具有糖化功能的基因工程酵母及其制法和应用

摘要

本发明公开了一种具有糖化功能的基因工程酵母及其制法和应用。本发明还公开了一种编码葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，为(a)所述的核苷酸序列的编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；或(b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥80％相同性。本发明的基因工程酵母，基因组中整合有该核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列，为具有高效糖化功能的酿酒酵母，在不额外添加糖化酶进行酒精发酵时，可获得高产量的乙醇。

说明书

技术领域

本发明涉及具有糖化功能的基因工程酵母及其制法和应用。

背景技术

乙醇是食品、化工等工业的重要原料和可再生燃料。纤维素乙醇生产技术目前尚处在开发中，未能满足商业化的要求。市场上在售的乙醇主要是以玉米和甘蔗为原料进行生产的，原料分别富含淀粉和糖分。在我国，除了玉米，小麦和木薯等富含淀粉的原料也被用于生产乙醇。改进现有技术，降低淀粉质原料转变为乙醇的加工成本非常重要。

目前，淀粉质原料生产乙醇需要经过多个环节，如：粉碎、液化、糖化、发酵、蒸馏等。其中，糖化的过程需要添加糖化酶(即葡萄糖淀粉酶，EC 3.2.1.3)，把淀粉降解为葡萄糖。该酶可以从市场上直接购买。生产每吨乙醇需要的糖化酶成本约100元。如果发酵菌种具备葡萄糖淀粉酶功能，那么糖化酶的用量可以减少。鉴于此，为了降低乙醇的生产成本，有必要开发具有糖化功能的酿酒酵母。

从80年代中期开始，各种来源的葡萄糖淀粉酶被克隆到酿酒酵母中，构建具备糖化功能的酵母菌株。

1985年Cetus公司在Science上发表论文，报道了利用基因工程技术把来源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的葡萄糖淀粉酶克隆到酿酒酵母中的工作，重组菌株能够以淀粉为唯一碳源进行生长(Science,1985.228(4695):p.21-6)。除泡盛曲霉来源外，米根霉(Rhizopus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡萄糖淀粉酶也常被使用。为了增加糖化淀粉的能力，α-淀粉酶(EC3.2.1.1)随后也被克隆到酿酒酵母中，与葡萄糖淀粉酶协同糖化淀粉。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、德巴利酵母(Debaryomyces occidentalis)和大麦(Hordeum vulgare)等是α-淀粉酶的常用来源。有报道揭示，牛链球菌而非嗜热脂肪芽孢杆菌来源的α-淀粉酶与米根霉葡萄糖淀粉酶的共表达能使重组菌以生淀粉为原料进 行糖化和发酵。这是因为嗜热脂肪芽孢杆菌来源的α-淀粉酶不具有淀粉结合结构域，其与米根霉葡萄糖淀粉酶的共表达只能使重组菌以可溶性淀粉为原料进行糖化和发酵。此外，脱支酶(E.C.3.2.1.33普鲁兰酶和异淀粉酶)和麦芽糖转运蛋白也被克隆到酿酒酵母中用于增强淀粉的糖化和发酵。

近期，主要有两个课题组继续从事这方面的工作，日本Akihiko Kondo教授领导的团队致力于利用表面展示技术构建糖化酵母(Enzyme Microb Technol,2012.50(6-7):p.343-7.)，而韩国Suk Bai教授领导的团队则致力于利用分泌表达技术构建糖化酵母(Biotechnol Lett,2011.33(8):p.1643-8.)。

上述研究多是以基础研究为导向，难以满足工业化应用的要求。例如：使用的宿主为实验室菌株，带有营养缺陷表型，这使得重组菌不够强壮，生长速率和发酵性能低下等问题；多基于2μm质粒表达载体，该质粒的好处是多拷贝，缺点是在非选择压力条件下，很容易丢失。

因此，本领域尚需研发可以满足工业化应用要求的具有高效的糖化功能的酿酒酵母。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高效的糖化功能的酿酒酵母。

本发明的第一方面，提供一种编码葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，所述的核苷酸序列选自下组：

(a)所述的核苷酸序列的编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；

(b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥80％相同性。

在另一优选例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。

本发明的第二方面，提供一种表达载体，包含第一方面所述的核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供一种酵母宿主细胞，所述的酵母宿主细胞含有第二方面所述的表达载体或者基因组中整合有第一方面所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列。

在另一优选例中，所述酵母宿主细胞内不含抗生素抗性基因。

在另一优选例中，所述酵母宿主细胞为酿酒酵母，保藏编号为CCTCC M2014657。

本发明的第四方面，提供一种生产葡萄糖淀粉酶的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在适合表达条件下，培养如第三方面所述的酵母宿主细胞，从而表达葡萄糖淀粉酶；

(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的葡萄糖淀粉酶。

本发明的第五方面，提供一种酵母宿主细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(a)制备三个片段，所述三个片段分别为ENO1p-GA-ENO1t、delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP、ADH1p-GA-PDC1t；

(b)将步骤a)获得的三个片段连接，得到目的质粒pYIE2-2GA-delta；

(c)将步骤b)获得的pYIE2-2GA-delta经NotI线性化后，转化酿酒酵母得到转化子；

(d)消除步骤c)获得转化子培养的菌株中的抗性基因，得到所述重组酵母。

本发明的第六方面，提供第三方面所述的酵母宿主细胞的用途，用于发酵产乙醇。

本发明的第七方面，提供一种生产乙醇的方法，所述方法采用第三方面所述的酵母宿主细胞进行发酵从而生产乙醇。

本发明以酿酒酵母CCTCC M94055为宿主，采用多拷贝整合技术，把糖化酶即葡萄糖淀粉酶整合到基因组上，随后消除抗生素抗性基因，获得的重组酿酒酵母，具有高效的糖化功能。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为pYIE2-2GA-delta质粒图。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入地研究，以酿酒酵母酵母CCTCC M94055为宿主，采用多拷贝整合技术，把糖化酶即葡萄糖淀粉酶整合到基因组上，随后消除抗生素抗性基因。意外发现，获得了具有高效的糖化功能的酿酒酵母，在不额外添加糖化酶进行酒精发酵时，可获得高产量的乙醇。在此基础上，完成了本发明。

本发明获得的具有高效的糖化功能的酿酒酵母1522(Saccharomyces cerevisiae 1522)，于2014年12月23日保藏于位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014657。

表达载体

本发明的表达载体，包含编码葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，所述的核苷酸序列选自下组：

(a)所述的核苷酸序列的编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；

(b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥80％相同性。

在另一优选例中，所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥85％相同性，较佳地，具有≥90％相同性，更佳地，具有≥95％相同性，更佳地，具有≥98％相同性，甚至具有≥99％相同性。

在另一优选例中，，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。

在另一优选例中，所述表达载体的结构为：

ENO1p-GA-ENO1t-PDC1t-GA-ADH1p-delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP

其中GA为权利要求1所述的多核苷酸；ENO1p、ADH1p、TEF1p为启动子；ENO1t、PDC1t、TEF1t为终止子；KanMX为卡那霉素/G418抗性基因片段；delta5’、delta3’为delta片段；pUCori-CEN6/ARS为复制子序列。

酵母宿主细胞

本发明的酵母宿主细胞，含有上述表达载体或者基因组中整合有上述核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列。

在另一优选例中，所述酵母宿主细胞内整合有上述表达载体经NotI线性化的片段。

本发明中，所述酵母宿主细胞内不含抗生素抗性基因。

本发明中，所述酵母宿主细胞为酿酒酵母，保藏编号为CCTCC M 2014657。

本发明的酵母宿主细胞的制备方法，包括以下步骤：

(a)制备三个片段，所述三个片段分别为ENO1p-GA-ENO1t、delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP、ADH1p-GA-PDC1t；

(b)将步骤a)获得的三个片段连接，得到目的质粒pYIE2-2GA-delta；

(c)将步骤b)获得的pYIE2-2GA-delta经NotI线性化后，转化酿酒酵母得到转化子；

(d)消除步骤c)获得转化子培养的菌株中的抗性基因，得到所述重组酵母。

在另一优选例中，所述步骤c)中采用的酿酒酵母的保藏编号为CCTCC M94055。

在另一优选例中，采用以下方法制备delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP：

(i)用Primer 1和Primer 2为引物对，以pYIE2-XKS1-PPP-delta为模板扩增质粒骨架片段，其中，所述质粒骨架片段结构为：

delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP；

(ii)采用BamHI和KpnI双酶切扩增后的质粒骨架片段，得到带有粘性末端的delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP。

在另一优选例中，采用以下方法制备ENO1p-GA-ENO1t：

(i)Primer 3和Primer 4为引物对，以BY4741基因组为模板，扩增ENO1p；Primer 5和Primer 6为引物对，以合成的GA编码序列为模板，扩增GA；Primer 7和Primer 8为引物对，以BY4741基因组DNA为模板，扩增ENO1t；

(ii)混合步骤i)得到的三个片段并作为模板，以Primer 3和Primer 8为引物对进行overlap PCR，扩增ENO1p-GA-ENO1t片段；

(iii)采用KpnI和NdeI双酶切步骤ii)扩增后得到的片段，得到带有粘性末端的ENO1p-GA-ENO1t片段。

在另一优选例中，采用以下方法制备ADH1p-GA-PDC1t片段：

(i)Primer 9和Primer 10为引物对，以BY4741基因组为模板，扩增ADH1p；Primer 11和Primer 12为引物对，以合成的GA编码序列为模板，扩增GA；Primer13和Primer 14为引物对，以BY4741基因组为模板，扩增PDC1t；

(ii)混合步骤i)得到的三个片段并作为模板，以Primer 9和Primer 14为引物对进行overlap PCR，扩增ADH1p-GA-PDC1t片段；

(iii)采用NdeI和BamHI双酶切步骤ii)扩增后得到的片段，得到带有粘性末端的ADH1p-GA-PDC1t片段。

在另一优选例中，采用以下方法消除步骤c)获得转化子培养的菌株中的抗性基因：

(i)向所述转化子培养获得的菌株中转入pSH47-hph，使用半乳糖诱导Cre酶表达，消去G418抗性；

(ii)通过传代培养消去pSH47-hph质粒。

应用

本发明的酵母宿主细胞，可以用于生产葡萄糖淀粉酶或用于发酵产乙醇。

在另一优选例中，所述发酵是以玉米、甘蔗、小麦、木薯中的一种或两种以上的组合物为原料进行的发酵。

本发明提供的生产葡萄糖淀粉酶的方法，包括以下步骤：

(a)在适合表达条件下，培养本发明的酵母宿主细胞，从而表达葡萄糖淀粉酶；

(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的葡萄糖淀粉酶。

本发明提供的生产乙醇的方法，采用本发明所述的酵母宿主细胞进行发酵从而生产乙醇。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的有益之处在于：

(1)本发明构建一种新型的重组酵母。

(2)本发明的重组酵母，具有高效的糖化功能，用于发酵产乙醇，可以有效降低乙醇的生产成本。

(3)发酵获得的酵母菌体，可以作为饲料添加剂用于饲养家畜家禽等动物。其中存在的糖化酶有助于促进动物的消化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

通用方法

本发明中参考以下文献和仪器实施下文实施例相应实验。

1.大肠杆菌培养、感受态细胞制备和转化、质粒抽提、限制性内切酶酶切、PCR等分子生物学操作参照《分子克隆实验指南》(Sambrook等,第二版，1996)。

2.酵母的培养、转化等操作，参照《酵母遗传学方法实验指南》(Adam等2000)。

3.乙醇含量检测参照使用气相色谱法(木糖发酵液中乙醇的气相色谱法测定酿酒2005年01期)。

4葡萄糖含量测定使用葡萄糖分析仪(山东省科学院)进行。

实施例1

构建目的质粒pYIE2-2GA-delta

按照来源于Saccharomycopsis fibuligera(AJ311587，见于网页： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/19032256)的糖化酶序列编码序列按照酿酒酵母的密码子优化后，做全基因合成。(以下简写为GA)

1)用Primer 1(SEQ ID NO：1)和Primer 2(SEQ ID NO：2)为引物对，以pYIE2-XKS1-PPP-delta为模板，进行常规PCR扩增，从而获得扩增产物。对所述扩增产物用BamHI和KpnI进行双酶切，得到片段一。

2)Primer 3(SEQ ID NO：3)和Primer 4(SEQ ID NO：4)为引物对，以BY4741(购自EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functional analysis)基因组为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物，记为扩增产物ENO1p；Primer 5(SEQ ID NO：5)和Primer 6(SEQ ID NO：6)为引物对，以合成的GA编码序列(SEQ ID NO：15)为模板，扩增GA；Primer 7(SEQ ID NO：7)和Primer 8(SEQ ID NO：8)为引物对，以BY4741基因组DNA为模板，扩增ENO1t。

混合3个上述扩增产物为模板，以Primer 3和Primer 8为引物对，进行overlap PCR，扩增ENO1p-GA-ENO1t片段；KpnI和NdeI双切备用，得到片段二。

3)Primer 9(SEQ ID NO：19)和Primer 10(SEQ ID NO：10)为引物对，以BY4741基因组为模板，扩增ADH1p；Primer 11(SEQ ID NO：11)和Primer 12(SEQ ID NO：12)为引物对，以合成的GA编码序列为模板，扩增GA；Primer 13(SEQ ID NO：13)和Primer 14(SEQ ID NO：14)为引物对，以BY4741基因组为模板，扩增PDC1t。

混合3个片段为模板，以Primer 9和Primer 14为引物对，进行overlap PCR,扩增ADH1p-GA-PDC1t片段；NdeI和BamHI双切备用，得到片段三。

4)上述三步获得的3个片段(片段一、片段二、片段三)，连接得到目的质粒pYIE2-2GA-delta，结构如图1所示。该质粒带有两个拷贝的GA片段用于糖化酶的表达，带有delta片段用于整合于酿酒酵母的GA位点。

在该质粒中，含外源GA位点的构建物结构如下：

ENO1p-GA-ENO1t-PDC1t-GA-ADH1p-delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP

其中GA为权利要求1所述的多核苷酸；ENO1p、ADH1p、TEF1p为启动子；ENO1t、PDC1t、TEF1t为终止子；KanMX为卡那霉素/G418抗性基因片段；delta5’、delta3’为delta片段；pUCori-CEN6/ARS为复制子序列。

本实施中所选用的pYIE2-XKS1-PPP-delta质粒构建过程如下：

1.PCR扩增整合位点同源臂序列：

引物对1/2、7/8分别以BY4742基因组为模板，PCR扩增得到上下游同源臂序列。

2.PCR扩增大肠杆菌和酿酒酵母复制子序列：

引物对3/4、5/6分别以pSH47(可获自EUROSCARF,EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functional Analysis)为模板，PCR扩增得到Ecori和Scori序列。

3.OE-PCR扩增得到delta-up-EcoriScori-delta-dn片段。

4.PCR扩增得到loxP-G418-loxP片断

引物对9/10以pUG6(可获自EUROSCARF)为模板，扩增得到两端带有loxP的G418抗性表达盒。

5.PCR扩增得到ADH1p-XKS 1-XKS1t片断

引物对11/12以模板(CIBTS0573基因组DNA(参见BMC Biotechnology 2013,13:110)扩增得到XKS1表达盒。

6.PCR扩增得到TPI1p-TAL1-TAL1t片断

引物对13/14以模板(CIBTS0573基因组DNA)扩增得到TAL1表达盒。

7.PCR扩增得到PGK1p-RPE1-RPE1t片断

引物对15/16以模板(CIBTS0573基因组DNA)扩增得到RPE1表达盒。

8.PCR扩增得到FBA1p-TKL1-TKL1t片断

引物对17/18以模板(CIBTS0573基因组DNA)扩增得到TKL1表达盒。

9.PCR扩增得到PDC1p-RKI1-RKI1t片断

引物对19/20以模板(CIBTS0573)扩增得到RKI1表达盒。

10.体内组装3-9中得到的7个片断，得到质粒pYIE2-Xks1-PPP-delta

上述引物对1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16和17/18的序列如表1所示。

将上述7个片断混合后转化BY4741，使用Methods Enzymol.2012；517:203-24的方法进行组合，获得正确pYIE2-Xks1-PPP-delta质粒。值得注意的是，该质粒中XKS1、TAL1等基因表达框片段，没有进入后续工作步骤，只有载体骨架序列delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP进入了后续试验步骤。

表1引物序列

实施例2

重组酵母菌株的构建

pYIE2-2GA-delt经过NotI线性化后，回收目的片段。采用常规方法转化方法，用该回收的片段对酵母CCTCC M94055进行重组转化，从而获得带有pYIE2-2GA-delt的酵母菌株转化子。对于转化子菌落经PCR和测序验证为所需。

按常规文献(BMC Biotechnology 2013,13:110)中所述方法，向上述转化子培养获得菌株中转入pSH47-hph(BMC Biotechnology 2013,13:110)，使用半乳糖诱导Cre酶表达，消去G418抗性，而后通过传代培养消去pSH47-hph质粒，最终获得没有抗性的菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCC M 2014657。

实施例3

各菌株的试管发酵

以木薯干做粉碎处理，过筛60目，按照20g/l培养基的称取，作为碳源进行乙醇发酵。培养基中同时需加入YP(酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l)作为氮源。具体实验操作，无特别说明之处参照：玉米生料发酵生产乙醇的研究，食品与发酵工业,2008年02期

实验培养基：

第一组：木薯干粉碎样品，灭菌，加入YP

第二组：木薯干粉碎样品，按照20g/l培养基的称取，淀粉酶处理，灭菌，加入YP。

第三组：木薯干粉碎样品，按照20g/l培养基的称取，淀粉酶处理，糖化酶处理，灭菌，加入YP。

实验步骤：

(1)取平板上的菌落接于YPD20试管中培养24h，30℃，220rpm；

(2)试管中菌液稀释20倍，测定OD600，按照0.5g/l的接种量接于上述3种培养基中进行厌氧培养，试管装液量5ml，30℃，250rpm。

(3)培养28h，取样测定乙醇浓度和葡萄糖。

实验结果如表2所示。

表2各菌株在木薯干样品中厌氧试管发酵数据

结果表明：

1在木薯干粉碎样品实验中，本发明获得的菌株和初始菌株相比，实现乙醇产量从无到有。

2在淀粉酶处理的样品实验中，本发明获得的菌株和初始菌株相比，产量得到较大提升。

3在淀粉酶+糖化酶同时处理的样品实验中，本发明获得的菌株和初始菌株相比，产量得到较大提升。

实施例4

菌株进行发酵罐发酵。

参照酿酒科技2005年第1期安琪超级酿酒干酵母在酒精浓醪发酵中的应用，以玉米粉为原料进行酒精发酵。发酵前分别添加或者不添加糖化酶进行实验。

表3各菌株酒精产量

结果显示，在添加糖化酶时，各菌株产量基本相同。在不添加糖化酶时，本发明获得的菌株产量大幅提高。

已报道的具有糖化酶活性的酵母，用于发酵产乙醇时，乙醇产量为约3％。近期美国Mascoma公司通过在酿酒酵母中表达异源葡萄糖淀粉酶，成功开发了糖化 酵母。该酵母用于燃料乙醇的生产，可以减少约1/3糖化酶的用量，为乙醇生产商节省了成本。Mascoma公司与Lallemand公司合作，成功地在市场上推广了该糖化酵母，商品名“”。但是Mascoma公司开发的这种糖化酵母，乙醇产量提高到至多为4％。

此外，在不添加糖化酶进行发酵罐发酵时，采用优化前GA获得的重组酵母与本发明采用优化后的GA获得的重组酵母相比，产量仅为其约1/4。

可见，本发明采用优化后的GA获得的重组酵母，可在不添加糖化酶进行发酵时，大幅提高乙醇的产量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。