一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用，本发明提供了致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列

说明书

技术领域

本发明涉及疾病诊断领域，具体涉及一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae subsp.pneumonia)，属于肠杆菌科细菌。常寄生于人体皮肤、鼻咽部和肠道等处，为条件致病菌。在临床上，可引起肺炎和尿路感染等(Podschun R,Ullmann U.Klebsiella spp.as nosocomial pathogens:epidemiology,taxonomy,typing methods,and pathogenicity factors.Clinical microbiology reviews.1998；11(4):589-603)。1980年到1990年，台湾地区Liu等人首次报道了7例由高毒力肺炎克雷伯菌引起的严重肝脓肿伴眼内炎病例(Liu Y,Cheng D,Lin C.Klebsiella pneumoniae liver abscess associated with septic endophthalmitis.Arch Intern Med 1986；146:1913–16)。此后，肺炎克雷伯菌肝脓肿开始全球流行，特别是在亚洲。与普通的肺炎克雷伯菌相比，致肝脓肿肺炎克雷伯菌侵袭力强、致死率高。除了导致肝脓肿，致肝脓肿肺炎克雷伯菌还可以引起严重的脑膜炎、眼内炎和肺脓肿等(Siu LK,Yeh KM,Lin JC,Fung CP,Chang FY.Klebsiella pneumoniae liver abscess:a new invasive syndrome.The Lancet Infectious diseases.2012；12(11):881-7)。对于这样高毒力的肺炎克雷伯菌感染，尽快诊断，及时治疗，对降低严重并发症的发生，改善预后具有重要的临床价值。但是，目前没有一种快速简便的方法用于致肝脓肿肺炎克雷伯菌的检测鉴定。

随着肺炎克雷伯菌肝脓肿病例报道的增加和致肝脓肿肺炎克雷伯菌研究的深入，几个与致肝脓肿肺炎克雷伯菌相关的表型相继被提出，包括菌落高粘性表型和荚膜多糖血清型K1型/K2型等。肺炎克雷伯菌可分泌多糖类物质于细胞表面，从而使菌落产生高粘性表型，用以抵抗巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬。但最近研究发现，只有50％不到的致肝脓肿肺炎克雷伯菌表现为菌落高粘性(Qu TT,Zhou JC,Jiang Y,Shi KR,Li B,Shen P,et al.Clinical and microbiological characteristics of Klebsiella pneumoniae liver abscess in East China.BMC infectious diseases.2015；15:161)。荚膜多糖血清抗原K1型和K2型是致肝脓肿肺炎克雷伯菌的主要血清型，但仍有20％以上的致肝脓肿肺炎克雷伯菌不属于K1/K2血清型。此外，血清型K1型或K2型也被发现存在于普通肺炎克雷伯菌(Sun Y,Wu H,Shen D.Clinical and Molecular Analysis of Klebsiella pneumoniae Causing Liver Abscess in China.Journal of molecular microbiology and biotechnology.2016；26(4):245-51)。因此，为了能够在分子水平更快速有效的鉴定致肝脓肿肺炎克雷伯菌，我们通过对致肝脓肿肺炎克雷伯菌和普通肺炎克 雷伯菌的基因组比较分析，找到致肝脓肿肺炎克雷伯菌的特异性基因序列。利用这些特异性序列，通过简单的PCR方法，可以快速地鉴定致肝脓肿肺炎克雷伯菌，为由该病原菌引起的感染的及时诊断和治疗、改善患者预后提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO，所述的基因特异性序列pagO为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了基于致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO设计的引物，引物为：pagO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC，pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA。

本发明还有一个目的在于提供了致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列luxR，所述的基因特异性序列luxR为SEQ ID NO.2所示。

本发明还有一个目的在于提供了基于致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列luxR设计的引物，引物为：luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA，luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。

本发明还有一个目的在于提供了致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO或基于pagO设计的引物在制备致肝脓肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括用于制备肺炎克雷伯菌肝脓肿早期诊断试剂盒中的应用。

本发明还有一个目的在于提供了致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列luxR或基于luxR设计的引物在制备致肝脓肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括用于制备肺炎克雷伯菌肝脓肿早期诊断试剂盒中的应用。

本发明的最后一个目的在于提供了一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒，所述的试剂盒包括引物：

pagO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC

pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA

luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA

luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO，所述的基因特异性序列pagO为SEQ ID NO.1所示。

基于pagO序列设计的引物均为本发明的保护范围，优选的，pagO的引物为：pagO_F： TGCTCTTGAAACTATCCCTCC；pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA。

致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列luxR，所述的基因特异性序列luxR为SEQ ID NO.2所示。

基于luxR序列设计的引物均为本发明的保护范围，优选的，luxR的引物为：luxR的引物为：luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA；luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。

本发明的保护范围还包括致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO或基于pagO设计的引物在制备致肝脓肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括制备肺炎克雷伯菌肝脓肿早期诊断试剂盒。

本发明的保护范围还包括致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列luxR或基于luxR设计的引物在制备致肝脓肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括制备肺炎克雷伯菌肝脓肿早期诊断试剂盒。

一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒，包括：

pagO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC

pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA

luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA

luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

1.目前尚无很好的用于致肝脓肿肺炎克雷伯菌鉴定的分子标志物，本发明通过测序2株分离自中国大陆的致肝脓肿肺炎克雷伯菌和1株非致肝脓肿肺炎克雷伯菌，联合网上公布的45株致肝脓肿肺炎克雷伯菌和103株非致肝脓肿肺炎克雷伯菌的全基因组数据，通过比对分析，得到了用于在致肝脓肿肺炎克雷伯菌中高度特异的两段序列。

2.本发明提供的2段致肝脓肿肺炎克雷伯菌特异的序列，可以作为制备致肝脓肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒

3.本发明提供的2段致肝脓肿肺炎克雷伯菌特异的序列，可以作为分子标志物，用于肺炎克雷伯菌肝脓肿的早期诊断。特别是在血液等其他体液来源标本的病原菌培养结果出报告前，利用患者血液标本或肝脏脓腔脓液，采用快速的PCR方法检测致肝脓肿肺炎克雷伯菌特异性基因pagO或/和luxR的有无，结合患者临床表现和影像学资料，可以快速对肺炎克雷伯菌肝脓肿做出诊断，提高肺炎克雷伯菌肝脓肿的治疗成功率。

具体实施方式

具体实施例对本发明作进一步说明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1：

特异性序列的开发和验证:

特异性基因序列的筛选过程结合第二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)，比较基因组学(Comparative Genomics)及生物信息学(Bioinformatics)方法，并采用科学的统计学方法，对序列在多个肺炎克雷伯菌基因组中分布的特异性进行检验，并且在分离的致肝脓肿肺炎克雷伯菌及非致肝脓肿肺炎克雷伯菌中进行PCR验证，以确定序列在致肝脓肿肺炎克雷伯菌中的特异性。具体实施过程如下：

选取2株分离自中国大陆的致肝脓肿肺炎克雷伯菌和1株非致肝脓肿肺炎克雷伯菌用于全基因组测序，测序结果用SPAdes(v3.5)软件进行拼接，用PATRIC在线分析平台进行基因预测和功能注释。得到的测序结果联合美国国立生物信息中心(National Center for Bi otechnology Information，NCBI)公布的45株致肝脓肿肺炎克雷伯菌和103株非致肝脓肿肺炎克雷伯菌的全基因组数据，通过比对分析，筛选只存在于致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因组中的基因，得到了两段在致肝脓肿肺炎克雷伯菌中高度特异的序列pagO(SEQ ID NO.1所示)和luxR(SEQ ID NO.2所示)基于这两段特异的序列设计引物，开发得到一套用于鉴定致肝脓肿肺炎克雷伯菌的引物：

pagO的引物为：

pagO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC

pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA

luxR的引物为：

luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA

luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。

实施例2：

基因特异性验证：

pagO和luxR致肝脓肿肺炎克雷伯菌特异性基因在临床分离菌株中的验证，其具体步骤是：

1.选择临床分离的致肝脓肿和非致肝脓肿肺炎克雷伯菌菌株，用于检测pagO(SEQ ID N O.1所示)和luxR(SEQ ID NO.2所示)在致肝脓肿肺炎克雷伯菌中的特异性。选择肝脓肿患者脓腔中分离的40株肺炎克雷伯菌作为检测组(致肝脓肿组)，另选取非肺炎克雷伯菌肝脓肿患者中分离的肺炎克雷伯菌36株作为阴性对照组(非致肝脓肿组)。同时也选取了临 床上分离的常见其他致病菌(其他致病菌组)以进一步验证这些因子在致肝脓肿肺炎克雷伯菌中的特异性：包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌。

2. 2个预测基因特异性引物的设计：针对pagO和luxR特异性序列设计的引物如下：

pagO的引物为：

pagO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC

pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA

luxR的引物为：

luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA

luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA

3.细菌基因组的提取：将选取的76株肺炎克雷伯菌按照常规方式提取DNA。

4.PCR检测pagO和luxR基因在三组菌(致肝脓肿组、非致肝脓肿组和其他致病菌组)中的存在情况：PCR反应采用Premix TaqVersion 2.0(TaKaRa,Code:D331A)试剂盒。根据试剂盒说明，设置的PCR反应体系为25ul，其中Premix Taq 12.5ul，基因组DNA模板1ul(约100ng)，上下游引物0.5ul(10uM)，加去离子水10.5ul补充至总体积25ul。

PCR条件为：94℃变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃7min；反应结束后各取5ul反应产物用于DNA的琼脂糖凝胶电泳，电泳胶用溴化乙锭(Ethi dium bromid)染色5min后，在美国伯乐(Bio-Rad)凝胶成像分析仪上拍照分析。

结果见表1，如表1所示，pagO和luxR在致肝脓肿肺炎克雷伯菌中的检出阳性率分别为100％，而在非致肝脓肿的肺炎克雷伯菌中全为2.78％。在其他致病菌组中，包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌均为阴性。

以上结果可以证明，pagO或luxR在致肝脓肿肺炎克雷伯菌中具有很高的特异性，可以分别或结合作为诊断肺炎克雷伯菌肝脓肿的分子标记物。

表1 pagO和luxR在临床菌株中的PCR检测的结果

实施例3：

pagO和luxR序列或基于其序列设计的引物在制备肺炎克雷伯菌肝脓肿诊断试剂盒中的应用：

本实验设计思路如下：将临床获得的血培养样品分为血培养阳性组和健康人阴性组，其中血培养阳性组指所有血中培养出细菌的样品，不仅仅局限于血中培养出肺炎克雷伯菌，包括培养出其他致病菌的样品。用PCR检测阳性血培养样品和阴性血培养样品中特异性因子(即pagO和luxR)的存在情况，最后把PCR结果与患者最终临床诊断对应分析，以此来判断本发明提供的方法对肺炎克雷伯菌肝脓肿的检出率。

1.临床血培养样品的收集：共收集2组血培养样品，血培养阳性组69瓶、健康人血培养阴性组40瓶。

2.PCR检测pagO和luxR在血培养样品中的存在情况：

2.1模板的制备：在无菌条件下，抽取3ml培养瓶中的血液，8000rpm，离心2min。弃去上清，沉淀用200ul双蒸水吹打混匀成悬液。悬液在100℃煮沸10min，然后用13000rpm，离心5min，上清液作为PCR检测的模板。

2.2PCR检测pagO和luxR基因序列标记物及其组合在两组血培养样品中的存在情况：PCR反应采用Premix TaqVersion2.0(TaKaRa，Code:D331A)试剂盒。根据试剂盒说明，设置的PCR反应体系为25ul，其中Premix Taq 12.5ul，基因组DNA模板2ul，上下游引物0.5ul(10uM)，加去离子水10.5ul补充至总体积25ul。PCR反应条件为：94℃变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃7min；反应结束后各取5ul反应产物用于DNA的琼脂糖凝胶电泳，电泳胶用溴化乙锭(Ethidium bromid)染色5min后，在美国伯乐(Bio-Rad)凝胶成像分析仪上拍照分析。

pagO的引物为：

pagO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC

pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA

luxR的引物为：

luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA

luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA

血培养阳性组中PCR检测结果及最终病人确诊结果见表2。规定，pagO和luxR中只要一个扩增结果为阳性即该样本为阳性。健康人血培养阴性组无任何条带扩出，均为阴性，因此结果不在表2和表3中示出。表2中“确诊结果”栏“+”表示病人的最终诊断为肺炎克雷伯 菌肝脓肿，“-”表示病人排除肺炎克雷伯菌肝脓肿诊断，为其他疾病。特异性因子栏(即“pa gO”、“luxR”、“pagO+luxR”)中“+”表示≥1个标记物扩增结果为阳性，“-”表示所检测的因子全阴性。

表2 血培养阳性组病人最终确诊结果和PCR扩增结果

其中表2中，特异性因子在10号病例的血培养样品中PCR结果全为阳性，但一开始10号病例在临床上并未诊断为肺炎克雷伯菌肝脓肿，申请人怀疑因子出现了假阳性；但两周后，随着病情进展，患者发现肝脓肿，确诊为肺炎克雷伯菌肝脓肿，从而排除了特异性因子假阳性结果；这个病例也说明，特异性因子具有早期诊断肺炎克雷伯菌肝脓肿的作用。

表3 血培养阳性组中各标记物的阳性率和假阳性率

pagO在肺炎克雷伯菌肝脓肿患者的血培养样品中PCR阳性率为97.37％，在非肺炎克雷伯菌肝脓肿患者血培养样品中的阳性率仅为0％，在血培养阴性组的阳性率为0％；luxR在肺炎克雷伯菌肝脓肿患者的血培养样品中PCR阳性率为92.11％，在非肺炎克雷伯菌肝脓肿患者血培养样品中的阳性率为0％，在血培养阴性组的阳性率为0％；pagO+luxR在肺炎克 雷伯菌肝脓肿患者的血培养样品中PCR阳性率为97.37％，在非肺炎克雷伯菌肝脓肿患者血培养样品中的阳性率仅为0％，在血培养阴性组的阳性率为0％。以上结果说明pagO和luxR在肺炎克雷伯菌肝脓肿患者血培养阳性标本中具有很高的特异性，可以分别或结合作为肺炎克雷伯菌肝脓肿快速诊断的分子标志物。

SEQUENCE LISTING

<110>南京市第一医院

<120>一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用

<130>一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>903

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgcgtagaa ttactatatt tatattattc ctgttagttg ctgtaacttg gggaaccacg 60

tggttagcta tgaagattgc tcttgaaact atccctccag tctttgctac cgggatgaga120

tttttatttt ccgctccatt attaatcatt atcgcatggg taaaaaaaat accaatttta180

tttcctgttg gccagcgtct atttcaactt gcaattagta tgttttattt tgccattcct240

ttctctctaa tgatttatgg tgaggtttat gtaaacccag gacttgccgc tattatattt300

gcaaatatgc cggtggctat tttaatagca tcatttttat ttttgaatga aaaaacaaac360

tcaatacaga ttactggact aattatcgca ttagcttcac tttcgttcat cctcatcacg420

gaggcgcggg aaaggacaga aagccagtgg acgggagtta ttgccctttc ttctgcagta480

ataattcatg ccatagtata tactcaatgt aaaaaaagat gctgtaaagt ctctgttata540

tcgtttaatg cgttaccgtg ttttatagct ggggttattc tttcgctggt ggggagtatc600

tttgagaggc cacaattatc agctttatct ttacactcta cattagcaac aatgtattta660

ggctgttttg ctggagtttt tgggatactg tgctattttt ctctgcagaa aagggctagc720

gctttccagg cttcgctcgt atttctcatc ttccctctaa ttgcagtaag cttggaaagt780

tatatatatg ggaaaaccat atcaacatac tcaatcttac tgattatccc cctcgtcatt840

ggaatactta tcacacttat ccccaaaaaa actgtcgttg ataaaaacaa aatgaatagc900

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aattcaaacg taatcatttt attggatggt gtgaatcaca aagtttcgat aaaagagtat180

agctatctaa aaaaaatagg tttacctgtt ttttttattc tgaacacaaa ctgtaatgtt240

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aagaccggtg taaaacacca taatcacctt aatattttaa aaaacatcct tggcatacat540

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<212>DNA

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ctttgccggc atggaacata 20

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

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