(2S,3S,4R,9E)-2-(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺-十八碳-1,3,4-三醇及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种源于东洋参的新化合物(2S,3S,4R,9E)‑2‑[(2′R)‑2′‑羟基‑二十九碳酰胺]‑十八碳‑1,3,4‑三醇，其结构式为

说明书

技术领域

本发明涉及中药有效成分提取技术领域，特别涉及源于东洋参的(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇及其制备方法和应用。

背景技术

东洋参药材是比较名贵的一种中药，可用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹风疹、咽喉肿痛等疾病；东洋参药材中的对人体有益成分很多，但价格昂贵，且食疗效果并不显著，近些年相关学者对东洋参进行了大量的研究，研究表明东洋参药材的提取物在心血管疾病中发挥，具有调血脂、预防动脉粥样硬化、防治冠心病等作用，目前成功分离出的有效化合物很少，因此，研究从东洋参药材分离出药效高且持久稳定和价格低廉的药物迫在眉睫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种源于东洋参的(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇的化合物，还提供了该化合物作为制备调血脂、预防动脉粥样硬化、防治冠心病方面药物的用途，还提供了该化合物的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇的结构式为：

本发明提供的(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇的制备方法，包括如下步骤：

(a)将东洋参药材饮片用乙醇浸泡，获得东洋参乙醇溶液；

(b)将步骤(a)得到的东洋参乙醇溶液用水浴回流提取，提取2次，合并2次得到东洋参提取液；

(c)对步骤(b)得到的东洋参提取液进行减压浓缩，回收乙醇，得到较纯的东洋参浸膏；

(d)向步骤(c)得到的东洋参浸膏中加入适量水混合分散，得到东洋参水溶液；

(e)将步骤(d)得到的东洋参水溶液依次用3倍体积的石油醚、3倍体积的氯仿、3倍体积的乙酸乙酯、3倍体积的正丁醇进行萃取提纯，得到4个不同极性的萃取液；

(f)将步骤(e)中得到的乙酸乙酯萃取液，拌样，上柱，采用硅胶柱色谱法分离，以氯仿-甲醇(100:0→0:100)系统梯度洗脱，通过TLC检测，将洗脱液为50:50时的相似馏分合并后浓缩，得到浓缩液Ⅱ，进一步用Sepadex-LH20色谱柱分离，洗脱剂为15％的甲醇水溶液，共得到3段馏分，将第1段经减压浓缩、重结晶方法得到白色粉末化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的混合物，即(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇和2-羟基二十五烷酸。

2-羟基二十五烷酸化合物的结构式为：

作为进一步的技术方案，步骤(a)中乙醇的浓度为90～95％。

作为进一步的技术方案，步骤(b)中水浴的温度为60℃～80℃，回流提取的时间为5h～8h。

作为优选的技术方案，步骤(b)中水浴的温度为70℃，回流提取的时间为6h。

发明人发现本发明的(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇和2-羟基二十五烷酸对ACAT具有选择性抑制的作用，可以作为制备调血脂、预防动脉粥样硬化、防治冠心病的药物。

本发明提供的药物组合物，该组合物含有治疗有效量的(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇或2-羟基二十五烷酸化合物，以及它们药学上可接受的载体。

本发明的有益效果：

1，本发明成功从东洋参药材中制备出了一种结构新颖的(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇化合物，并首次从东洋参药材制备出2-羟基二十五烷酸化合物。制备方法简单易行，可应用于实验室、工业化并具有环保型的制备方法；该制备方法步骤少及操作简便，得到的两个化合物的产率高、天然无毒性。

2，本发明提取的化合物(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇化合物和2-羟基二十五烷酸化合物具有抑制胆固醇酰基转移酶的活性，能够有效用于预防和治疗血脂、动脉粥样硬化、冠心病等疾病，具有良好的研究开发和应用前景。

附图说明

图1为本发明化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的ESI-MS(负极性)图；

图2为本发明化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的ESI-MS(负极性)图；

图3为本发明化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的ESI+MS(正极性)图；

图4为本发明化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的¹H-NMR全图；

图5为本发明化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的¹H-NMR局部放大图；

图6为本发明化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的¹³C–NMR全图；

图7为本发明化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的¹³C–NMR局部放大图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇和2-羟基二十五烷酸的制备

将东洋参药材饮片20kg，用90％乙醇浸泡，用60℃水浴回流提取8h，提取2次，合并2次得到东洋参提取液；经减压浓缩，回收乙醇，得到较纯的东洋参浸膏。加入适量水将浸膏水混悬后；依次用3倍体积的石油醚、3倍体积的氯仿、3倍体积的乙酸乙酯、3倍体积的正丁醇进行萃取提纯，得到4个不同极性部位的萃取液，经减压浓缩后，得到石油醚部位90g，氯仿部位90g，乙酸乙酯部位78g，正丁醇部位290g。

将乙酸乙酯部位，拌样，上柱，采用硅胶柱色谱法分离，以氯仿-甲醇(100:0→0:100)系统梯度洗脱，通过TLC检测，将洗脱液为50:50时的相似馏分合并后浓缩，得到浓缩液Ⅱ，进一步用Sepadex-LH20色谱柱分离，洗脱剂为15％的甲醇水溶液，共得到3段馏分，将第1段经减压浓缩、重结晶方法得到白色粉末化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的混合物。

实施例2

(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇和2-羟基二十五烷酸的制备

将东洋参药材饮片20kg，用95％乙醇浸泡，用70℃水浴回流提取6h，提取2次，合并2次得到东洋参提取液；经减压浓缩，回收乙醇，得到较纯的东洋参浸膏。加入适量水将浸膏水混悬后；依次用3倍体积的石油醚、3倍体积的氯仿、3倍体积的乙酸乙酯、3倍体积的正丁醇进行萃取提纯，得到4个不同极性部位的萃取液，经减压浓缩后，得到石油醚部位98g，氯仿部位100g，乙酸乙酯部位80g，正丁醇部位300g。

将乙酸乙酯部位，拌样，上柱，采用硅胶柱色谱法分离，以氯仿-甲醇(100:0→0:100)系统梯度洗脱，通过TLC检测，将洗脱液为50:50时的相似馏分合并后浓缩，得到浓缩液Ⅱ，进一步用Sepadex-LH20色谱柱分离，洗脱剂为15％的甲醇水溶液，共得到3段馏分，将第1段经减压浓缩、重结晶方法得到白色粉末化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的混合物。

实施例3

(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇和2-羟基二十五烷酸的制备

将东洋参药材饮片20kg，用95％乙醇浸泡，用80℃水浴回流提取5h，提取2次，合并2次得到东洋参提取液；经减压浓缩，回收乙醇，得到较纯的东洋参浸膏。加入适量水将浸膏水混悬后；依次用3倍体积的石油醚、3倍体积的氯仿、3倍体积的乙酸乙酯、3倍体积的正丁醇进行萃取提纯，得到4个不同极性部位的萃取液，经减压浓缩后，得到石油醚部位95g，氯仿部位95g，乙酸乙酯部位80g，正丁醇部位296g。

将乙酸乙酯部位，拌样，上柱，采用硅胶柱色谱法分离，以氯仿-甲醇(100:0→0:100)系统梯度洗脱，通过TLC检测，将洗脱液为50:50时的相似馏分合并后浓缩，得到浓缩液Ⅱ，进一步用Sepadex-LH20色谱柱分离，洗脱剂为15％的甲醇水溶液，共得到3段馏分，将第1段经减压浓缩、重结晶方法得到白色粉末化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的混合物。

实施例4

化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的结构表征

化合物Ⅰ的结构确证：

为白色无定形粉末(醋酸乙酯)。如图1和图2所示，ESI-MS给出m/z750.2[M-H]⁺的准分子离子峰，结合NMR的碳谱和氢谱数据，确定该化合物的相对分子质量为751，分子式为C₄₇H₉₃O₅N，不饱和度为2。依据其¹H>13C>

如图4和图5所示，在¹H>5D₅N,600MHz)图谱中，δ:8.58(1H,d,N-H),5.52(2H,m,H-9,10),5.12(1H,m,H-2),4.61(1H,dd,H-2′),4.51(1H,dd,Ha-1),4.42(1H,dd,Hb-1),4.34(1H,m,H-3),4.28(1H,m,H-4),1.28(m,长链CH₂),0.84(6H,t,J＝6.6,CH₃×2)。如图6和图7所示，¹³C-NMR(C₅D₅N,150MHz)δ:175.1(C-1′),,130.7(C-9),130.6(C-10),76.7(C-3),72.8(C-4),72.3(C-2′),61.9(C-1),52.8(C-2),35.6(C-3′),33.7(C-5),26.6(C-6),25.7(C-4′),14.2(CH₃)。¹H>13C>2)、δ52.8(CH-NH)和δ5.12(1H,m)以及四个连氧碳信号δ76.7、72.8、72.3、61.9显示有酰胺键和四个羟基存在。以上数据表明，该化合物为梢氨醇类的神经酰胺，碱基链部分为含有一个双键的1,3,4-三羟基梢氨醇。分子式为C₄₇H₉₃O₅N，扣除长链碱部分，分子的长链酸应为2-羟基二十九烷酸。考虑到生源途径和神经酰胺类化合物的立体位阻，确定绝对构型为2S,3S,4R,2′R

化合物Ⅱ的结构确证：

白色粉末(醋酸乙酯)；白色粉末(醋酸乙酯)。如图1、图2和图3所示，ESI-MS给出m/z399.3[M+H]⁺、421.2[M+Na]⁺、397.2[M-H]^-的准分子离子峰，结合NMR的碳谱和氢谱数据，确定该化合物的相对分子质量为398，分子式为C₂₅H₅₀O₃，不饱和度为1。依据其¹H>13C>

如图4和图5所示，在¹H>5D₅N,600MHz)图谱中，δ:1.29(m,长链CH₂),0.84(3H,t,J＝7.2,CH₃)。如图6和图7所示，¹³C-NMR(C₅D₅N,150MHz)δ:178.1(C-1),71.3(C-2),35.4(C-3),25.8(C-4),29.5～29.9(长链CH₂),29.4(C-22),32.0(C-23),22.8(C-24),14.2(CH₃)。¹H>13C>13C>

实施例5

化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对ACAT影响的实验

酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一合成胆固醇酯的酶，在细胞和生物体胆固醇代谢平衡中起非常重要的作用。ACAT合成的胆固醇酯主要以脂滴形式储存于胞浆中。

RAW264.7细胞以细胞数2×10⁵/孔铺于24孔板，于37℃、5％CO₂条件下过夜培养后，换为无血清DMEM培养基(100μL/孔)。将细胞分为空白对照组(不加Ox-LDL和待测样品)、模型组(加入80μg·mL^-1的Ox-LDL和100μg·mL^-1的Ac-LDL)，加药组(加入80μg·mL^-1的Ox-LDL和100μg·mL^-1的Ac-LDL以及待测化合物)，细胞贴壁后，加入终浓度为80μg·mL^-1的ox-LDL100μg·mL-1的Ac-LDL到模型组和加药组，作用24h后，裂解细胞，收集蛋白。BCA试剂盒进行蛋白定量。ACAT1检测试剂盒测定ACAT1含量。ACAT1含量＝实测ACAT1浓度/总蛋白含量ACAT1抑制率＝(模型组含量-加药组含量)/(模型组含量-空白组含量)*100％。

数据结果如下表所示：

从上表中可以看出，(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇化合物和2-羟基二十五烷酸化合物的混合物的细胞活性为119.13％，ACAT抑制率为65.95％；结果表明，(2S,3S,4R,9E)-2-[(2′R)-2′-羟基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇和2-羟基二十五烷酸的混合物对ACAT具有选择性抑制的作用，能够调血脂、预防动脉粥样硬化、防治冠心病。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。