N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体及其工程菌的构建

摘要

N‑氨甲酰‑D‑对羟基苯甘氨酸水解酶突变体及其工程菌的构建，通过定向进化技术获得的5个突变体与N‑氨甲酰‑D‑对羟基苯甘氨酸水解酶的区别分别为：N‑氨甲酰‑D‑对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第193位的半胱氨酸突变为天冬酰胺；第200位的苏氨酸突变为丙氨酸；第226位的天冬酰胺突变为酪氨酸；第243位的半胱氨酸突变为天冬酰胺；第250位的半胱氨酸突变为酪氨酸；并进行工程菌构建，将其应用于D‑对羟基苯甘氨酸的生产中，和野生酶相比，在对氧气的耐受性、酸碱的耐受性及酶活方面有很大提升。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种编码N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体及其工程菌的构建。

背景技术

D-氨基酸及其衍生物是医药及食品领域的重要原材料，被广泛地用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊酯、杀虫剂和甜味剂等的中间物，因而引起越来越多的兴趣，特别是作为半合成抗生素的侧链原料——D-型氨基酸更受到人们的关注。D-对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)是制备β-内酰胺类抗生素(如青霉素、头孢菌素)的重要原料以及合成多种多肽类激素和农药的主要侧链，广泛用于药学领域。

D-对羟基苯甘氨酸作为非天然氨基酸，它不能利用自然微生物发酵生产，目前其制备方法主要有化学法和生物酶法两大类。化学制备反应条件相对比较剧烈、污染大、产率低并且费用高，已逐渐被反应条件温和，无需高温高压，成本低，无污染，底物转化率和光学活性都较高的生物酶法所代替。酶法的技术原理是：用D-乙内酰脲酶(也称为D-海因酶)将DL-对羟基苯海因不对称水解成N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸，然后在N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶(简称DCase)的作用下，将N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸不可逆水解成D-p-HPG(D-对羟基苯甘氨酸)。

但工业生产中发现，从微生物细胞中分离、提取N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶制成固定化酶的技术已有使用，但酶的成本过高，且产品收率也偏低，而且由于细胞含酶活力偏低，采用常规细胞固定化技术可增加酶活稳定性，但固定化细胞酶活降得更低而难以使用。因此，在生产D-对羟基苯甘氨酸的过程中，由于DCase催化效率低、稳定性差的缺点，导致中间物N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸大量积累，终产物D-对羟基苯甘氨酸产率低。

虽然天然酶分子在自然条件下已进化了千百万年，但是因为天然酶分子存在的环境与实际应用环境的不同，酶分子仍然藏着巨大的进化潜力。运用分子定向进化技术比如易错PCR技术、DNA改组技术和定点突变技术等对微生物来源的酶进行分子改性和人工进化在近些年中取了令人瞩目的进展，这种分子水平上的人工定向进化技术是通过体外重组来改造靶基因，并定向筛选具有预期性状的突变体，从而改造具有新功能的改性的酶，大大加速了蛋白质的进化进程。其中，突变作为蛋白质工程中的一种重要手段，在转氨酶的改造中已经发挥了重要的作用，不仅可以阐明转氨酶的一些特殊机理，而且能够在一定程度上改良转氨酶的动力学活性。因此，在生物工程中，利用突变来解决相关问题的做法日益受到重视，本发明旨在制得N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的突变体，以提高酶活及氧气、酸碱耐受性，并将其应用于D-对羟基苯甘氨酸的生产中，从而创造具有新功能的改性的酶，以大大加速蛋白质的进化进程。

发明内容

本发明的一个目的在于提供N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体，其中相比于野生酶，所述N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的基因表达的突变酶，在对氧气的耐受性、对酸碱的耐受性及酶活方面有显著提升。

本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的DNA序列。

本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的突变酶的氨基酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的基因编码序列。

本发明的另一目的在于提供一种包含有突变水解酶基因的重组质粒的构建方法。

本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的重组表达质粒。

本发明的另一目的在于提供N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体构建的工程菌。

本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体 在D-对羟基苯甘氨酸的生产中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的编码基因在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种重组表达质粒及其在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。

本发明的另一目的在于提供所述基因工程菌在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。

为达到上述目的以及本发明的其他目的和优势，本发明先采用易错PCR技术和DNA改组技术相结合的方法，以从海洋链霉菌中筛选的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶基因作为模板基因，对其进行随机突变。N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的序列与Genebank的登陆号为AF320814的酶序列同源性为97％，因此可以认定为同一种酶，其是由304个氨基酸组成，其编码DNA的序列包括915bp，其编码DNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的筛选体系是以反应体系的pH升高引起指示剂颜色变化作为筛选指标将正突变检出。氨甲酰水解酶催化反应后，使反应体系的pH得到提高，而该方法使用的酚红指示剂能在pH大于6.3时由黄色变为红色。

通过上述方法，本发明筛选到了5个酶活性及氧气受耐性、酸碱耐受性均较高的突变体，本发明所获得的5个突变体与N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的区别分别为：

N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第193位的半胱氨酸突变为天冬酰胺；

N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第200位的苏氨酸突变为丙氨酸；

N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第226位的天冬酰胺突变为酪氨酸；

N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第243位的半胱氨酸突变为天冬酰胺；

N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第250位的半胱氨酸突变为酪氨酸；

根据本发明，重组质粒克隆上述的所述N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的编码序列。

根据本发明所述的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的DNA序列克隆入宿主细胞，并将所述宿主细胞的发酵菌体用于D-对羟基苯甘氨酸的生产中。

根据本发明，将所述重组质粒转化入宿主细胞获得基因工程菌。

相比于野生型N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶(野生酶)，本发明的5个突变体的酶活、抗氧化性和耐高温性均得到提高，显示出在D-对羟基苯甘氨酸生产中的潜在应用价值。因此，适于将本发明提供的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体、N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的编码基因、N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的重组质粒、N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的基因工程菌应用于D-对羟基苯甘氨酸的生产制造中。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。

以下实施例中，所使用的基因-pET28a-DCase是指从海洋链霉菌Streptomyces sp.7-145(CGMCC NO.7914)中筛选出的DCase基因和pET28a组建的重组子，其N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶基因序列及编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

实施例1、N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶基因的克隆

1.1PCR扩增

引物设计

DCase-F1：CGGGATCC GCTCGTCAGATGATATTCGCAG

DCase-R1：CTTACGATACTTGCCGACGATCTTG

DCase-F2：CAAGATCGTCGGCAAGTATCGTAAG

DCase-R2：GAGATGGTGGAAGGACGTCAGGTGG

DCase-F3：CCACCTGACGTCCTTCCACCATCTC

DCase-R3：CCCAAGCTTGAGTTCCGCGATCAGACC

以pET28a-DCase质粒为模板，使用引物DCase-F1和DCase-R3进行PCR扩增。扩增体系：2×PCR mix 10μl，dd H₂O>

PCR反应条件为：96℃，2min预变性；96℃，1min变性，50℃，30s退火，72℃延伸1min(30个循环)；最后72℃延伸5min，4℃下保存。

1.2含N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的质粒构建

PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120伏，割胶后，用胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)回收900bp左右的目的DNA片段，接着用BamHI和HindIII进行双酶切，将所获得的DNA片段和载体pET-28a连接(宝生物工程有限公司)，之后将链接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选。

重组子用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切验证。酶切产物在此进行电压为120伏的琼脂糖凝胶电泳，验证片段大小分别为900bp左右的片段和5300bp左右的载体。

1.3表达N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的基因工程菌株构建

用质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取重组子质粒，然后按常规方法转化入E.coli BL21(北京全式金生物技术有限公司)，即获得N-氨甲酰水解酶基因的大肠杆菌工程菌。

实施例2、N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶表达基因的定向突变

2.1引物设计

DCase-F1：CGGGATCC GCTCGTCAGATGATATTCGCAG

DCase-R1：CTTACGATACTTGCCGACGATCTTG

DCase-F2：CAAGATCGTCGGCAAGTATCGTAAG

DCase-R2：GAGATGGTGGAAGGACGTCAGGTGG

DCase-F3：CCACCTGACGTCCTTCCACCATCTC

DCase-R3：CCCAAGCTTGAGTTCCGCGATCAGACC

以pET28a-DCase重组子为模板，用引物DCase-F2和DCase-R2进行易错PCR扩增，易错PCR反应体系(50ul)：模板基因20ng，上下引物各300pmol，dATP0.2mm，dGTP0.2mm，dCTP1mm，dTTP1mm，MgCl₂>2>

PCR条件为：96℃，5min预变性；96℃，30s变性，50℃，30s退火，72℃延伸30s(30个循环)；最后72℃延伸5min，4℃下保存。

2.2含N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变基因的质粒构建

PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120伏，割胶后，用胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)回收400bp左右的目的DNA片段，将所获得的DNA片段和载体pMD18-T载体连接(宝生物工程有限公司)，之后将链接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选。之后挑取单菌落，确定突变率。

2.3N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变库的构建

以pET28a-DCase重组子为模板，分别用引物DCase-F1、DCase-R1和DCase-F3、DCase-R3进行PCR扩增，PCR反应体系(50ul)：模板基因20ng，上下引物各300pmol，MgSO₄>

PCR条件为：95℃，5min预变性；95℃，30s变性，54℃，30s退火，68℃延伸30s(30个循环)；最后68℃延伸5min，4℃下保存。

以三段基因的PCR结果为混合模板，用引物DCase-F1和DCase-R3进行PCR扩增，PCR扩增体系为：模板基因20ng，上下引物各300pmol，MgSO₄>

PCR条件为：95℃，5min预变性；95℃，30s变性，54℃，30s退火，68℃延伸1min(30个循环)；最后68℃延伸5min，4℃下保存。

2.4含N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变基因的质粒构建

PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120伏，割胶后，用胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)回收900bp左右的目的DNA片段，接着用BamHI和HindIII进行双酶切，将所获得的DNA片段和载体 pET-28a连接(宝生物工程有限公司)，之后将链接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选。

重组子用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切验证。酶切产物在此进行电压为120伏的琼脂糖凝胶电泳，验证片段大小分别为900bp左右的片段和5300bp左右的载体。

实施例3、N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变库的筛选

3.1含N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变库的工程菌构建

用质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取重组子质粒，然后按常规方法转化入E.coli BL21(北京全式金生物技术有限公司)，转化细胞涂于含氨苄抗生素的LB平板(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂1.5％)上，37℃培养。

3.2N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体筛选与鉴定

挑取单菌落培养于含200ul含卡那抗生素(50ug/ml)的96孔板上，当OD600达到0.6时，加入1MIPTG使其终浓度为0.2mM，18℃培养过夜。

每孔取出150ul菌液与96孔板上，放置-80℃，冰冻1.5h，随后放置室温解冻1h。

取解冻好的菌液20ul转移入96孔板中，分别进行抗氧化(双氧水终浓度2mM处理20min，25℃)和耐高温(65℃处理30min)处理。

在处理好的菌液中加入200ul反应液(5g/L N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸，1mM EDTA和0.01％的酚红，PH5.0)充分混合，分别用没处理的N-氨甲酰水解酶和ddH₂O作为阳性跟阴性对照，37℃孵育30min，发生颜色从淡黄色变成红色的即为阳性菌落。

3.3筛选结果

通过上述筛选，我们共获得五个重组蛋白抗氧化性和热稳定性提高的突变体，通过测序，发现它们的突变位点分别是C193N、T200A、N226Y、C243N和C250Y。具体内容见表1：

表1五个DCase突变体的氨基酸序列和基因序列变化的结果

编号 氨基酸位置 氨基酸变化 核苷酸位置 核苷酸变化

C193N 第193位 半胱氨酸→天冬酰胺 577bp～579bp TGC→AAT T200A 第200位 苏氨酸→丙氨酸 598bp～600bp ACC→GCT N226Y 第226位 天冬酰胺→酪氨酸 676bp～678bp AAC→TAT C243N 第243位 半胱氨酸→天冬酰胺 727bp～729bp TGC→AAC C250Y 第250位 半胱氨酸→酪氨酸 748bp～750bp TGC→TAT

实施例4、突变重组酶与未突变酶抗氧化性和耐高温性的对比

4.1目的蛋白的富集

分别将实施案例3.2中的菌液转接到LB液体培养基中进行种子培养，待种子成熟后按4％接种量转接至200mlLB(卡那抗生素终浓度50ug/ml)培养基中，随后实时监控OD600，待OD600到0.6时，加入1MIPTG使其终浓度为0.2mM，18℃诱导表达14h。

4.2粗酶的制备

将4.1所得菌液进行离心处理，去除上清。用100mM，PH7.5的磷酸盐缓冲液重悬，于高压均质破碎仪(美国PHD)进行破碎。将得到粗酶液与4℃，13000rpm/min离心30min，取上清，置于4℃备用。

4.3粗酶液的抗氧化处理和热处理

分别取4.2中制得的粗酶液500ul与1.5ml离心管中，一式五份，同时平行做三组实验。

处理一：在离心管中，依次加入双氧水使其终浓度为1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，处理1h后，放置4℃备用。具体结果见表2：

表2经双氧水处理后DCase和突变体酶的酶活情况比较

处理二：将所得的酶液置于65℃的金属浴(北京康润诚业生物科技有限公司)中分别处理0min，30min，60min，90min，120min，之后放置4℃备用。具体结果见表3：

表3经65℃高温处理后DCase和突变体酶的酶活情况比较

4.4酶促水解反应

将4.3中处理过的粗酶液500ul加入400ul的100mM的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸，进行水解反应，37℃，200rpm。30min后，加入500ul的10％盐酸终止反应。

4.5、酶活的测定

将4.4中的反应物稀释3倍后，13000rpm/min离心10min，取上清进行高效液相色谱检测。

HPLC测定方法如下：甲醇(含0.01％TFA)和水(含0.01％TFA)为流动相，比例为5:95，流速为1.0ml/min，检测波长为267nm。检测不同物质峰面积和保留时间及相同物质的不同峰面积，同时绘制标准曲线，然后根据测定的标准品值计算样品酶活的绝对数值。

1U酶活定义为1分钟产生1umol D-对羟基苯甘氨酸所需的酶量。

剩余酶活力计算公式＝酶经抗氧化或者高温处理后的酶活÷酶在零度保温后的酶活×100％。

通过上述数据比较可以发现，相比于野生酶，N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的突变体在对氧气的耐受性、对酸碱的耐受性及酶活方面有很大提升。

上述实施例显示，N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的5个突变酶在可溶性表达和单位菌体酶活方面都优于野生型，同时也进一步表明，N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的突变体在D-对羟基苯甘氨酸的生产中具有很大的应用潜力。因此，采用定性进化技术改造工业用酶是一个十分有效的手段。

本领域的技术人员应理解，上述描述中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。