一株分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌及其应用

摘要

本发明涉及一株分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌及其应用，菌种名称为H22‑b，分类命名为：Acetobacter syzgii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11759，分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌作为食品保鲜剂、发酵剂、食醋酿造工业或维生素C发酵剂等的应用。本发明分离得到的醋酸菌Acetobacter syzgii作为单一菌株进行酸粥发酵，可使得酸粥的菌株数量、pH、自由氨基酸含量等指标达到天然发酵酸粥水平。可初步确定该菌可以作为酸粥发酵的出发菌株。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌及其应用。

背景技术

传统的自然发酵谷物食品在亚洲非常普遍,发酵赋予其独特的感官风味与质地特性。传统发酵食品中，微生物菌群相对稳定而且安全，无需加热处理也可以保存很长一段时间。制作酸粥的原材料可以是糜米、小米、大米、玉米糁糁等，其中糜米是最常见的原材料。糜米酸粥是北方长城沿线风沙区清凉解暑的最佳食品，是陕西府谷、山西河曲、内蒙古包头等地极具特色的民间食俗。在山西河曲、偏关等地，酸粥是人们日常早晚餐的必备饮食，并在当地有一民俗是将制作酸粥的浆米缸嫁女儿的陪嫁品，足以体现当地人对此食品的喜爱。传统的糜米酸粥制作是利用延续使用酸粥老汤中天然存在的微生物发酵而成。其制作过程是将淘洗过的糜米(或称粳性黄米)放入罐中，加入适量的温水，水高过糜米5-10厘米，放在锅台或热炕静置一夜，待浆米发酵有酸味；每天将浆米捞出后，再将煮过米的米汤取一部分添加至浆米罐中，与之前酸浆混合，继续发酵，每天循环添加。如果有一段时间不食用，则把盛有酸浆的浆米缸放置在阴冷的地方，食用时可以继续使用。这样的制作工艺导致酸粥中形成了独特的微生物菌群，但是酸粥家庭式作坊生产在生活中经常会有不卫生的环境和较高的温度等因素带来的极易染菌的情况出现。在食品安全日益受到重视的今天，天然老汤发酵的糜米酸粥已经不能满足现代人们的需求，传统制作方法因微生物连续传代会造成活力不稳定，而且易发生杂菌污染或因老汤中共生菌群失衡，而使糜米发酵酸粥的风味等品质性能下降，从而限制了这种传统发酵食品的商品化生产。

醋酸菌在一些传统发酵食品中也大量存在，并表现出很好的发酵能力。醋酸菌和酵母菌是民间传统酸性饮料红茶菌的主要微生物。红茶菌的菌膜则是由许多木醋菌所合成的大量的纤维素和其菌体交织在一起形成的。醋酸菌除能将乙醇氧 化为醋酸，是中国传统酸性调味剂食醋的主要发酵菌种。醋酸菌、乳酸菌和酵母菌还是西藏发酵乳品开菲尔的主要微生物发酵菌种，不过醋酸菌并不是开菲尔中的优势菌种。我们研究的实验结果表明，天然发酵的糜米酸粥微生物的生态系统非常复杂，主要由乳酸菌、醋酸菌和酵母主导发酵作用。我们从59份酸粥样品，通过传统微生物分离技术，分离鉴定得到乳酸菌78株，醋酸菌42株，酵母52株。另外我们对24份酸粥样品的16S rRNA基因基于miseq平台的宏基因组分析表明，醋酸菌属细菌在这24份酸粥中的平均含量为33.40％，仅次于乳酸菌的平均含量60.20％，是酸粥中数量位列第二的菌种。在有些样品中只分离得到醋酸菌是糜米酸粥的独特之处。

醋酸菌是一类革兰氏染色阴性、绝对好氧和能够将酒精氧化为醋酸的微生物的总称。醋酸菌分布范围广泛，在果园的土壤中、葡萄或其他浆果或酸败食物的表面，以及在未灭菌的食醋及其酸性饮料、葡萄酒、开菲尔、红茶菌、果酒、啤酒、黄酒中都可以生长繁殖。醋酸菌与人类的生产生活密切相关，在食品、饮料、医药、化工等行业都有广泛的应用前景。醋酸菌作为人类有益微生物具有悠久历史，醋酸菌最常见的两个属为醋杆菌属(Acetobacter)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)。醋杆菌属(Acetobacter)是传统食醋酿造过程中的重要微生物，决定着食醋产量和质量。葡糖杆菌属(Gluconobacter)菌株在葡萄糖酸、L-山梨糖和二羟基丙酮的微生物合成中具有重要作用，而葡糖醋杆菌属菌株则常具有固氮作用，并能产生细菌纤维素。由醋酸菌生产的细菌纤维素可作为硅酸盐矿石浮选，无纺棉、高吸水纤维织品、滤器膜、化妆品基质或药物载体等。醋酸菌不仅应用于生产食醋、生产葡萄糖酸、α-酮戊二酸和山梨酸、进一步合成维生素C，还是乙醇和糖类氧化的生化反应的重要研究对象。目前醋酸菌在食醋酿造工业及维生素C制造工业上发挥着重要作用。

发明内容

本发明的目的在提供一株分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌及其应用，本发明对该菌株的生长曲线进行了测定，并分析了由该菌株纯菌模拟发酵糜米酸粥的生化特性。该菌株可以作为酸粥工业发酵生产的优异的候选菌株。

本发明实现目的的技术方案如下：

一株分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌，菌种名称为H22-b，分类命名为：Acetobacter syzgii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.11759，保藏日期为：2015年11月30日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌CGMCC No.11759作为食品保鲜剂的应用。

分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌CGMCC No.11759作为食品发酵剂的应用。

分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌CGMCC No.11759作为食醋酿造工业或维生素C发酵剂的应用。

本发明的优点和积极效果是：

本发明还进行了人工接种模拟酸粥发酵研究，测定了发酵48h过程中酸粥的菌浓、pH、18种自由氨基酸的变化。初步证明该醋酸菌可以作为出发菌株引导酸粥发酵，可以作为酸粥工业化生产的候选菌株。

本发明使用GYC筛选分离培养基分离到糜米酸粥中的一株醋酸菌，经过革兰氏染色鉴定该菌株为革兰氏阴性的杆状细菌，经16S rRNA基因鉴定得出该菌是一株醋酸菌，名称为Acetobactersyzgii。

本发明分离得到的醋酸菌Acetobactersyzgii作为单一菌株进行酸粥发酵，可使得酸粥的菌株数量、pH、自由氨基酸含量等指标达到天然发酵酸粥水平。可初步确定该菌可以作为酸粥发酵的出发菌株。

附图说明

图1分离菌株在GYC分离培养基上的菌落形态；

图2分离菌株的革兰氏染色结果；

图3分离细菌16S rRNA基因扩增电泳图；

图4分离菌株的生长曲线；

图5-1人工模拟发酵过程中菌量变化柱状图；

图5-2人工模拟发酵过程中pH变化柱状图；

图6-1人工模拟发酵过程中自由氨基酸变化柱状图；

图6-2人工模拟发酵过程中各种氨基酸变化柱状图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领 域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明从中国传统发酵食品糜米酸粥中，分离得到一株革兰氏阴性细菌，分别进行了分子鉴定研究和人工模拟发酵研究。对其16S rRNA基因测序分析结果显示，与醋酸菌Acetobacter syzgii 16S rRNA基因高度同源。分类命名为：Acetobacter syzgii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11759，保藏日期为：2015年11月30日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述菌株的筛选和生理特性试验过程如下：

1.材料与方法

1.1样品、仪器、试剂与培养基

样品来源：发酵酸粥样品采集自山西省忻州市河曲县常年制作酸粥的家庭。

仪器：使用酶标仪(Synergy H1,Biotech,美国)测定菌株的生长曲线、使用Sartorius pH计测定酸粥样品及培养物的酸碱度。酸粥样品经离心后取上清测定自由氨基酸的含量。使用超高效液相色谱仪(H-Class，Waters，美国)测定自由氨基酸含量。

试剂：OMIGA细菌基因组提取试剂盒，结晶紫、番红、琼脂糖、核酸染料购自宝生物工程(大连)有限公司。碳酸钙，酵母膏，葡萄糖，琼脂粉，无水乙醇等试剂为分析纯，购自天津市光复有限公司。

醋酸菌GYC分离培养基：碳酸钙20g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖10g/L，琼脂粉20g/L，121℃20min灭菌，pH 6.0；倒培养基前加入3％无水乙醇和100μg/mL制霉菌素，30℃培养箱培养2-3天。

醋酸菌GYC纯化培养基：碳酸钙20g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖10g/L，琼脂粉20g/L，121℃20min灭菌，pH 6.0；倒培养基前加入3％无水乙醇，30℃培养箱培养2-3天。

醋酸菌GYC液体培养基：酵母膏10g/L，葡萄糖10g/L，琼脂粉20g/L，121℃20min灭菌，pH 6.0；倒培养基前加入3％无水乙醇，30℃培养箱培养2天。

2方法

2.1样品采集

采集样品的容器和用具均已经过高压蒸汽灭菌，在发酵容器中充分搅拌酸粥后进行样品采集，采集的样品酸粥为加入酸浆后发酵24h的发酵液。在室温条件下，上述样品采集需在10min之内完成，并迅速放入有冰袋的保温箱中，并 尽快转移至冰箱中冷藏，尽快进行乳酸菌菌株分离和鉴定。

2.2菌株分离纯化和革兰氏染色

将酸粥样品混匀，用生理盐水对样品进行系列稀释，取0.1mL样品加入0.9mL生理盐水，使用10倍梯度稀释法在GYC分离培养基上进行涂布。从分离平板上选取菌株进行划线纯化，并进行革兰氏染色鉴定。

2.3分离菌株鉴定

分离菌株使用GYC液体培养基于30℃培养箱静置培养48h，菌液DNA提取使用OMIGA细菌提取试剂盒按照其说明书方法进行。使用下列引物27f5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’和1492r5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’对该细菌的16S rRNA基因序列进行PCR扩增。PCR反应条件如下：95℃，10min；94℃，1min；53℃，2min；72℃，1.5min，33个循环；72℃，10min。扩增片段长度为1500bp。符合条带大小的PCR产物交由华大基因公司进行分析测定。

2.4分离菌株生长曲线

将分离菌株单菌落接至3mL GYC液体培养基中于30℃振荡培养48h，将50μL菌液转接至存有200μL GYC培养基的无菌酶标板上，设置三次重复，对照设置为250μL GYC液体培养基。设置酶标仪(Synergy H1,Biotech,USA)恒温30℃，静置培养72h，每10min检测一次OD₆₀₀吸光度值并进行记录，绘制成该菌株的生长曲线。

2.5人工模拟酸粥发酵

糜米培养基的制备：称取原料糜米100g于烧杯中淘洗干净，并用纱布沥干水分，晾干，放于1L蓝盖瓶中，121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，向蓝盖瓶中加入900mL已高压灭菌的蒸馏水。

菌株的准备：将菌株单菌落在GYC固体纯化培养基上活化培养，挑取活化好的单菌落接入5mLGYC液体培养基，于30℃振荡培养48h，然后以5％的接种量将培养好的菌液转接入100mL的GYC液体培养基中，培养至OD₆₀₀达到0.4-0.6时，将上述菌液以10％转接量转接至当天准备好的糜米培养基中，转接量为100mL(10％)。30℃培养箱静置发酵，每株菌的实验设置三个重复。

人工接种酸粥发酵过程：每天将发酵瓶中的米捞出，添加新米(经过淘洗、滤干、121℃高压灭菌20min)，并在换米前测定pH值、自由氨基酸、醋酸菌数量。如此连续发酵48h，绘制连续发酵48h内pH值、自由氨基酸含量和醋酸菌数量的柱状图。

发酵过程中菌浓、pH和自由氨基酸的测定：糜米培养基预煮杀菌后取出10mL米汤，测定pH值后于-80℃冻存，用于批量测定自由氨基酸。此为发酵0h的pH值和自由氨基酸的值。准备转接的菌液进行稀释涂布，记录发酵初始的菌 浓。发酵过程中，每24h参照发酵前的作法测定pH值，-80℃冻存发酵样品用于统一测定自由氨基酸，并在GYC分离培养基上涂布以分离确定当天发酵过程中的菌株数量。

3.结果

3.1菌株形态与革兰氏染色

从山西省忻州市河曲县某家庭自制的糜米酸粥中分离观察到一些形态一致的细菌，这些菌落在GYC培养基上形态为表面湿润光滑，微黄色，略透明，边缘整齐，直径2-3mm，有透明圈。选取这些菌落连续分离纯化，得到初筛菌株保藏备用，菌株形态见图1。该菌种经革兰氏染色结果显示，该菌为革兰氏阴性菌株，呈短杆状，标记为H20-b，结果如图2所示。

3.2菌株的分子鉴定

由分离菌株基因组DNA扩增的16S rRNA基因序列(1500bp)见图3。PCR扩增产物纯化后直接进行测序。测序结果在Genbank上进行blast比对，结果显示与醋酸菌Acetobactersyzgii菌株16S rRNA基因高度同源。分离鉴定的纯菌已在中国微生物菌种保藏中心进行保藏，保藏号(CGMCC No.)为11759。

3.3菌株生长曲线的测定

菌株在酶标仪中30℃培养72h，每10min测定一次OD₆₀₀吸光度值，并绘制生长曲线。结果如图4所示。该菌有4h的延迟期，对数期时间较长，到36h达到稳定期，稳定期OD>600值达到0.57。

3.4分离菌株应用于酸粥发酵

从模拟发酵结果可以看出，发酵24h醋酸菌数量由10⁴cfu/mL增长到10⁶cfu/mL，发酵48h增加到10⁷cfu/mL,见图5-1。pH的变化趋势为，发酵0h的pH值为6.43±0.08，接种24h后pH降为4.73±0.02，48h后pH为4.68±0.03，24h之后基本保持稳定，见图5-2。

发酵24h自由氨基酸总量由107.5μg/mL上升到174.7μg/mL，发酵48h上升到214.4μg/mL整体呈现上升趋势，见图6-1。对发酵过程中18种氨基酸(半胱氨酸未检出，未图示)的含量进行了检测，经过醋酸菌的发酵作用各种氨基酸均有所增加，见图6-2，自由氨基酸中含量较高的两种氨基酸为丙氨酸(Ala)和谷氨酸(Glu)。

使用我们分离得到的醋酸菌Acetobactersyzgii作为单一菌株进行酸粥发酵，可使得酸粥的菌株数量、pH、自由氨基酸含量等指标达到天然发酵酸粥水平。可初步确定该菌可以作为酸粥发酵的出发菌株，我们需要更多的实验和研究来证明单一菌株发酵和混合菌株发酵对酸粥的生化指标、营养成分和口味等方面影响的差异。

分离菌株的测序结果如下：

GGGTTCGCTCACCGGCTTAAGGTCAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCACCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTAGAGATCAGCACGATGTCACCATCTAGCTTCCCACTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGACATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTGTCACCGGCAGTCTCTCTAGAGTGCCCACCCAAACATGCTGGCAACTAAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTAGAGGTCCCTTGCGGGAAATATCCATCTCTGAATACAGCCTCTACATTCAAGCCCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTGTGCTTAACGCGTTAACTGCGACACTGAATGACAAAGTCACCCAACATCTAGCACACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTAATGAGCCAGGTTGCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCTTCCCAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTGGGAATTCCACAACCCTCTCTCACACTCTAGTCTGTACGTATCAAATGCAGCTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTGTACAAACCGCCTACACGCCCTTTACGCCCAGTCATTCCGAGCAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTACGGGTACCGTCATCATCGTCCCTCGTCGAAAGTGCTTTACATCCGAAGACCTTCTCACACAC