对大小。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程领域中的一种不可或缺的电泳耗材，具体涉及一种小的脱氧核糖核酸(DNA)分子量标准物、小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒以及其制备方法。

背景技术

DNA分子量标准物是一种用于指示DNA在琼脂糖电泳中泳动速度相对大小的试剂，是由已知的特定大小的多个DNA片段混合而成的。目前主要的制备方法有PCR扩增方法，质粒酶切方法或者两者相结合的方法。PCR方法是设计引物，用体外PCR扩增的方法获得特定大小的DNA片段，然后通过纯化和定量，再按照一定的质量比混合在一起制备而成。酶切方法是将不同大小的片段克隆在一个或几个质粒中，提取质粒并用限制性酶完全酶切后将这些片段混合在一起。王芳等(王芳等.DNA标准分子量参照物的制备《安徽农业科学》,2009,第15期(15):6903-6903)用PCR方法制备的多个片段混合在一起制备成的分子量标准。PCR方法过程比较麻烦，包括模板制备，引物设计、PCR扩增，PCR产物纯化、PCR产物定量和PCR产物混合。片段越多，整个过程就越复杂。另一个方面，由于多数用于DNA扩增的聚合酶具有核酸外切酶活性，很容易导致扩增片段的降解，PCR扩增的特异性和扩增缓冲液成分、扩增的模板量和引物的使用量等密切相关。一旦一个环节出现问题，PCR产物的非特性扩增，这种非特异性扩增得到的条带对DNA分子量标准会产生干扰作用，导致DNA分子量大小的误判。

酶切方法制备DNA分子量标准物是目前DNA分子量标准物生产的发展趋势。DNA在噬菌体，大肠杆菌等微生物中的体内复制，然后提取DNA，用特定的限制性内切酶进行酶切。涉及的制备步骤只有提取和酶切两步，相对于PCR制备方法简单宜行。早期的酶切分子量标准物制备是通过用一个或两个限制性内切酶对已知序列的DNA进行酶切获得多条不同长度的DNA片段的混合物，如例如Lamda/HindIII分子量标准物。通过提取Lamda噬菌体的DNA,用HindIII限制性内切酶将DNA切成125bp，564bp，2027bp，2322bp，4361bp，6557bp，9416bp和23130bp等八个不同长度的的片段。该类分子量标准物的缺点之一是小片段和大片段的分子量的差异较大导致酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离后DNA条带亮度不均匀。缺点之二是片段长度不是整倍数，不便于记忆。

韦柳静等(韦柳静等.一种新型可用于DNA分子量标准的质粒构建《生物技术》,2004,05期(5):33-35)制备的DNA分子量标准物中含有2000bp，1500bp，1000bp,750bp,500bp和250bp 等六个片段，在片段长度上实现了整倍数，但是每个片段只有一个拷贝，2000bp和250bp片段长度相差八倍，亮度相差八倍，在凝胶电泳上指示效果不均一，而且这个分子量标准物中没有100bp片段。同样，王文华等(王文华等.一种简便的DNA定量分子量标准的制备《生物技术》,2010,第3期(3):62-64)通过定点突变制备的含有由100bp，200bp，400bp，800bp和1200bp等5个片段的分子量标准物也存在片段在凝胶中亮度不均一的现象。这个分子量标准物中1200bp片段的分子量为100bp片段的12倍，当100bp片段为10ng时，1200bp片段为120ng，电泳后观察到100bp片段亮度过弱，而1200bp片段亮度过强。James等(James.et al.genetic reagents for generating plasmids containing multiple copies of DNA segments.US Patent 4，403，036)发明的一个123bp小分子的DNA标准通过不完全酶切获得，组成的DNA条带是123bp长度的整倍数，但是该分子量标准物保留了2800bp长度大小的载体DNA，电泳效果中感觉2800bp条带非常强，与最小的123bp条带亮度反差特别大。这个分子量标准物是通过不完全酶切的方法制备的。不完全酶切的时间不易控制，一旦酶切时间够长，那么会缺少多个条带，不同批次的质粒用不同批次的酶酶切的时间是限制生产量和提高质量的关键。小分子的DNA分子量标准物质粒更不容易构建。

总之，越来越多的生物技术和基因工程实验及研究中需要使用PCR技术。PCR扩增产物通常是通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测的，为了判定扩增产物的大小，通常为使用DNA分子量标准物作为电泳的参照物。不同的DNA分子量标准物广泛地应用于凝胶电泳中。

目前小分子DNA标准物通常为PCR产物混合物，稳定性不好，目前的小分子DNA标准存在的问题。PCR方法过程比较麻烦，包括模板制备，引物设计、PCR扩增，PCR产物纯化、PCR产物定量和PCR产物混合。片段越多，整个过程就越复杂。而且保存过程中容易降解。其它的酶切分子量标准物，由于克隆的片段较为单一，每种片段均为一个拷贝，电泳后，条带的亮度有弱有强，亮度不均一。这些分子量标准物在生产制备和使用过程中都会产生很多的问题。

然而，鉴定性质的PCR扩增的PCR产物长度通常在100-600bp之间，需求量大。但由于DNA片段太小，市场上商品化的小于700bp大小的质粒酶切小分子DNA分子量标准很少见，未见将所有的7个片段构建在单一质粒上的分子量标准物。这种质粒的构建方法在国际国内的专业杂志及专利中未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法，其克服了背景技术中提到的现有技术中的不足。本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物，所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物为若干长短不同的小的脱氧核糖核酸序列，其均为不大于1000bp的片段，且所述小的脱氧核糖核酸序列均构建于同一个载体上。一般而言，所述序列或片段至少为7个片段，所述片段均为100bp片段的整数倍。

进一步地，所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物为小的脱氧核糖核酸序列，所述小的脱氧核糖核酸序列包括100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp的片段，所述小的脱氧核糖核酸序列均构建于同一个载体上。更进一步地，所述小的脱氧核糖核酸序列包括十个100bp、三个200bp、两个300bp、两个400bp、一个500bp、一个600bp以及一个700bp的片段。

进一步地，所述小的脱氧核糖核酸序列还可包括800bp或/和900bp等长度的片段。

进一步地，所述小的脱氧核糖核酸序列(即小的脱氧核糖核酸分子量标准物)是通过重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切法和脱氧核糖核酸连接法构建至一个所述载体上。该载体优选质粒，更优选为质粒PUC19。

一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒，该质粒为首尾连接的环状结构，所述质粒包括质粒骨架和小的脱氧核糖核酸序列，在所述小的脱氧核糖核酸序列内部设有酶切位点；所述小的脱氧核糖核酸序列包括100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp的片段；所述酶切位点包括EcoRI、BamH I、HindⅢ、SalI以及XbaI。进一步优选地，所述小的脱氧核糖核酸序列包括十个100bp、三个200bp、两个300bp、两个400bp、一个500bp、一个600bp以及一个700bp的片段，所述小的脱氧核糖核酸序列是通过重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切法和脱氧核糖核酸连接法构建至一个质粒骨架上；

进一步地，上述酶切位点还包括Xho I以及Bgl II，所述XhoI和SalI为同尾酶，BglII和BamHI为同尾酶。所述小的脱氧核糖核酸序列还能够包括700bp以上的片段，优选800bp或同时包括800bp和900bp，这些片段能够通过同尾酶进行添加，当然还能够不断添加其他 片段。

进一步地，所述小的脱氧核糖核酸序列以及酶切位点的连接顺序依次为：BamHI-EcoRI-200bp-EcoRI-400bp-EcoRI-BamHI-XbaI-BglII-EcoRI-300bp-EcoRI-300bp-EcoRI-XbaI-HindⅢ-XhoI-EcoRI-200bp-EcoRI-200bp-EcoRI-HindⅢ-500bp-EcoRI-600bp-EcoRI-400bp-EcoRI-700bp–SalI-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp–EcoRI-100bp–EcoRI-100bp–EcoRI-100bp–EcoRI-100bp-SalI，成为环状结构，即为小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒，该标准物质粒能够进行完全酶切。

一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物的制备方法，所述方法包括分子量标准物质粒的构建、M1E质粒DNA纯化以及M1E质粒DNA酶切。所述分子量标准物质粒的构建方法如下：

S1：M1A的构建：A.设计PCR引物，以pUC19为模板，在高保真酶Pfu DNA聚合酶作用下，分别扩增出500bp、600bp、400bp和700bp的DNA条带；B.然后加入两端引物，通过重叠PCR的方法将扩增出的400bp、700bp、600bp和500bp四个片段拼接在一起，成为DNA长片段；C.并在DNA长片段两端引入BamHI酶切位点；D.以质粒为骨架，采用BamHI酶切后将DNA长片段连接在骨架质粒上，得到的质粒为M1A；则M1A含有1个400bp片段，1个500bp片段，1个600bp片段和1个700bp片段。

S2：M1B质粒的构建：A.以克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的一个细菌人工染色体DNA为模板，该模板的DNA序列中只有一个EcoRI酶切位点，且所述EcoRI酶切位点的两侧1000bp长度内无BamHI、HindIII、SalI和XbaI等酶切位点；B.设计引物进行PCR扩增，扩增一400bp长度的DNA片段，所述引物的5’端带有HindIII和EcoRI酶切位点，HindIII在EcoRI酶切位点的外侧；所述400bp长度的DNA片段经EcoRI单酶切后获得两个大小一致但序列完全不同的200bp的片段；C.扩增后获得的400bp长度的DNA片段用HindIII单酶切，同时用HindIII单酶切M1A质粒，片段和载体连接后获得一个插入了2个200bp片段的质粒M1B；则M1B含有2个200bp片段，1个400bp片段，1个500bp片段，1个600bp片段和1个700bp片段。

S3：M1C质粒的构建：A.同样以克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的一个细菌人工染色体DNA为扩增区域，设计一对引物，该引物的5’端包含BamHI和EcoRI位点，BamHI在EcoRI酶切位点的外侧；B.根据引物进行PCR扩增，扩增后获得长度为600bp的PCR产物，该PCR产物经EcoRI单酶切后获得一个200bp长度的片段和一个400bp长度的片段；C.获得的PCR产物用BamHI单酶切，同时用BamHI单酶切M1B质粒，片段和载体连接，获得一个插入了1个200bp片段和一个400bp片段的质粒，即为M1C，该M1C含有3个200bp片段，2个400bp片段，1个500bp片段，1个600bp片段和1个700bp片段。

S4：M1D质粒的构建：A.同样以克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的一个细菌人工染色体DNA为扩增区域，设计一对引物，该引物的5’端包含有XbaI和EcoRI位点，XbaI在EcoRI酶切位点的外侧，根据引物进行PCR扩增；B.扩增后获得长度为600bp左右的PCR产物，但是经EcoRI单酶切后获得两个大小一致但序列完全不同的300bp的片段；C.获得的PCR产物用XbaI单酶切，同时用XbaI单酶切M1C质粒，片段和载体连接，获得一个插入了2个300bp片段，即为M1D，则M1D含有3个200bp片段，2个30 0bp片段，2个400bp片段，1个500bp片段，1个600bp片段和1个700bp片段。

S5：M1E质粒的构建，包括步骤A～D，如下：

A.pUC18Ava质粒构建：①合序列ESASHF和ESASHR，

ESASHF为5-AATTCGTCGACCTCGGGGTCGACA-3，

ESASHR为5-TCGAACAGCTGGGGCTCCAGCTGC-3；

合成后进行退火，退火后获得两端带EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)粘末端的片段，同时引进了一个Ava I(CTCGGG)酶切位点以及在其两侧各有一个SalI(GTCGAC)酶切位点；②用EcoR I和Hind III双酶切pUC18质粒，获得线性化的带有EcoR I和Hind III粘末端的载体；③将步骤①中退火后的片段与步骤②中线性化的载体连接，得到pUC18Ava质粒，备用；

B.AvaE100片段的获得：①合成引物，并在上游引物中引入AvaI和EcoRI酶切位点，下游引物中只引入AvaI酶切位点，然后再以Pfu聚合酶基因为模板进行PCR扩增，得PCR产物，即为AvaE100片段，其为有100bp长度的DNA片段；

C.克隆10个AvaE100重复序列的质粒的获得:①单个AvaE100用AvaI单酶切，电泳，回收特异性的100bp长度的片段；②建立连接体系，将片段进行连接，回收1000bp长度大小的片段，即为AvaE100重复片段；③测序准确的pUC18Ava质粒用AvaI充分酶切，然后进行去磷酸化，获得AvaI线性化的，去磷酸化的pUC18Ava质粒；④将步骤②中回收的长度为1000bp的AvaE100重复片段和步骤③中AvaI线性化的、去磷酸化的pUC18Ava质粒进行连接；获得插入10个AvaE100的克隆在pUC18Ava质粒上的质粒，AvaE100片段头尾相连；

D.M1E质粒构建：利用pUC18Ava中的SalI酶切位点将AvaE100重复片段克隆到有SalI酶切位点的M1D质粒中，获得一个插入了10个100bp片段，即为M1E，所述M1E含有10个100bp片段，3个200bp片段，2个300bp片段，2个400bp片段，1个500bp片段，1个600bp片段和1个700bp片段。

所述M1E质粒能够进行完全酶切获得小的脱氧核糖核酸分子量标准物。

进一步地，步骤S1中：所述M1A质粒中包含大肠杆菌DNA复制起始子和氨苄青霉素抗性基因；在所述M1A质粒中的DNA长片段连接内部引入3个EcoRI的限制性内切酶切位点，可以将质粒最终切成400bp，700bp，600bp和500bp的DNA条带；在质粒BamHI酶切位点两侧引入XbaI、HindIII和SalII酶切位点(一侧引入SalII酶切位点，另一侧引入XbaI和HindIII酶切位点)以插入其它长度的片段。

进一步地，步骤S1中，所述PCR引物为四对引物，分别为7F1和7R2引物对，7F2和7R3引物，7F3和7R4引物对，7F4和7R5引物对，该引物序列如下所示；根据四对引物获得预期长度的4个特异性扩增的DNA片段后(分别为500bp、600bp、400bp和700bp)，切胶回收纯化定量，加入回收的4个DNA片断，然后加入两端7F1和7R5引物对作为两端引物，通过重叠PCR方法将这4个片段拼接在一起。PCR产物用BamHI酶切，在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经鉴定获得符合预期要求的质粒。

7F1 5-GTCGGATCCTCTAGAAGCTTCCCTTTCGCCAGCTGGCG-3

7F2 5-GATAAATGCTTCAAGAATTCTGAAAAAGGAAG-3

7R2 5-CTTCCTTTTTCAGAATTCTTGAAGCATTTATC-3

7F3 5-CTATTAACTGGCGAATTCCTTACTCTAGCTTC-3

7R3 5-GAAGCTAGAGTAAGGAATTCGCCAGTTAATAG-3

7F4 5-CCCTTAACGTGAGAATTCGTTCCACTGAGC-3

7R4 5-GCTCAGTGGAACGAATTCTCACGTTAAGGG-3

7R5 5-GTCGGATCCCGAGTCGACAGAACATGTGAGCAAAAGG-3

进一步地，步骤S2所设计的引物序列如下，在该引物的上游引物中引入了一个Xho I(CTCGAG)酶切位点，用于后续片段的克隆。

H200EU:5-GTCAAGCTTCTCGAGAATTCTCGATATGGTTATTAATACATA-3

H200ED:5-GTCAAGCTTGAATTCCTGCCTTCTTTGCCAATCA-3

进一步地，步骤S3中所述的引物序列为：

B200EU：5-GTCGGATCCGAATTCTCGATATGGTTA-3

B400ED：5-TCGGGATCCGAATTCGAGCTCCGGCGG-3

进一步地，步骤S4的引物序列如下，在该引物的上游引物中引入一个Bgl II(AGATCT)酶切位点，用于后续片段的克隆。

X300EU:GATCTCTAGATCTGAATTCGATGAAGATATGCG

X300ED:GATCTCTAGAGAATTCACACCAGCACCGCTCTC

进一步地，步骤Step2、Step3和Step4中所选的扩增区域或扩增模板中的EcoRI酶切位点的两侧1000bp长度内无BamHI、HindIII、SalI和XbaI等酶切位点。

进一步地，步骤S5的B中所述引物的序列如下：

AE100U：5-TGAACTCGGGAAAGAATTCCTTC-3

AE100D：5-AGTACCCGAGACTCTACAAGGTTCCCTGTG-3

根据该引物得到所述PCR产物即为AvaE100，AvaE100序列如下：

CTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGG

本发明提供了一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法，其主要具有的有益效果如下：

①本发明的分子量标准物均为小的脱氧核糖核酸片段，重点构建不大于1000bp的小的片段，满足市场对于小的DNA片段的大量需求；且所有DNA片段为100bp的整倍数，DNA条带明确易记。

②本发明组成标准物的DNA片段分子量比较小，且实现了将十个100bp片段，三个200bp片段，两个300bp片段，两个400bp片段，一个500bp，一个600bp和一个700bp等七个小分子DNA片段构建到同一个质粒中，满足市场对于100-600bp之间DNA片段的极大需求。 此外，同尾酶的引入可以在这个分子量标准物质粒中不断插入不同长度的DNA片段，例如，能够插入800bp、900bp等等，使得本发明能够获得其它片段类型的分子量标准物，质粒具有可持续性增加其它片段的特点。

③所有的DNA片段都构建在一个质粒上，同类分子量标准物都只是PCR产物的混合物

④本发明的分子量标准物可以进行完全酶切后获得的七个片段之间的亮度差异在两倍以内，在琼脂糖凝胶电泳中显示的DNA条带亮度均匀，条带锐利。

⑤本发明的方法容易实现，DNA分子量标准物质粒易于构建，且稳定性好，不容易降解，通过本方法构建完成便可进行反复的拷贝，易于大规模标准化生产，满足市场对于小的DNA片段的需求。

⑥本发明的DNA分子量标准物通过重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切法和脱氧核糖核酸连接法构建至同一个载体上，方法简单，且克服了其他方法的不足。

⑦本发明的DNA分子量标准物质粒能够进行酶切完全，酶切时间易于控制，且结果可按预期得到不同的DNA片段，使用非常方便，使用过程中同样具有极好的稳定性，不容易降解。

⑧本发明的分子量标准物的特点使得其可极好的应用于琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳中，作为DNA标准参照物指示DNA分子量的相对大小。

综上，本发明的产品和方法具有极其重要的应用价值。

附图说明

下面根据附图对本发明作进一步详细说明。

图1是本发明实施例所述的分子量标准物质粒的构建流程图；

图2是本发明实施例所述的MarkerI琼脂糖电泳图。

具体实施方式

本发明涉及到的概念的解释如下，需要说明的是，提供以下定义是为了更好的界定本发明或指导本发明的一般技术人员，除非另外说明，否则术语应该按照相关技术领域的一般技术人员的常规用法来理解。还要说明的是，以下术语仅用来更好的理解本发明而不用于限定本发明。

1.脱氧核糖核酸：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，缩写为DNA)又称去氧核糖核酸，由脱氧核糖核苷酸组成。每一种脱氧核糖核苷酸由三个部分所组成：一分子含氮碱基， 一分子五碳糖(脱氧核糖)，一分子磷酸根。核酸的含氮碱基又可分为四类：腺嘌呤(adenine，缩写为A)，胸腺嘧啶(thy分钟e，缩写为T)，胞嘧啶(cytosine，缩写为C)和鸟嘌呤(guanine，缩写为G)。DNA的四种含氮碱基组成具有物种特异性。即四种含氮碱基的比例在同物种不同个体间是一致的，但在不同物种间则有差异。DNA的四种含氮碱基比例具有规律性，每一种生物体DNA中A＝T，C＝G，即碱基互补配对原则。DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’，5’磷酸二酯键相连构成的长链。大多数DNA为双链，也有的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体M13等。DNA有环形DNA和线状DNA之分。质粒DNA环形DNA。人基因组DNA为线状DNA。

2.限制性内切酶：限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶蛋白，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。本篇中叙述的内切酶主要为Ⅱ型限制性内切酶。Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、HindⅡ、HindⅢ等。其分子量小于105道尔顿；反应需要Mg²⁺；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧(如EcoR>

EcoR I的切割位点如下：

5'-G^AATTC-3'

3'-CTTAA^G-5'

BamH I的切割位点如下：

5'-G^GATCC-3'

3'-CCTAG^G-5'

Bgl II的切割位点如下：

5'-A^GATCT-3'

3'-TCTAG^A-5'

Sal I的切割位点如下：

5'-G^TCGAC-3'

3'-CAGCT^G-5'

Xho I的切割位点如下：

5'-T^CTAGA-3'

3'-AGATCT^G-5'

另一些Ⅱ类酶如Alu I、EcoR V、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端，如下所示：

Alu I的切割位点如下：

5'-A G^C T-3'

3'-T C^G A-5'

SmaI的切割位点如下：

5'-CCC^GGG-3'

3'-GGG^CCC-5'

也有的酶识别不同的序列，切割后产生相同的粘末端。如BamHI这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的DNA片断与原来的限制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的限制性内切酶所识别。如：

BamH I的切割位点如下：

5'-G^GATCC-3'

3'-CCTAG^G-5'

Bgl II的切割位点如下：

5'-A^GATCT-3'

3'-TCTAG^A-5'

两种酶识别不同的序列，但是酶切后产生了相同的粘末端。在T4DNA连接酶的作用下，可以连接在一起。连接后，酶切位点消失，两种酶都不能识别。

3、质粒

质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。质粒上具抗生素抗性基因可供作转化子的选择记号。质粒的大小用碱基对表示。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点。不同的限制性内切酶可以识别特异性的DNA序列。质粒用单一内切酶酶切可以切出一条

4、碱基对

形成DNA编码遗传信息的化学结构。组成碱基对的碱基包括A—腺嘌呤、G—鸟嘌呤、T—胸腺嘧啶、C—胞嘧啶。碱基对是一对相互匹配的碱基(即A—T，G—C相互作用)被氢键连接起来。通常被用来衡量DNA长度。碱基对简称bp(Base Pair，bp)对于双链核酸。kb指千碱基。

5、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖一种线性多糖聚合物,系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在pH值大于8.0的电泳缓冲液中，带负电荷的DNA在电场作用下向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：

(1)琼脂糖浓度：一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5％，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7％,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0％。

(2)DNA的分子大小：线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

(3)DNA分子的构象：DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而开环双链DNA移动最慢。

(4)电源电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段有效分离所加电压不得超过5V/cm。

(5)嵌入染料的存在：荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间会使线状DNA迁移率降低。

6、细菌转化

指某一受体细菌通过直接吸收来自另一供体细菌的含有特定基因的脱氧核糖核酸(DNA)片段，从而获得了供体细菌的相应遗传性状，这种现象称为细菌转化。自然界的转化现象，一般发生在同一物种或近缘物种中。细菌转化方法已被引入其他生物，例如采用原 生质体转化法，可将外源DNA注入到不具摄取DNA能力的生物中，使其获得某些新的特性。质粒转化是通过制备大肠杆菌感受态细胞，将质粒DNA转入到大肠杆菌细胞内，使得质粒在大肠杆菌细胞内进行大量扩增。

下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物，所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物为小的脱氧核糖核酸序列，所述小的脱氧核糖核酸序列为1个或2个或3个或4个或5个或6个或7个或8个或9个或10个100bp的片段、1个或2个或3个200bp的片段、1个或2个300bp的片段、1个或2个400bp的片段、1个500bp的片段、1个600bp的片段以及1个700bp的片段，以上所有小的片段或小的脱氧核糖核酸序列均构建于同一个载体上。

实施例2

一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物，所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物为小的脱氧核糖核酸序列，所述小的脱氧核糖核酸序列为1个或2个或3个或4个或5个或6个或7个或8个或9个或10个100bp的片段、1个或2个或3个200bp的片段、1个或2个300bp的片段、1个或2个400bp的片段、1个500bp的片段、1个600bp的片段、1个700bp的片段以及1个800bp的片段，以上所有小的片段或小的脱氧核糖核酸序列均构建于同一个载体上。

实施例3

一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物，所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物为小的脱氧核糖核酸序列，所述小的脱氧核糖核酸序列为1个或2个或3个或4个或5个或6个或7个或8个或9个或10个100bp的片段、1个或2个或3个200bp的片段、1个或2个300bp的片段、1个或2个400bp的片段、1个500bp的片段、1个600bp的片段、1个700bp的片段、1个800bp的片段以及1个900bp的片段，以上所有小的片段或小的脱氧核糖核酸序列均构建于同一个载体上。

进一步优选的实施方式，实施例1～3所述载体为质粒，更优选为质粒PUC19。

实施例4

一种载有小的脱氧核糖核酸分子量标准物的质粒，该质粒为首尾连接的环状结构，所述质粒包括质粒骨架和小的脱氧核糖核酸序列，在所述小的脱氧核糖核酸序列内部设有酶切位点。所述小的脱氧核糖核酸序列包括以下片段：①100bp的片段的数量为1个或2个或3个 或4个或5个或6个或7个或8个或9个或10个；②200bp的片段的数量为1个或2个或3个；③300bp的片段的数量为1个或2个；④400bp的片段的数量为1个或2个；⑤500bp、600bp和700bp的片段数量均为1个；⑥800bp的片段为0个或1个。所述酶切位点包括EcoRI、BamH I、HindⅢ、SalI以及XbaI。

实施例5

一种载有小的脱氧核糖核酸分子量标准物的质粒，该质粒为首尾连接的环状结构，所述质粒包括质粒骨架和小的脱氧核糖核酸序列，在所述小的脱氧核糖核酸序列内部设有酶切位点；所述酶切位点包括EcoRI、BamH I、HindⅢ、SalI、XbaI、Xho I以及Bgl II；所述小的脱氧核糖核酸序列包括以下片段：①100bp的片段的数量为1个或2个或3个或4个或5个或6个或7个或8个或9个或10个；②200bp的片段的数量为1个或2个或3个；③300bp的片段的数量为1个或2个；④400bp的片段的数量为1个或2个；⑤500bp、600bp和700bp的片段数量均为1个。

所述小的脱氧核糖核酸序列以及酶切位点的连接顺序依次为：BamHI-EcoRI-200bp-EcoRI-400bp-EcoRI-BamHI-XbaI-BglII-EcoRI-300bp-EcoRI-300bp-EcoRI-XbaI-HindⅢ-XhoI-EcoRI-200bp-EcoRI-200bp-EcoRI-HindⅢ-500bp-EcoRI-600bp-EcoRI-400bp-EcoRI-700bp–SalI-EcoRI-100bp–EcoRI-100bp–EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp–EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-SalI，，该序列首位的BamHI和末端的SalI连接，成为环状结构，具体见图1中制备好的分子量标准物质粒。

进一步优选的实施方式，实施例5～6所述的载有小的脱氧核糖核酸分子量标准物的质粒(即小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒)能够进行完全酶切，很容易便能得到预期的不同类型的小的DNA片段。

实施例6

实施例1～6中的小的脱氧核糖核酸分子量标准物(即所述小的脱氧核糖核酸序列)是通过重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切法和脱氧核糖核酸连接法构建至一个载体上的。

实施例7

分子量标准物质粒的构建，参见图1，图1给出了分子量标准物质粒的构建流程以及不同DNA片段构建次序、添加位点和排列顺序；图1中酶切位点的简写如下：E:EcoR I,H:Hind III,X:Xba I,B:BamH I,S:Sal I,Xh:Xho I,Bg:Bgl II。

1、骨架质粒M1A的构建

以质粒PUC19为骨架，设计四对PCR引物(如下所示其序列)，然后以10ng的pUC19为模板，在高保真酶Pfu DNA聚合酶作用下，采用7F1和7R2引物对、7F2和7R3引物对、7F3和7R4引物对、7F4和7R5引物对分别扩增4个PCR产物，即500bp、600bp、400bp和700bp的DNA条带，扩增条件94℃预变性2分钟，然后扩增35个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒,72℃变性30秒72℃后延伸10分钟。

然后加入两端7F1和7R5引物对，通过重叠PCR方法将上述4个片段(即500bp、600bp、400bp和700bp的DNA条带)拼接在一起，得到一个2227bp长度的DNA片段，在该DNA片段的两端设计了BamHI酶切位点，并用BamHI酶切该DNA片段，使其插入至质粒PUC19中，即为M1A质粒，其序列如下所示；具体地，在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经鉴定获得符合预期要求的质粒。

所述M1A质粒满足条件为：(1)质粒中包含大肠杆菌DNA复制起始子和氨苄青霉素抗性基因：(2)在插入的这个DNA片段的内部引入3个EcoRI的限制性内切酶切位点,通过特异性的酶切，可以将质粒最终切成400bp，700bp，600bp和500bp的DNA条带；(1)中引入的3个EcoRI酶切位点不影响质粒的自我复制和氨苄抗性基因的表达。(3)在M1A质粒的BamHI酶切位点左右引入XbaI、HindIII、SalII等3个酶切位点以插入其它长度的片段，优选地，SalII酶切位点位于BamHI酶切位点的左侧，XbaI和HindIII酶切位点位于BamHI酶切位点的右侧，此处左右以附图所示的方向为标准。

上述的四对PCR引物序列如下：

7F1 5-GTCGGATCCTCTAGAAGCTTCCCTTTCGCCAGCTGGCG-3

7F2 5-GATAAATGCTTCAAGAATTCTGAAAAAGGAAG-3

7R2 5-CTTCCTTTTTCAGAATTCTTGAAGCATTTATC-3

7F3 5-CTATTAACTGGCGAATTCCTTACTCTAGCTTC-3

7R3 5-GAAGCTAGAGTAAGGAATTCGCCAGTTAATAG-3

7F4 5-CCCTTAACGTGAGAATTCGTTCCACTGAGC-3

7R4 5-GCTCAGTGGAACGAATTCTCACGTTAAGGG-3

7R5 5-GTCGGATCCCGAGTCGACAGAACATGTGAGCAAAAGG-3

M1A质粒的序列见下：

GGATCCTCTAGAAGCTTCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCA AATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAAGAATTCTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAATTCCTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGAATTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTGTCGAC

2、M1B质粒构建流程

以克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的一个细菌人工染色体DNA为模板，设计引物H200EU和H200ED，进行PCR扩增得到PCR产物，该产物为400bp长度的DNA片段，但是经EcoRI单酶切后获得两个大小一致但序列完全不同的200bp的片段。引物的5’端带有HindIII(AAGCTT)和EcoRI(GAATTC)酶切位点，HindIII在EcoRI酶切位点的外侧。

在该引物的上游引物中可优选引入一个XhoI(CTCGAG)酶切位点，用于后续片段的克隆(当然，也可不引入)。

选择上述克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的一个细菌人工染色体DNA为PCR扩增区域必须符合两个条件，其一选定的DNA序列中只有一个EcoRI酶切位点；其二在这个EcoRI酶切位点的两侧1000bp长度内无BamHI、HindIII、SalI和XbaI等酶切位点，这样是扩增出 来的特定片段一次PCR扩增产物经EcoRI酶切后就可以获得两片段，增加了克隆效率，并且保证其它的酶切位点可以使用。

采用上述引物扩增后获得400bp长度的DNA片段用HindIII单酶切，同时用HindIII单酶切M1A质粒，片段和载体连接获得了一个插入了2个200bp片段的质粒，命名为M1B，这个质粒的特点是含有2个200bp片段，1个400bp片段，1个500bp片段，1个600bp片段和1个700bp片段。

引物序列为：

H200EU：5-GTCAAGCTTCTCGAGAATTCTCGATATGGTTATTAATACATA-3

H200ED：5-GTCAAGCTTGAATTCCTGCCTTCTTTGCCAATCA-3

扩增后得到的含有400bp长度的DNA片段的序列为：

AAGCTTCTCGAGAATTCTCGATATGGTTATTAATACATATGTAATATTTATCAAGATTTTTTTTTTGATTATATACCCAGAAATTGGGATTGCTGGATTATATGGGATTGTTTTTTCATTTCCTCCGGCCAGGCCTGACAGGTGGACCCACTTAGCCACCAGAGAGTAGGAAATAGAAGTGGAGTTATCACTGTGTGGCTCCTTTTAGTCAGAATTCATAAGCTGAGGTTGGAAAAGAACTTGAAAAAAAATTGGGTTTCCATTCATAAAGAGTGAGCTTCGTGAGTCTTGGGCGCTAAGTCGGCAGCCGTCCTACTGCTTGCCCCTCTGTCTTTTCAGGGCTGAGGAGGTTCCTCTGAAAATCCTGGCCCACAATGGCTTCGTTGGAAGACTGATTGGCAAAGAAGGCAGGAATTCAAGCTT

3、M1C质粒构建流程

同样用该段区段(即克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的一个细菌人工染色体DNA)为扩增区域设计一对引物B200EU和B400ED，如下所示，该引物包含有BamHI(GGATCC)和EcoRI(GAATTC)位点的，设计引物进行PCR扩增。引物的5’端带有BamHI和EcoRI酶切位点。BamHI在EcoRI酶切位点的外侧。扩增后获得长度为600bp的PCR产物(如下所示)，该PCR产物经EcoRI单酶切后可获得一个200bp长度的片段和一个400bp长度的片段。

获得的PCR产物用BamHI单酶切，同时用BamHI单酶切M1B质粒，片段和载体连接，获得一个插入了1个200bp片段和一个400bp片段的质粒，命名为M1C质粒，该M1C质粒的特点是含有3个200bp片段，2个400bp片段，1个500bp片段，1个600bp片段和1个700bp片段。

以上所述的引物序列为：

B200EU：5-GTCGGATCCGAATTCTCGATATGGTTA-3

B400ED：5-TCGGGATCCGAATTCGAGCTCCGGCGG-3

扩增后得到的含有600bp长度的PCR产物序列：

GGATCCGAATTCTCGATATGGTTATTAATACATATGTAATATTTATCAAGATTTTTTTTTTGATTATATACCCAGAAATTGGGATTGCTGGATTATATGGGATTGTTTTTTCATT TCCTCCGGCCAGGCCTGACAGGTGGACCCACTTAGCCACCAGAGAGTAGGAAATAGAAGTGGAGTTATCACTGTGTGGCTCCTTTTAGTCAGAATTCATAAGCTGAGGTTGGAAAAGAACTTGAAAAAAAATTGGGTTTCCATTCATAAAGAGTGAGCTTCGTGAGTCTTGGGCGCTAAGTCGGCAGCCGTCCTACTGCTTGCCCCTCTGTCTTTTCAGGGCTGAGGAGGTTCCTCTGAAAATCCTGGCCCACAATGGCTTCGTTGGAAGACTGATTGGCAAAGAAGGCAGAAACCTGAAGAAAATAGAACATGAGACAGGGACCAAGATAACCATCTCATCGTAAGCTACCCCTTCTGACTGACTGTGCAGGAGAGAGCGGTGCTGGTGTTCCTGTCTCCTGCTTGTCTTCAGAGGGGAATACACTCAGCTGTACCCTGAGCATCATGGGAAGCAGAGCCACAGTGTAGCCACATAGCCCGCCGGAGCTCGAATTCGGATCC

4、M1D质粒构建流程

同样用该段区段即克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的一个细菌人工染色体DNA)为扩增区域设计一对引物X300EU和X300ED，包含有XbaI(5'T^CTAGA 3')和EcoRI酶切位点，XbaI在EcoRI酶切位点的外侧。

在该引物的上游引物中可优选引入一个Bgl II(AGATCT)酶切位点，用于后续片段的克隆(当然，也可不引入)。

根据所述引物进行PCR扩增，扩增后获得长度为600bp左右的PCR产物，该产物经EcoRI单酶切后获得两个大小一致但序列完全不同的300bp的片段。获得的PCR产物用XbaI单酶切，同时用XbaI单酶切M1C质粒，片段和载体连接，获得一个插入了2个300bp片段，命名为M1D质粒，这个M1D质粒的特点是含有3个200bp片段，2个300bp片段，2个400bp片段，1个500bp片段，1个600bp片段和1个700bp片段。

以上所述的引物序列如下：

X300EU:GATCTCTAGATCTGAATTCGATGAAGATATGCG

X300ED:GATCTCTAGAGAATTCACACCAGCACCGCTCTC

扩增后得到的含有600bp长度的PCR产物序列如下：

TCTAGATCTGAATTCGATGAAGATATGCGTTTAAAAGAGCGAAGCGTGTTTGTTACTCAGTAAAGGATCAATGCTTGTGATACTCAGAATTTTCTCAGATGAGTGTATAGAGAGGTCGATATGGTTATTAATACATATGTAATATTTATCAAGATTTTTTTTTTGATTATATACCCAGAAATTGGGATTGCTGGATTATATGGGATTGTTTTTTCATTTCCTCCGGCCAGGCCTGACAGGTGGACCCACTTAGCCACCAGAGAGTAGGAAATAGAAGTGGAGTTATCACTGTGTGGCTCCTTTTAGTCAGAATTCATAAGCTGAGGTTGGAAAAGAACTTGAAAAAAAATTGGGTTTCCATTCATAAAGAGTGAGCTTCGTGAGTCTTGGGCGCTAAGTCGGCAGCCGTCCTACTGCTTGCCCCTCTGTCTTTTCAGGGCTGAGGAGGTTCCTCTGAAAATCCTGGCCCACAATGGCTTCGTTGGAAGACTGATTGGCAAAGAAGGCAGAAACCTGAAGAAAATAGAACATGAGACAGGGACCAAGATAACCATCTCATCGTAAGCTACCCCTTCTGACTGACTGTGCAGGAGAGAGCGGTGCTGGTGTGAATTCTCTAGA

5、M1E质粒构建流程

由于100bp片段比较小，则如果多个拷贝的100bp酶切后叠加在一起便能够使得100bp 的条带明显。所以优选将将多个100bp长度的片段连接到一起。

(1)pUC18Ava质粒构建

①合成下面两个序列：

ESASHF:5-AATTCGTCGACCTCGGGGTCGACA-3

ESASHR:5-TCGAACAGCTGGGGCTCCAGCTGC-3

然后再退火，退火体系如下：

混合后，离心，放在PCR仪上退火，设计循环为：94℃变性10分钟，70℃退火15分钟。然后放在室温10分钟，置于冰上5分钟。退火产物补加200μLTE缓冲液，200μL酚/氯仿混合物，混匀，12000rpm离心5分钟，乙醇沉淀DNA。然后用分光光度计定量退火的DNA片段。获得退火成功的ESASH片段，该片段序列为：

5-AATTCGTCGACCTCGGGGTCGACA-3

3-GCAGCTGGAGCCCCAGCTGTTCGA-5

退火后获得两端带EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)粘末端的片段(哪儿有这两个粘性末端)，同时引进了一个Ava I(CTCGGG)酶切位点(哪儿有)以及在其两侧各有一个SalI(GTCGAC)酶切位点。

②用EcoR I和Hind III双酶切pUC18质粒，获得线性化的带有EcoR I和Hind III粘末端的载体。

③建立连接体系，将步骤①中退火后的ESASH片段与步骤②中线性化的带有EcoR I和Hind III粘末端的载体pUC18质粒。连接体系为：

混合后，离心，放在PCR仪中，25℃连接60分钟。常规方法转化TOP10大肠杆菌感受态细胞。次日挑取克隆，摇菌，提取质粒，用M13F(-47)测序引物确认目的载体构建成功，则得到pUC18Ava质粒，备用。

(2)AvaE100片段的获得

合成以下引物：

AE100U 5-TGAACTCGGGAAAGAATTCCTTC-3

AE100D 5-AGTACCCGAGACTCTACAAGGTTCCCTGTG-3

在上游引物中同时引入AvaI和EcoRI酶切位点，下游引物中只引入AvaI酶切位点；然后以Pfu聚合酶基因为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物，即为AvaE100。两个AvaI(CTCGGG)酶切位点之间的序列如下，序列的5’端包含一个EcoRI(GAATTC)。

AvaE100序列如下：

CTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGG

(3)克隆10个AvaE10O重复序列的质粒

①单个所述AvaE10O经酚氯仿抽提，乙醇沉淀后用AvaI单酶切，充分酶切后，进行2％的琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收特异性的100bp长度的片段。然后用分光光度计定量DNA片段，进行片段连接。

②建立连接体系，如下所示：

该体系在37℃下连接60分钟，然后将连接产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1000bp长度大小的片段，此为AvaE100重复序列/片段

③测序准确的pUC18Ava质粒用AvaI充分酶切，然后用虾碱性磷酸酶(SAP)对充分酶切好的pUC18Ava质粒进行去磷酸化处理,最终获得AvaI线性化的，去磷酸化的pUC18Ava质粒。

④在T4DNA连接酶的作用下，将步骤②中回收的长度为1000bp的AvaE100重复片段和步骤③中AvaI线性化的、去磷酸化的pUC18Ava质粒进行连接。

建立连接体系如下：

混合后，离心，放在PCR仪中，25℃连接60分钟。常规方法转化TOP10大肠杆菌感受态细胞。次日挑取克隆，摇菌，提取质粒，用M13F(-47)和M13R(+48)测序引物确认目的载 体构建成功。最后获得插入10个AvaE100的克隆在pUC18质粒上的质粒，AvaE100片段头尾相连。用EcoRI酶切可以切出10个相同大小的100bp长度的片段。

插入pUC18质粒中的10个100bp长度的片段的序列如下：

GTCGACCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGGTCGAC

上述方法利用AvaI(C^TCGGG)的酶切位点的特点，将10个中间设计有EcoRI酶切位点的100bp长度的片段构建到pUC18载体上，并可以用Sal I单酶切将这一段序列酶切下来构建到其它质粒上。通过这样的技术可以增加100bp片段的数量。通常100bp条带泳动在琼脂糖凝胶的最前面，由于DNA荧光染料溴化乙啶的泳动方向和DNA相反，前面的荧光染料的量减少明显，DNA条带会显得弱。所以10个100bp片段的整体亮度基本和700bp条带一致。

(4)M1E质粒构建

利用pUC18Ava质粒中的SalI酶切位点可以将这个1006bp长度的片段克隆到有SalI酶切位点的M1D质粒中，同时用SalI单酶切M1D质粒，片段和载体连接，获得一个插入了10个100bp片段的质粒，即为M1E质粒，这个质粒的特点是含有10个100bp片段，3个200bp片段，2个300bp片段，2个400bp片段，1个500bp片段，1个600bp片段和1个700bp片段。

M1E质粒序列如下：

GGATCCGAATTCTCGATATGGTTAATACATATGTAATATTTATCAAGATTTTTTTTTTGATTATATACCCAGAAATTGGGATTGCTGGATTATATGGGATTGTTTTTTCATTTCCTCCGGCCAGGCCTGACAGGTGGACCCACTTAGCCACCAGAGAGTAGGAAATAGAAGTGGAGTTATCACTGTGTGGCTCCTTTTAGTCAGAATTCATAAGCTGAGGTTGGAAAAGA ACTTGAAAAAAAATTGGGTTTCCATTCATAAAGAGTGAGCTTCGTGAGTCTTGGGCGCTAAGTCGGCAGCCGTCCTACTGCTTGCCCCTCTGTCTTTTCAGGGCTGAGGAGGTTCCTCTGAAAATCCTGGCCCACAATGGCTTCGTTGGAAGACTGATTGGCAAAGAAGGCAGAAACCTGAAGAAAATAGAACATGAGACAGGGACCAAGATAACCATCTCATCGTAAGCTACCCCTTCTGACTGACTGTGCAGGAGAGAGCGGTGCTGGTGTTCCTGTCTCCTGCTTGTCTTCAGAGGGGAATACACTCAGCTGTACCCTGAGCATCATGGGAAGCAGAGCCACAGTGTAGCCACATAGCCCGCCGGAGCTCGAATTCGGATCCTCTAGATCTGAATTCGATGAAGATATGCGTTTAAAAGAGCGAAGCGTGTTTGTTACTCAGTAAAGGATCAATGCTTGTGATACTCAGAATTTTCTCAGATGAGTGTATAGAGAGGTCGATATGGTTATTAATACATATGTAATATTTATCAAGATTTTTTTTTTGATTATATACCCAGAAATTGGGATTGCTGGATTATATGGGATTGTTTTTTCATTTCCTCCGGCCAGGCCTGACAGGTGGACCCACTTAGCCACCAGAGAGTAGGAAATAGAAGTGGAGTTATCACTGTGTGGCTCCTTTTAGTCAGAATTCATAAGCTGAGGTTGGAAAAGAACTTGAAAAAAAATTGGGTTTCCATTCATAAAGAGTGAGCTTCGTGAGTCTTGGGCGCTAAGTCGGCAGCCGTCCTACTGCTTGCCCCTCTGTCTTTTCAGGGCTGAGGAGGTTCCTCTGAAAATCCTGGCCCACAATGGCTTCGTTGGAAGACTGATTGGCAAAGAAGGCAGAAACCTGAAGAAAATAGAACATGAGACAGGGACCAAGATAACCATCTCATCGTAAGCTACCCCTTCTGACTGACTGTGCAGGAGAGAGCGGTGCTGGTGTGAATTCTCTAGAAGCTTCTCGAGAATTCTCGATATGGTTATTAATACATATGTAATATTTATCAAGATTTTTTTTTTGATTATATACCCAGAAATTGGGATTGCTGGATTATATGGGATTGTTTTTTCATTTCCTCCGGCCAGGCCTGACAGGTGGACCCACTTAGCCACCAGAGAGTAGGAAATAGAAGTGGAGTTATCACTGTGTGGCTCCTTTTAGTCAGAATTCATAAGCTGAGGTTGGAAAAGAACTTGAAAAAAAATTGGGTTTCCATTCATAAAGAGTGAGCTTCGTGAGTCTTGGGCGCTAAGTCGGCAGCCGTCCTACTGCTTGCCCCTCTGTCTTTTCAGGGCTGAGGAGGTTCCTCTGAAAATCCTGGCCCACAATGGCTTCGTTGGAAGACTGATTGGCAAAGAAGGCAGGAATTCAAGCTTCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAAGAATTCTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAATTCCTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTT CCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGAATTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTGTCGACCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGGTCGAC

本发明中的DNA分子量标准物质粒在构建片段引入过程中，添加了XhoI(CTCGAG)和BglII(AGATCT)酶切位点。BglII和BamHI为同尾酶，XhoI和SalI为同尾酶。以BglII和BamHI为例说明。需要添加800bp长度的片段时，设计的扩增引物两端的两端分别添加BglII和BamHI酶切位点，800bp扩增片段经BglII和BamHI双酶切，本发明中的DNA分子量标准物质粒M1E经BglII酶切作为载体。由于BglII和BamHI为同尾酶，经BglII酶切的DNA分子量标准物质粒M1E可以和经BglII和BamHI双酶切的800bp长度扩增片段可以连在一 起，获得一个新的质粒，这个质粒中由于BglII和BamHI连接后酶切位点消失，另一个是BglII和BglII的粘末端连接，所以构建的新质粒还保留了一个BglII的酶切位点。按照相同的方法可以将其它片段不停的添加进去。质粒具有可持续性增加其它片段的特点。

实施例8

质粒DNA纯化工艺，即从细菌中分离质粒DNA的具体操作，如下所示。

一、试剂

1.LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。

2.LB固体培养基：液体培养基中每升加15g琼脂粉，高压灭菌。

3.氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

4.溶菌酶溶液：用10mmol/L TrisHCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml，并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。

5.3mol/lNaAc(pH5.2)：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。

6.溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/L TrisHCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。

7.溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释)，1％SDS。

8.溶液Ⅲ：5mol/LKAc 60ml，冰醋酸11.5ml，H₂O₂>+，5mol/L>-。

9.RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L TrisHCl(pH7.5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml

的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml离心管分装成小份保存于-20℃。

10.饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂)，并用等体积的0.5mol/LTrisHCl(pH8.0)和0.1mol/LTrisHCl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。

11.氯仿：按氯仿：异戊醇＝24：1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相 与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1：1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

12.TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。

13.电泳所用试剂：⑴TBE缓冲液(5×)：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。⑵上样缓冲液(6×)：0.1％溴酚蓝，60mM EDTA，30％(w/v),甘油。

二、操作步骤

1.细菌的培养和收集

将含有质粒M1E的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/mlAmp)中，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基(含50μg/mlAmp)中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。

2.质粒DNA少量快速提取

质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

使用碱裂解法进行质粒提取

(1)取2ml细菌倒入2ml离心管中，4℃下13000rpm离心30秒。

(2)弃上清，将管倒置于吸水上数分钟，使液体流尽。

(3)剧烈振荡使菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中，室温下放置5-10分钟。

(4)加入200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)。

(5)加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒离心管数次，此时产生大量的白色沉淀，冰浴中5分钟，使得沉淀完全。4℃下13000rpm离心10分钟。

(6)上清液移入另一个干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿(1:1)，振荡混匀，4℃下13000rpm离心离心5分钟。

(7)将上面的水相移入另一个干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后4℃下13000rpm离心离心10分钟。

(8)弃上清，将管口敞开倒置于吸水纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，13000rpm离心离心5分钟。

(9)吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。

(10)将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg/ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。

3.质粒DNA的大量提取和纯化

在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA，为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法纯化。

(1)500ml过夜培养细菌，离心收集。

(2)加入20ml溶液I，充分重悬细菌沉淀，分散开。

(3)一次性加入40ml溶液II，颠倒混匀，室温放置5分钟。

(4)一次性加入20ml溶液III，颠倒混匀，冰水浴10分钟。

(5)室温10,000rpm离心10分钟，转移上清到另一个干净管中。千万别将沉淀物倒到管中。

(6)加入0.6倍体积的异丙醇(例如6ml上清中需要补加3.6ml异丙醇)。颠倒混匀，室温放置10分钟。

(7)室温10,000rpm离心10分钟，弃上清。凉干沉淀物(大约30分钟，稍微干，就可以加TE buffer了。)

(8)每个50ml离心管中加入1ml TE buffer pH8.0，一般要4个50ml离心管。充分溶解沉淀。

(9)合并所有的液体到一个管中，再用1ml TE buffer将其它几个管子洗一下，再将这些液体合并到前面的液体中。这样总液体量大约为5ml。

(10)加入5ml 5mol/L的LiCl(需预先高压备用)，充分混匀，至于冰水浴5分钟，使RNA充分沉淀。

(11)室温10,000rpm离心10分钟，转移大约10ml上清到另一个干净管中。千万别倒掉上清(DNA在上清中，RNA则在沉淀中)。

(12)倒入25ml左右的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟。

(13)室温10,000rpm离心10分钟，弃上清。凉干沉淀物(大约30-60分钟就可以加TE buffer了。

(14)加入含100ug/ml的RNase A的TE buffer，一般加入的总量为2ml。充分溶解后，每500ml一个管分装到1.5ml离心管子中。

(15)37度消化RNA30分钟。

(16)向每管中添加冰水浴后的等体积的PEG/NaCl溶液。上面分装的量为500ul则需加 500ulPEG/NaCl溶液。(PEG/NaCl溶液：13％PEG8000(质量/体积),1.6mol/LNaCl的溶液，配制时先溶解PEG再加NaCl，等完全溶解后再高压备用)

(17)充分混匀后，4度10,000rpm离心10分钟。可见有透明沉淀物。

(18)弃掉上清，用吸头充分吸掉上清。留透明沉淀物。

(19)加入500ulTE,用TE充分溶解，可以在50度水浴中加速溶解。

(20)加入500ul酚/氯仿，充分混匀。室温10,000rpm离心10分钟，转移上清到另一个管中。

(21)加入500ul酚/氯仿，充分混匀。室温10,000rpm离心10分钟，转移上清到另一个管中。

(22)加入500ul氯仿，充分混匀。室温10,000rpm离心10分钟，转移上清到另一个管中。

(23)转移上清400ul到一个新管中，加入1ml无水乙醇，50ul 3M乙酸钠，pH5.2，混匀。可见沉淀出现。(该步可以放到-20度常时间冻存)

(24)室温10,000rpm离心10分钟，弃上清。

(25)加入500ul70％的乙醇，10,000rpm离心2分钟，弃上清，用吸头吸掉残余的乙醇。

(26)凉干后，用TE溶解。

(27)测OD

实施例9：酶切方法

1、小量酶切

提取好的质粒DNA经过精确定量，按照下面的反应体系进行小量酶切反应；

37℃孵育2小时或更长时间；酶切完成后，经浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，上述小量酶切完全。

2、大量酶切

小量酶切成功后，按照小量酶切的体系进行放大(一般参考小量酶切的条件判断质粒和内切酶是否合格，再决定进行大量酶切)。由于DNA分子量标准物质粒中有多个EcoR I酶切位点，通常需要更多的内切酶，酶切时间也相应增加，通常酶切体系为50ml。

在37℃下孵育8小时或更长时间。

3、酶切产物的纯化和定量

(1)大量酶切的产物等体积的酚/氯仿，充分混匀。室温12,000rpm离心10分钟，转移上清到另一个离心管中。

(2)等体积的氯仿，充分混匀。室温12,000rpm离心10分钟，转移上清到另一个离心管中。

(3)转移上清到一个新离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，十分之一的3M乙酸钠，pH5.2，混匀。-20度放置过夜。

(4)室温12,000rpm离心10分钟，弃上清。

(5)加入一倍体积的70％乙醇，12,000rpm离心2分钟，弃上清，用吸头吸掉残余的乙醇。

(6)凉干后，用适量TE溶解。

(7)通过梯度的稀释，对照定量好的DNA条带，确定分子量标准物的稀释度。

(8)补加含有甘油、溴酚蓝和EDTA的10倍浓缩的DNA电泳上样缓冲液，成为Marker I分子量标准物。如图2所示，酶切后获得的七个片段之间的亮度差异在两倍以内，在琼脂糖凝胶电泳中显示的DNA条带亮度均匀、锐利。

经检测，上述大量酶切完全。

实施例11

本发明中的DNA分子量标准物质粒在构建片段引入过程中，添加了XhoI(CTCGAG)和BglII(AGATCT)酶切位点。BglII和BamHI为同尾酶，XhoI和SalI为同尾酶。以BglII和BamHI为例说明。需要添加800bp长度的片段时，设计的扩增引物两端的两端分别添加BglII和BamHI酶切位点，800bp扩增片段经BglII和BamHI双酶切，本发明中的DNA分子量标准物质粒M1E经BglII酶切作为载体。由于BglII和BamHI为同尾酶，经BglII酶切的DNA分子量标准物质粒M1E可以和经BglII和BamHI双酶切的800bp长度扩增片段可以连在一起，获得一个新的质粒，这个质粒中由于BglII和BamHI连接后酶切位点消失，另一个是BglII和BglII的粘末端连接，所以构建的新质粒还保留了一个BglII的酶切位点。按照相同的方法可以将其它片段不停的添加进去。质粒具有可持续性增加其它片段的特点。

需要注意的是，本发明所说的一个酶切位点在另一个位点的外侧，该外侧均为靠近5’端 的一侧；此外，本发明所述的100～700bp的整数片段，其可能包含有某个酶切位点。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下所作的有关本发明的任何修饰或变更，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

<110>北京博迈德基因工程技术有限公司

<120>一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法

<130>150108CN01

<160>27

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gtcggatcct ctagaagctt ccctttcgcc agctggcg 38

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gataaatgct tcaagaattc tgaaaaagga ag 32

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cttccttttt cagaattctt gaagcattta tc 32

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctattaactg gcgaattcct tactctagct tc 32

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gaagctagag taaggaattc gccagttaat ag 32

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cccttaacgt gagaattcgt tccactgagc30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gctcagtgga acgaattctc acgttaaggg30

<210>8

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gtcggatccc gagtcgacag aacatgtgag caaaagg37

<210>9

<211>2227

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ggatcctcta gaagcttccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 60

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc120

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct180

gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg240

gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg300

tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc360

ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt420

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat480

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaagaat tctgaaaaag gaagagtatg540

agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt600

tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga660

gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa720

gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt780

attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt840

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc900

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga960

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 1020

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 1080

gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aattccttac tctagcttcc 1140

cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 1200

gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 1260

ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 1320

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 1380

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 1440

aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 1500

aaaatccctt aacgtgagaa ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 1560

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 1620

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 1680

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 1740

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 1800

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 1860

ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 1920

cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 1980

cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 2040

acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 2100

ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 2160

gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 2220

tgtcgac 2227

<210>10

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gtcaagcttc tcgagaattc tcgatatggt tattaataca ta42

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gtcaagcttg aattcctgcc ttctttgcca atca 34

<210>12

<211>423

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

aagcttctcg agaattctcg atatggttat taatacatat gtaatattta tcaagatttt 60

ttttttgatt atatacccag aaattgggat tgctggatta tatgggattg ttttttcatt120

tcctccggcc aggcctgaca ggtggaccca cttagccacc agagagtagg aaatagaagt180

ggagttatca ctgtgtggct ccttttagtc agaattcata agctgaggtt ggaaaagaac240

ttgaaaaaaa attgggtttc cattcataaa gagtgagctt cgtgagtctt gggcgctaag300

tcggcagccg tcctactgct tgcccctctg tcttttcagg gctgaggagg ttcctctgaa360

aatcctggcc cacaatggct tcgttggaag actgattggc aaagaaggca ggaattcaag420

ctt423

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gtcggatccg aattctcgat atggtta 27

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

tcgggatccg aattcgagct ccggcgg 27

<210>15

<211>618

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ggatccgaat tctcgatatg gttattaata catatgtaat atttatcaag attttttttt 60

tgattatata cccagaaatt gggattgctg gattatatgg gattgttttt tcatttcctc120

cggccaggcc tgacaggtgg acccacttag ccaccagaga gtaggaaata gaagtggagt180

tatcactgtg tggctccttt tagtcagaat tcataagctg aggttggaaa agaacttgaa240

aaaaaattgg gtttccattc ataaagagtg agcttcgtga gtcttgggcg ctaagtcggc300

agccgtccta ctgcttgccc ctctgtcttt tcagggctga ggaggttcct ctgaaaatcc360

tggcccacaa tggcttcgtt ggaagactga ttggcaaaga aggcagaaac ctgaagaaaa420

tagaacatga gacagggacc aagataacca tctcatcgta agctacccct tctgactgac480

tgtgcaggag agagcggtgc tggtgttcct gtctcctgct tgtcttcaga ggggaataca540

ctcagctgta ccctgagcat catgggaagc agagccacag tgtagccaca tagcccgccg600

gagctcgaat tcggatcc618

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gatctctaga tctgaattcg atgaagatat gcg33

<210>17

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

gatctctaga gaattcacac cagcaccgct ctc33

<210>18

<211>621

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

tctagatctg aattcgatga agatatgcgt ttaaaagagc gaagcgtgtt tgttactcag 60

taaaggatca atgcttgtga tactcagaat tttctcagat gagtgtatag agaggtcgat120

atggttatta atacatatgt aatatttatc aagatttttt ttttgattat atacccagaa180

attgggattg ctggattata tgggattgtt ttttcatttc ctccggccag gcctgacagg240

tggacccact tagccaccag agagtaggaa atagaagtgg agttatcact gtgtggctcc300

ttttagtcag aattcataag ctgaggttgg aaaagaactt gaaaaaaaat tgggtttcca360

ttcataaaga gtgagcttcg tgagtcttgg gcgctaagtc ggcagccgtc ctactgcttg420

cccctctgtc ttttcagggc tgaggaggtt cctctgaaaa tcctggccca caatggcttc480

gttggaagac tgattggcaa agaaggcaga aacctgaaga aaatagaaca tgagacaggg540

accaagataa ccatctcatc gtaagctacc ccttctgact gactgtgcag gagagagcgg600

tgctggtgtg aattctctag a621

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

aattcgtcga cctcggggtc gaca24

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

tcgaacagct ggggctccag ctgc24

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

aattcgtcga cctcggggtc gaca24

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gcagctggag ccccagctgt tcga24

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

tgaactcggg aaagaattcc ttc 23

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

agtacccgag actctacaag gttccctgtg30

<210>25

<211>106

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

ctcgggaaag aattccttcc aatggaaatt cagctttcaa gattagttgg acaaccttta 60

tgggatgttt caaggtcaag cacagggaac cttgtagagt ctcggg 106

<210>26

<211>1018

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

gtcgacctcg ggaaagaatt ccttccaatg gaaattcagc tttcaagatt agttggacaa 60

cctttatggg atgtttcaag gtcaagcaca gggaaccttg tagagtctcg ggaaagaatt120

ccttccaatg gaaattcagc tttcaagatt agttggacaa cctttatggg atgtttcaag180

gtcaagcaca gggaaccttg tagagtctcg ggaaagaatt ccttccaatg gaaattcagc240

tttcaagatt agttggacaa cctttatggg atgtttcaag gtcaagcaca gggaaccttg300

tagagtctcg ggaaagaatt ccttccaatg gaaattcagc tttcaagatt agttggacaa360

cctttatggg atgtttcaag gtcaagcaca gggaaccttg tagagtctcg ggaaagaatt420

ccttccaatg gaaattcagc tttcaagatt agttggacaa cctttatggg atgtttcaag480

gtcaagcaca gggaaccttg tagagtctcg ggaaagaatt ccttccaatg gaaattcagc540

tttcaagatt agttggacaa cctttatggg atgtttcaag gtcaagcaca gggaaccttg600

tagagtctcg ggaaagaatt ccttccaatg gaaattcagc tttcaagatt agttggacaa660

cctttatggg atgtttcaag gtcaagcaca gggaaccttg tagagtctcg ggaaagaatt720

ccttccaatg gaaattcagc tttcaagatt agttggacaa cctttatggg atgtttcaag780

gtcaagcaca gggaaccttg tagagtctcg ggaaagaatt ccttccaatg gaaattcagc840

tttcaagatt agttggacaa cctttatggg atgtttcaag gtcaagcaca gggaaccttg900

tagagtctcg ggaaagaatt ccttccaatg gaaattcagc tttcaagatt agttggacaa960

cctttatggg atgtttcaag gtcaagcaca gggaaccttg tagagtctcg gggtcgac 1018

<210>27

<211>4880

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

ggatccgaat tctcgatatg gttaatacat atgtaatatt tatcaagatt ttttttttga 60

ttatataccc agaaattggg attgctggat tatatgggat tgttttttca tttcctccgg120

ccaggcctga caggtggacc cacttagcca ccagagagta ggaaatagaa gtggagttat180

cactgtgtgg ctccttttag tcagaattca taagctgagg ttggaaaaga acttgaaaaa240

aaattgggtt tccattcata aagagtgagc ttcgtgagtc ttgggcgcta agtcggcagc300

cgtcctactg cttgcccctc tgtcttttca gggctgagga ggttcctctg aaaatcctgg360

cccacaatgg cttcgttgga agactgattg gcaaagaagg cagaaacctg aagaaaatag420

aacatgagac agggaccaag ataaccatct catcgtaagc taccccttct gactgactgt480

gcaggagaga gcggtgctgg tgttcctgtc tcctgcttgt cttcagaggg gaatacactc540

agctgtaccc tgagcatcat gggaagcaga gccacagtgt agccacatag cccgccggag600

ctcgaattcg gatcctctag atctgaattc gatgaagata tgcgtttaaa agagcgaagc660

gtgtttgtta ctcagtaaag gatcaatgct tgtgatactc agaattttct cagatgagtg720

tatagagagg tcgatatggt tattaataca tatgtaatat ttatcaagat tttttttttg780

attatatacc cagaaattgg gattgctgga ttatatggga ttgttttttc atttcctccg840

gccaggcctg acaggtggac ccacttagcc accagagagt aggaaataga agtggagtta900

tcactgtgtg gctcctttta gtcagaattc ataagctgag gttggaaaag aacttgaaaa960

aaaattgggt ttccattcat aaagagtgag cttcgtgagt cttgggcgct aagtcggcag 1020

ccgtcctact gcttgcccct ctgtcttttc agggctgagg aggttcctct gaaaatcctg 1080

gcccacaatg gcttcgttgg aagactgatt ggcaaagaag gcagaaacct gaagaaaata 1140

gaacatgaga cagggaccaa gataaccatc tcatcgtaag ctaccccttc tgactgactg 1200

tgcaggagag agcggtgctg gtgtgaattc tctagaagct tctcgagaat tctcgatatg 1260

gttattaata catatgtaat atttatcaag attttttttt tgattatata cccagaaatt 1320

gggattgctg gattatatgg gattgttttt tcatttcctc cggccaggcc tgacaggtgg 1380

acccacttag ccaccagaga gtaggaaata gaagtggagt tatcactgtg tggctccttt 1440

tagtcagaat tcataagctg aggttggaaa agaacttgaa aaaaaattgg gtttccattc 1500

ataaagagtg agcttcgtga gtcttgggcg ctaagtcggc agccgtccta ctgcttgccc 1560

ctctgtcttt tcagggctga ggaggttcct ctgaaaatcc tggcccacaa tggcttcgtt 1620

ggaagactga ttggcaaaga aggcaggaat tcaagcttcc ctttcgccag ctggcgtaat 1680

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 1740

cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc 1800

actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca 1860

cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg 1920

accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga 1980

cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 2040

tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 2100

taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaagaa 2160

ttctgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 2220

gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 2280

gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 2340

cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 2400

tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 2460

tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 2520

atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 2580

ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 2640

gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 2700

gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 2760

gaattcctta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 2820

gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 2880

gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 2940

cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 3000

atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 3060

tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 3120

ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgaga attcgttcca ctgagcgtca 3180

gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 3240

tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 3300

ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 3360

ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 3420

gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 3480

ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 3540

tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 3600

ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 3660

agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 3720

agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 3780

gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 3840

tggccttttg ctcacatgtt ctgtcgacct cgggaaagaa ttccttccaa tggaaattca 3900

gctttcaaga ttagttggac aacctttatg ggatgtttca aggtcaagca cagggaacct 3960

tgtagagtct cgggaaagaa ttccttccaa tggaaattca gctttcaaga ttagttggac 4020

aacctttatg ggatgtttca aggtcaagca cagggaacct tgtagagtct cgggaaagaa 4080

ttccttccaa tggaaattca gctttcaaga ttagttggac aacctttatg ggatgtttca 4140

aggtcaagca cagggaacct tgtagagtct cgggaaagaa ttccttccaa tggaaattca 4200

gctttcaaga ttagttggac aacctttatg ggatgtttca aggtcaagca cagggaacct 4260

tgtagagtct cgggaaagaa ttccttccaa tggaaattca gctttcaaga ttagttggac 4320

aacctttatg ggatgtttca aggtcaagca cagggaacct tgtagagtct cgggaaagaa 4380

ttccttccaa tggaaattca gctttcaaga ttagttggac aacctttatg ggatgtttca 4440

aggtcaagca cagggaacct tgtagagtct cgggaaagaa ttccttccaa tggaaattca 4500

gctttcaaga ttagttggac aacctttatg ggatgtttca aggtcaagca cagggaacct 4560

tgtagagtct cgggaaagaa ttccttccaa tggaaattca gctttcaaga ttagttggac 4620

aacctttatg ggatgtttca aggtcaagca cagggaacct tgtagagtct cgggaaagaa 4680

ttccttccaa tggaaattca gctttcaaga ttagttggac aacctttatg ggatgtttca 4740

aggtcaagca cagggaacct tgtagagtct cgggaaagaa ttccttccaa tggaaattca 4800

gctttcaaga ttagttggac aacctttatg ggatgtttca aggtcaagca cagggaacct 4860

tgtagagtct cggggtcgac 4880