公开/公告号CN105985960A
专利类型发明专利
公开/公告日2016-10-05
原文格式PDF
申请/专利权人 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心;
申请/专利号CN201510086558.0
申请日2015-02-17
分类号C12N15/113;C12N15/11;C12N15/867;C12N15/55;A61K48/00;A61K31/713;A61K31/7088;A61P35/02;G01N27/62;
代理机构上海弼兴律师事务所;
代理人薛琦
地址 200127 上海市浦东新区东方路1678号血液楼7楼
入库时间 2023-06-19 00:35:44
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-12-06
授权
授权
2017-07-07
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/113 申请日:20150217
实质审查的生效
2016-10-05
公开
公开
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及治疗或预防急性白血病耐药复发的药物及其应用。
背景技术
儿童急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)是儿童期常见的恶性血液系统肿瘤疾病,是我国儿童因病死亡的重要原因之一。尽管在过去几十年经过众多努力后,儿童ALL的治疗和预后已有显著改善,但仍有15%~20%的患儿会复发,一旦复发,治愈率不足40%,复发一直是造成儿童ALL治疗失败和死亡的首要因素。复发问题日益成为国内外儿童ALL研究的热点和焦点。
儿童ALL治疗过程中,化疗是诱导缓解和缓解后治疗的主要手段之一。目前临床上常用的化疗药物通常是利用核苷酸类似物破坏DNA、RNA的合成,从而导致DNA损伤诱导肿瘤细胞凋亡。儿童ALL诱导缓解阶段,通过大剂量药物的联合化疗,有90%的病人会得到缓解,缓解后会通过低剂量的化疗药物来维持治疗,在维持治疗期主要是通过口服6-巯基嘌呤(6-MP)或6-巯鸟嘌呤(6-TG),肿瘤细胞需要耐受6-MP/6-TG的作用才会积累复发。最近Adolfo Ferrando和William L Carroll的研究小组利用二代测序技术对耐药复发的白血病患者的样本进行检测,发现复发的ALL细胞中的5’-核苷酸酶II(NT5C2)基因存在突变,该基因负责编码与核苷酸及核苷酸类似药物6-巯基嘌呤(6-MP)和6-巯鸟嘌呤(6-TG)的代谢相关酶,在ALL耐药复发中的突变比例约为10%。儿童ALL的耐药复发并非是一个基因的单碱基突变可以解释的,寻找复发相关的遗传学变异仍是目前儿童ALL耐药复发研究的重点和难点,与之相应的检测与治疗手段也因此比较缺乏。
PRPS1基因编码磷酸核糖焦磷酸合成酶,是细胞内嘌呤代谢合成途径的第一个限速酶。PRPS1催化5-磷酸核糖和ATP的反应,生成AMP和PRPP(5-磷酸核糖-1-焦磷酸。PRPP经过一系列酶催化反应后生成次黄嘌呤核苷酸(IMP),IMP进一步转变为(d)ATP和(d)GTP等DNA和RNA合成的原料。细胞内PRPP的含量过高或者过少,都可能引起以它为底物或者调节物的代谢通路异常,导致疫病的发生。目前发现PRPS1的突变与疾病相关,如非综合症型遗传性感音神经性耳聋(X-linked nonsyndromicsensorineural deafness,DFN2)、进行性神经病性肌萎缩综合症(X-linkedCharcot-Marie-Tooth disease-5,CMTX5)等。PRPS1突变有功能获得性突变(Gain of function),如D183H、A190V、D52H等,也有功能缺失性突变(Reduced function),如A87T、M115T、I290T等。但到目前为止在肿瘤中PRPS1还没有发现突变。
洛美曲沙(Lometrexol),CAS号106400-81-1分子式C21H25N5O6,分子量443.45,结构式如下所示:
洛美曲沙是一种叶酸拮抗剂(antifolate),其被还原性叶酸载体与叶酸受体运输进入细胞后可以抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰基转移酶(GART)的活性,GART是嘌呤从头合成途径所中的关键酶。该药物作为一种潜在的抗肿瘤药物对针对其他抗肿瘤药物产生抗药性的一些细胞系也有效果。该药物目前在外国已经完成二期临床实验,但至今尚没有任何关于该药物在预防和治疗急性淋巴细胞白血病的耐药复发中的报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题:针对现在儿童ALL的耐药复发检测与治疗手段的较为缺乏的问题,本发明提供了预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物的靶标、治疗急性白血病耐药复发的RNA药物和嘌呤从头合成途径中所有酶中的一种或多种酶的抑制剂在制备预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物中的应用。本发明还提供了一种评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒及其在评估儿童ALL耐药复发风险中的应用。本发明对后续临床的急性淋巴细胞白血病复发早期的基因诊断和个体化治疗有重要的指导意义。
本发明技术方案之一:一种预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物的靶标,所述靶标为嘌呤从头合成途径中所有酶中的一种或多种。
本发明中,所述靶标较佳地为嘌呤从头合成途径中选自PRPS1、PRPS2、PPAT、PFAS、GART、ATIC、PAICS和ADSL中的一种或多种
本发明技术方案之二:一种siRNA,其特征在于,所述的siRNA包括正义RNA片段与反义RNA片段,所述正义RNA片段包含权利要求1所述靶标的DNA编码的RNA分子,所述正义RNA片段与反义RNA片段能够互补形成双链RNA分子。
本发明技术方案之三:一种向导RNA,其针对的靶标为GART基因,其核苷酸序列如SEQ.ID No.41所示。
本发明技术方案之四:一种慢病毒载体,其特征在于,其含有如本发明技术方案之三所述向导RNA的DNA序列和Cas9基因。
本发明中,所述慢病毒载体的空载为本领域常规,较佳地为基于HIV-1的慢病毒载体,更佳地为购自addgene的lentiCRISPR载体。
本发明技术方案之五:一种慢病毒,其由如本发明技术方案之四所述慢病毒载体在慢病毒包装质粒的辅助下在细胞系中经病毒包装而成。
本发明中,所述慢病毒包装质粒为本领域常规,较佳地为psPAX2与pMD2.G,所述细胞系为本领域常规,较佳地为HEK293T细胞系。
本发明中,所述病毒包装为本领域常规,较佳地为将所述下调GART基因表达的慢病毒载体与所述慢病毒包装质粒一起共转到所述细胞系中,培养后收集培养基上清浓缩得到。所述浓缩为本领域常规,较佳地为通过AmiconUltra-15 100KD的超滤管(Millipore),4℃离心30分钟浓缩收集的病毒液。
本发明技术方案之六:一种向导RNA,其针对的靶标为ATIC基因,其核苷酸序列如SEQ.ID No.42所示。
本发明技术方案之七:一种慢病毒载体,其特征在于,其含有如本发明技术方案之六所述向导RNA的DNA序列和Cas9基因。
本发明中,所述慢病毒载体的空载为本领域常规,较佳地为基于HIV-1的慢病毒载体,更佳地为购自addgene的lentiCRISPR载体。
本发明技术方案之八:一种慢病毒,其由如本发明技术方案之七所述慢病毒载体在慢病毒包装质粒的辅助下在细胞系中经病毒包装而成。
本发明中,所述慢病毒包装质粒为本领域常规,较佳地为psPAX2与pMD2.G,所述细胞系为本领域常规,较佳地为HEK293T细胞系。
本发明中,所述病毒包装为本领域常规,较佳地为将所述下调ATIC基因表达的慢病毒载体与所述慢病毒包装质粒一起共转到所述细胞系中,培养后收集培养基上清浓缩得到。所述浓缩为本领域常规,较佳地为通过AmiconUltra-15 100KD的超滤管(Millipore),4℃离心30分钟浓缩收集的病毒液。
本发明技术方案之四与技术方案之七中,所述慢病毒载体的Cas9基因为本领域常规,较佳地为按照人类遗传密码子优化后的Cas9基因。
本发明技术方案之九:一种如本发明技术方案之三和/或之六所述向导RNA、如本发明技术方案之四和/或之七所述慢病毒载体或如本发明技术方案之五和/或之八所述慢病毒在制备治疗或预防急性白血病耐药复发的药物中的应用。
本发明技术方案之十:一种治疗或预防急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物组合物,其有效物质含有选自如本发明技术方案之二所述siRNA、如本发明技术方案之三和/或之六所述向导RNA、如本发明技术方案之四和/或之七所述慢病毒载体和如本发明技术方案之五和/或之八所述慢病毒中的一种或多种。
本发明技术方案之十一:一种嘌呤从头合成途径中所有酶中的一种或多种酶的抑制剂在制备预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物中的应用。
本发明中,所述抑制剂为本领域常规,较佳地为抑制性RNA、抑制性多肽、抗体和小分子化合物抑制剂中的一种或多种,更佳地为抑制性RNA和小分子化合物抑制剂中的一种或多种。所述抑制性RNA为本领域常规,较佳地为选自向导RNA、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA和核酶中的一种或多种,更佳地为选自向导RNA、siRNA和shRNA中的一种或多种,最佳地为向导RNA。所述小分子化合物抑制剂为本领域常规,较佳地为选自洛美曲沙(Lometrexol)和力比泰(Alimta)中的一种或两种,更佳地为洛美曲沙。
本发明中,所述“耐药复发”是指急性淋巴细胞白血病病人在恢复期对化疗药物的治疗产生耐药性,所述化疗药物为本领域常规,较佳地为嘌呤类化疗药物,更佳地为6-巯基嘌呤(6-MP)或6-巯鸟嘌呤(6-TG)。
所述“预防”是指在可能存在所述耐药复发的情况下,使用后防止或降低所述耐药复发的发生。
所述“治疗”是指减轻所述耐药复发的程度,或者治愈所述耐药复发使急性淋巴细胞白血病病人恢复正常,或者减缓所述耐药复发的进程。
所述预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物包括所述抑制性RNA、抑制性多肽、抗体和小分子化合物抑制剂中的一种或多种和一种药用载体。在所述药物中,所述抑制性RNA、抑制性多肽、抗体和小分子化合物抑制剂中的一种或多种可以单独或和其他组分一起作为活性成分。所述活性成分是指具有预防或治疗所述耐药复发的功能。所述的药用载体包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂等。
所述的药物中,所述抑制性RNA、抑制性多肽、抗体和小分子化合物抑制剂中的一种或多种的含量是0.01~99.99%,所述药用载体的含量是0.01~99.99%,所述百分比是占药物总质量的质量百分比。
所述的药物的剂型没有特别限制,可以是固体、半固体或液体的形式,可以是水溶液、非水溶液或混悬液,也可以是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。可以经口服途径应用,也可以经静脉、肌肉、皮内或皮下注射途径给药。
本发明中,所述预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定,常用的每日剂量约为0.0001~1000mg/kg体重,较佳地为0.01~500mg/kg体重,更佳地为0.1~200mg/kg体重。给药次数一天一次或数次。
本发明中,所述预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物在治疗时还可以与化疗药物配合使用。所述化疗药物为本领域常规,较佳地为嘌呤类化疗药物,更佳地为6-巯基嘌呤(6-MP)或6-巯鸟嘌呤(6-TG)。
本发明技术方案之十二:一种评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒,其裂解样本细胞的试剂、检测次黄嘌呤(HX)、次黄嘌呤核苷酸单磷酸(IMP)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)和次黄苷(Inosine)中一种或多种的试剂和使用说明书;所述使用说明书记载的内容包括以下步骤:
(a)收集、裂解样本细胞;
(b)检测步骤(a)所得的样本细胞裂解液中的选自次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单磷酸、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸和次黄苷中一种或多种的含量;
(c)通过步骤(b)所得的次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单磷酸、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸和次黄苷中一种或多种的浓度判断样本急性淋巴细胞白血病耐药复发的风险。
本发明中,所述试剂盒较佳地还包括标准品,所述标准品为本领域常规,较佳地为为次黄嘌呤、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸和次黄苷中的一种或多种,更佳地为5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸、次黄苷和全部碳原子为13C、全部氮原子为15N的次黄嘌呤中的一种或多种。
本发明中,所述裂解样本细胞的试剂为本领域常规,较佳地为80%甲醇,所述百分比为体积百分比。
本发明中,所述检测次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单磷酸、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸和次黄苷中的一种或多种的试剂为本领域常规,较佳地为为质谱检测试剂。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明针对现有的以嘌呤类似物为化疗药物在治疗急性淋巴细胞白血病会出现耐药性复发的问题,提供了一种全新的作用于嘌呤合成途径中的酶类的药物在治疗和预防急性淋巴细胞白血病耐药性复发中的应用。本发明还提供了一类全新的检测急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒,所述试剂盒检测选自嘌呤合成途径的代谢产物次黄嘌呤核苷酸、次黄嘌呤、AICAR和Inosine中的一种或多种,以此作为评估ALL耐药复发风险的指标。本发明为儿童急性淋巴细胞白血病耐药复发的预防和治疗提供了有力的技术手段和支持。
附图说明
图1:超深度测序发现PRPS1为复发特异性突变且突变比例在临床复发前迅速增加。
图2:PRPS1突变蛋白结构示意图。
图3:pET28a载体图谱。
图4:纯化得到的PRPS1野生型及各突变体SDS-PAGE电泳结果。
图5:PCR扩增得到PRPS1野生型琼脂糖凝胶电泳结果。
图6:表达PRPS1野生型及各突变体的稳定Reh细胞系Western结果。
图7:表达PRPS1野生型及各突变体的稳定Reh细胞系对6-MP和6-TG的药物敏感性结果。
图8:表达PRPS1野生型及各突变体的稳定Reh细胞系对6-MP和6-TG的细胞凋亡结果。
图9:细胞内化疗药物6-MP/6-TG的代谢产物检测结果。
图10:表达PRPS1野生型及各突变体的PRPS1酶活性检测结果。
图11:ADP和GDP对PRPS1反馈调节路径示意。
图12:GDP/ADP对PRPS1蛋白活性的抑制的效果。
图13:细胞内嘌呤代谢途径产物含量测定结果。
图14:靶向嘌呤合成途径的核酸药物对PRPS1S103T与A190T突变体耐药性的抑制作用。
图15:外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的药物耐受。
图16:外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的代谢。
图17:次黄嘌呤竞争性抑制化疗药物6-MP的反应。
图18:洛美曲沙(Lometrexol)逆转PRPS1基因突变导致的6-MP药物耐受。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
本发明通过全外显子组测序技术,对16组儿童ALL的初发、缓解和复发样本测序,发现嘌呤合成限速酶PRPS1(Phosphoribosyl pyrophosphatesynthase I)基因存在多个位点的复发特异性突变,在初发与缓解样本中均为野生型。通过进一步对144例复发样本进行了PRPS1测序,又发现16例复发样本中出现了PRPS1基因的突变,在B-ALL中突变频率为13%(18/138)。同时德国的夏里特医学院(Charité-
本发明结合细胞生物学、分子生物学、代谢组学等方法,从PRPS1基因突变对自身酶活性的影响,以及对6-MP药物代谢和嘌呤代谢网络的影响等方面系统地研究PRPS1基因突变介导儿童ALL耐药复发的机制。研究揭示了儿童ALL一种新的耐药复发机制,提示PRPS1突变可以驱动复发,是一个耐药复发的基因标志物,并对后续临床的复发早期的基因诊断和个体化治疗有重要的指导意义。
以下实施例中所涉及的D183H突变体为已报道过的PRPS1基因的功能获得性突变体;所涉及的A87T与M115T突变体为已报道的功能缺失性突变体,它们分别作为检验实验检测的体系是否正常的正对照与负对照。所涉及的S103T、S103N、N144S、T303S、K176N、D183E、A190T、A190V和L191F为实验组,这些突变体通过比对人PRPS1的晶体结构可以被分为两类,即位于PRPS1二聚体形成界面的突变位点与位于PRPS1变构位点的突变位点,如图2所示。组内的突变体为PRPS1基因的耐药突变体。
实施例1
检测样本中的PRPS1基因突变:
通过全外显子组测序技术,对16组儿童ALL的初发、缓解和复发样本及144例复发样本进行了PRPS1的测序。
样品的质控:样品质量直接关系到测序结果的可靠性,通过以下三种方法保证用于深度测序和后续验证样本的质量:①白血病初发和复发时其骨髓中的白血病细胞可占全部有核细胞的90%以上,通过Ficoll密度梯度离心可以去除残余的正常粒细胞和有核红细胞,从而可以得到高纯度的白血病细胞用于后续的DNA抽提和测序;②通过多色荧光抗体组合可以区分白血病细胞和正常骨髓造血细胞,对于个别纯度较低的样品可通过流式细胞技术分选得到高纯度(>99%)的样品;③根据微量残留病检测结果,选择残留白血病细胞低于0.01%的缓解期样本用于深度测序,从而可以保证初发和复发特异性突变的可靠性。
样品的制备:通过QIAGEN Blood DNA kit进行白血病细胞基因组DNA的抽提,Q-bit荧光定量试剂盒进行DNA浓度测定,将高纯度基因组DNA用于后期的深度测序。
PRPS1各外显子的扩增:针对PRPS1基因组序列设计合适的引物进行PRPS1各外显子的扩增,所述PCR体系与程序如下所示:
PCR具体体系:
10×KOD缓冲液:2μl
2mM DNTP:2μl
25mM MgSO4:0.8μl
正向引物(10pmol):0.5μl
反向引物(10pmol):0.5μl
基因组DNA模板:1μl(50ng)
无菌水:12.7μl
KOD-PLUS聚合酶:0.5μl
PCR具体反应程序:
引物序列如表1所示,PCR产物按常规进行毛细管电泳测序和突变分析,突变分析使用软件为Mutation Surveyor。
测序分析:PCR成功后将目的条带测序,将目的序列与NCBI中的PRPS1基因序列进行比对,分析PRPS1的基因突变情况。实验结果见表2与表3。
通过对16组儿童ALL的初发、缓解和复发样本测序,发现嘌呤合成限速酶PRPS1(Phosphoribosyl pyrophosphate synthase I)基因存在多个位点的复发特异性突变(见表2),在初发与缓解样本中均为野生型。通过对144例复发样本进行了PRPS1测序,又发现16例复发样本中出现了PRPS1基因的突变,突变频率为13%(18/138)。同时德国的夏里特医学院(Charité-
表1 PCR扩增外显子信息
表2中国和德国儿童B-ALL复发样本中的PRPS1突变
通过全外显子组测序技术对儿童ALL初发、缓解、复发骨髓样本进行测序,发现了18例病人复发样本中存在PRPS1基因突变,突变频率为13%(18/138),如表2所示。其中有9例复发样本中均为A190T的位点突变。通过与德国的夏里特医学院(Charité-
表3中国和德国B-ALL患儿中PRPS1突变与临床特征的关系
1P值用Fisher精确检验计算得到。
2P值用卡平方检验计算得到。
如表3所示,通过临床病理学资料,分析发现PRPS1突变都发生在早期复发病人中(中国病人,P<0.005,德国病人,P<0.001),预示具有缓解期诊断复发意义。
实施例2
检测样本中的嘌呤代谢途径相关基因的突变
通过常规的二代测序技术,在160例儿童ALL复发样本中进行了嘌呤代谢相关酶HGPRT、IMPDH、NT5C2、PRPS2、ATIC、ADSL、GART、PFAS的测序。
样品的质控、制备、基因外显子的扩增同实施例1
测序分析:PCR成功后将目的条带测序,将目的序列与NCBI中对应的基因序列进行比对,分析基因突变情况。如果复发样本中发现了基因突变,检测同一病人的初发样本,确定是否是复发特异性突变。实验结果见表4。
通过测序与序列比对发现,嘌呤代谢相关酶PRPS2、ATIC、ADSL、GART、PFAS均存在复发特异性突变。
表4嘌呤代谢相关酶在儿童ALL复发样本中的突变
实施例3
PRPS1原核表达载体的构建
1.目的基因片段的获取:根据NCBI提供的PRPS1(gene ID:5631,NM002764)序列,设计野生型PRPS1的PCR引物序列,正向引物:5’cgcggcagccatATGCCGAATATCAAAATCTTCAG 3’,反向引物:5’gtggtggtgctcgagTTATAAAGGGACATGGCTGAATAGGTA3’(引物说明:含交换配对碱基、酶切位点,并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因)。以提取的Reh细胞的cDNA为模板,PCR钓取PRPS1,PCR产物大小为957bp,产物序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.原核表达载体的线性化:用限制性内切酶NdeI/XhoI处理pET28a载体,pET28a载体图谱如图3所示。
3.重组质粒构建:通过clontech公司的In-FusionTM>
4.鉴定重组质粒:通过测序验证重组子是否构建成功。
5.PRPS1突变原核载体的构建:以pET28a-PRPS1为质粒模板,通过TOYOBO公司的KOD-Plus DNA聚合酶进行环状PCR分别构建PRPS1的9个突变体:S103T、S103N、N144S、T303S、K176N、D183E、A190T、A190V和L191F,PCR引物见表5。
PCR具体体系:
10×KOD缓冲液:2μl
2mM dNTP:2μl
25mM MgSO4:0.8μl
正向引物(10pmol):0.5μl
反向引物(10pmol):0.5μl
GV303-PRPS1质粒模板:1μl(10ng)
无菌水:12.7μl
KOD-PLUS聚合酶:0.5μl
PCR具体反应程序:
PCR产物加入1μl DpnI酶37℃水浴1小时消化质粒模板后,取10μl加入大肠杆菌TOP10中扩增。转化子经测序验证突变体是否构建成功。
实施例4
PRPS1原核蛋白的纯化
1.pET28a-PRPS1系列质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
①取1μl pET28a-PRPS1系列质粒与100μl BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞混匀,冰上放置30分钟,水浴42℃,90秒,勿摇动,立即置冰上冷却2分钟,加入900μl SOC培养基,37℃,170转/分,振荡1小时.
②将1ml已转化的感受态细胞,涂在含50μg/ml卡那霉素的半固体LB琼脂培养皿中倒置平皿培养16小时,出现菌落,拟挑出长势良好的阳性克隆做进一步实验。
2.小量表达测试:
①从上述pET28a-PRPS1系列转化平板中,挑取单克隆到3ml LB(含抗生素)中,37℃,220rpm振荡培养10~12小时。
②次日以1:100接菌,即取50μl菌液到5ml LB(含抗生素)中,37℃,220rpm振荡培养2~3小时至OD值达到0.6。
③对照取样:取2ml菌液,12000rpm离心1分钟,弃尽上清,菌体沉淀中加入1ml PBS溶液,超声破碎(200w,超声3秒,间歇5秒,20循环),加入SDS-PAGE Loading Buffer(还原,4x),100℃,水浴10分钟,12000rpm离心10分钟,取上清,-20℃保存,做为诱导前对照。
④剩余3ml菌液中,加诱导剂IPTG至终浓度为1mM,16℃,220rpm振荡培养16小时后,12000rpm离心1分钟,弃尽上清收菌,超声破碎处理取样,-20℃保存。
⑤对上述样品进行SDS-PAGE电泳鉴定表达结果。
3.PRPS1大量表达:
①挑单克隆到100ml LB(含50μg/ml卡那霉素抗生素)中,37℃,220rpm振荡培养10~12小时。
②扩大培养:以1:100接菌,即各取上述20ml菌液接到2L LB培养基中(含终浓度50μg/ml卡那霉素抗生素)中,37℃,220rpm振荡培养4~5小时至OD值达到0.6-0.8。
③对照取样:取2ml菌液,12000rpm离心1分钟,弃尽上清,菌体沉淀中加入1ml PBS溶液,超声破碎(200w,超声3秒,间歇5秒,20循环),加入SDS-PAGE Loading Buffer(还原,4x),100℃,水浴10分钟,12000rpm离心10分钟,取上清,-20℃保存,做为诱导前对照。
④其余菌液于16℃,220rpm继续振荡培养1小时后,加IPTG至终浓度1mM,16℃,220rpm振荡培养12小时后收菌:6000rpm、4℃离心10分钟,弃尽上清,取5ml做表达鉴定(16℃样品),其余-80℃保存。
⑤超声破碎分别处理上述PRPS1系列样品,进行SDS-PAGE电泳鉴定。(同小量表达中的5)
4.PRPS1蛋白纯化:分别取超声破碎好的菌液,通过AKTA-purifier系统的镍柱纯化PRPS1的系列蛋白,通过SDS-PAGE电泳鉴定PRPS1系列蛋白的表达以及纯度,通过碧云天公司的BCA蛋白定量试剂盒对PRPS1系列蛋白进行定量,得到氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的野生型PRPS1蛋白,如图4所示。
实施例5
PRPS1突变基因真核表达载体的制备
1.目的基因片段的获取:根据NCBI提供的PRPS1(gene ID:5631,NM002764)序列,设计野生型PRPS1的PCR引物序列,正向引物:5’GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCCGAATATCAAAATC 3’,反向引物:5’TCCTTGTAGTCCATACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTAAAG3’,引物含交换配对碱基、酶切位点,并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。以pET-28a-PRPS1为质粒模板,PCR钓取PRPS1,PCR产物大小为1022bp,如图5所示。
PCR体系:
PCR反应程序:
PCR产物加入1μl DpnI酶37℃水浴1小时消化质粒模板后,取10μl加入大肠杆菌TOP10中扩增。转化子经测序验证突变体是否构建成功。
2.病毒表达载体的线性化:用限制性内切酶AgeI处理GV303病毒载体(吉凯基因)。
3.重组质粒构建:通过clontech公司的In-FusionTM>
4.酶切鉴定重组质粒:经过限制性内切酶Hind III鉴定重组子是否正确,若产生354bp的酶切片段则为阳性重组子。
5.PRPS1突变质粒的构建:以所述GV303-PRPS1为质粒模板,通过TOYOBO公司的KOD-Plus DNA聚合酶进行环状PCR分别构建PRPS1的9个突变体慢病毒表达载体:GV303-PRPS1-S103T、GV303-PRPS1-S103N、GV303-PRPS1-N144S、GV303-PRPS1-T303S、GV303-PRPS1-K176N、GV303-PRPS1-D183E、GV303-PRPS1-A190T、GV303-PRPS1-A190V和GV303-PRPS1-L191F,PCR引物见表5。
表5 PRPS1突变体PCR引物序列表
实施例6
表达PRPS1突变基因的Reh细胞的制备
病毒制备
1.转染前24小时将HEK293T细胞种到10cm皿中,第二天当细胞密度达到50%~80%时,开始转染。
2.配制DNA-Opti-MEM和Fugene-6-Opti-MEM混合液(一皿细胞):
表6
Promega公司的转染试剂Fugene-6和Opti-MEM混合后,静置5分钟;DNA-Opti-MEM和Fugene-6-Opti-MEM混合后,静置15分钟;
3.混合液静置过程中,从培养箱中取出需转染的HEK293T细胞培养皿,换新鲜的无抗生素培养基。
4.混合液静置15min后,加233μl/皿混合液至HEK293T细胞的培养皿中,“十”字形上下左右混匀培养液5次。
5.37℃,5%CO2条件下培养,24小时后换液,15ml/皿加新鲜培养液,继续培养72小时后,收集含病毒的培养液。
6.将收集的病毒上清液加入Amicon Ultra-15 100KD的超滤管,4℃离心30分钟,得到浓缩后的病毒液。
7.将得到的病毒液进行梯度稀释后感染HEK293T细胞,并根据感染后绿色荧光的细胞数量计算病毒的滴度。
病毒感染
1.细胞接种:将Reh细胞计数后接种到12孔板中,每孔接种3×105个细胞。
2.每孔加入浓缩后的病毒上清(MOI=10),同时加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(polybrene),将细胞放入培养箱继续培养24小时后,换成新鲜的完全培养基。48小时后即可在显微镜下观察荧光。
3.流式分选细胞:病毒感染72小时后,将细胞通过Beckman公司的流式细胞仪Moflo XDP分选出有绿色荧光的Reh细胞,扩大培养。
4.收集分选后的Reh细胞,通过Western blot检测PRPS1野生型与突变型的表达,验证稳定细胞系是否构建成功。实验结果见图6,共获得以下九个稳定细胞系:Reh-PRPS1-S103T、Reh-PRPS1-S103N、Reh-PRPS1-N144S、Reh-PRPS1-T303S、Reh-PRPS1-K176N、Reh-PRPS1-D183E、Reh-PRPS1-A190T、Reh-PRPS1-A190V和Reh-PRPS1-L191F。
实施例7
6-MP药物敏感性实验
Reh细胞是一种人急性B淋巴细胞白血病株。通过检测经化疗药物6-MP处理后表达不同PRPS1突变基因的Reh细胞的存活率来检测不PRPS1突变体对化疗药物6-MP的敏感性,步骤如下:
①细胞接种:将表达野生型与各类突变体PRPS1的Reh细胞计数后接种到96孔板中,每孔接种104个细胞,设置5个复孔;
②细胞处理:将药物6-MP进行梯度稀释,起始浓度为100μg/ml,依次3倍稀释,稀释10个梯度,加入铺好细胞的96孔板中,37℃培养72小时;
③细胞活性测定:72小时后,每孔中加入50μl CellTiter-Glo试剂(Promega公司),室温混匀孵育10分钟,放入酶标仪(Biotek公司)读化学发光值;
④计算IC50:用Graphpad>50值,比较组间差异。
实验结果如图7所示。与表达空载的对照相比,实验组各PRPS1突变基因的细胞IC50值都有显著上升,证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞在6-MP处理后存活率显著提高,即耐药性显著增加。
实施例8
6-TG药物敏感性实验
通过检测经化疗药物6-TG处理后表达不同PRPS1突变基因的Reh细胞的存活率来检测不同PRPS1突变体对化疗药物6-TG的敏感性,步骤如下:
①细胞接种:将表达野生型与各类突变体PRPS1的Reh细胞计数后接种到96孔板中,每孔接种104个细胞,设置5个复孔;
②细胞处理:将药物6-TG进行梯度稀释,起始浓度为100μg/ml,依次3倍稀释,稀释10个梯度,加入铺好细胞的96孔板中,37℃培养72小时;
③细胞活性测定:72小时后,每孔中加入50μl CellTiter-Glo试剂(Promega公司),室温混匀孵育10分钟,放入酶标仪(Biotek公司)读化学发光值;
④计算IC50:用Graphpad>50值,比较组间差异。
实验结果如图7所示。与表达空载的对照相比,实验组各PRPS1突变基因的细胞IC50值都有显著上升,证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞在6-TG处理后存活率显著提高,即耐药性显著增加。
实施例9
细胞凋亡的检测实验
①细胞接种:将表达野生型与各类突变体PRPS1的Reh细胞计数后接种到12孔板中,每孔接种3×105个细胞,设置2个复孔;
②细胞处理:将药物6-MP或6-TG 10μg/ml,加入铺好细胞的12孔板中,37℃培养72小时;
③细胞染色:72小时后,离心收集细胞,用PBS缓冲液冲洗细胞,加入BD公司PE标记的Annexin-V与7-AAD染料,室温混匀孵育15分钟,离心弃上清,用PBS冲洗2遍;
④流式检测:用BD公司的流式细胞仪Canto II上机检测细胞凋亡比例。
实验结果如图8所示。与表达空载的对照相比,实验组各PRPS1突变基因的细胞凋亡比例都有显著下调,证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞在6-MP或6-TG处理后存活率显著提高,即耐药性显著增加。
实施例10
检测细胞内化疗药物6-MP/6-TG的代谢产物。
6-MP为前药,在发挥作用之前需要先经过体内代谢反应形成TIMP与TGMP,如图9C所示。检测步骤如下所述:
①细胞接种:将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿,每个皿3×106细胞;
②细胞处理:每个6cm培养皿中加入10μM化疗药物6-MP处理4个小时;
③收集细胞:将细胞转移到离心管中,3,000g离心5分钟,弃上清,按照3×106细胞/200μl>
④LC-MS(ABI 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测化疗药物6-MP的代谢产物TIMP,TGMP,r-MP,r-TG,r-MMP的含量,分别用TIMP(Jean Bioscience,cat#NU-1148),TGMP(Jean Bioscience,cat#NU-1121),r-MP(Sigma,cat#852686),r-TG(Sigma,cat#858412),r-MMP(Sigma,cat#M4002)做标准曲线定量。
实验结果图9所示,对于实验组经过6-MP处理后的各突变体,6-MP的代谢产物TIMP、TGMP和r-MP、r-TG、r-MMP在胞内的含量与对照相比都显著减少。
实施例11
PRPS1酶活性的检测
本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术,通过同位素标记的方法,检测了PRPS1在细胞中的活性。具体实施方式如下:
①细胞培养:将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿,每个皿3×106细胞;
②细胞处理:第二天用无葡萄糖培养基(Gibco,cat#11879-020)悬浮细胞,每个6cm培养皿中加入10mM>13C6-葡萄糖(Cambridge>
③收集细胞:将细胞转移到离心管中,3,000g离心5分钟,弃上清,按照3×106细胞/200μl>
④LC-MS(ABI 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测13C5-PRPP的含量,用PRPP(sigma,cat#P8296)做标准曲线定量。
实验结果见图10,与表达空载的对照相比,实验组各PRPS1突变基因的催化反应产物PRPP的浓度值都有显著上升,证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞中PRPS1突变体酶的活性都有显著地增加。
实施例12
测定核苷酸ADP、GDP对PRPS1活性的反馈调节
1.体外蛋白水平
①建立PRPS1催化的酶学反应,如图11所示,ATP(货号A7699)、ADP(货号A2754)、GDP(货号G7172)、核糖-5-磷酸(货号R7750)购自sigma公司。反应体系为:50mM Tris PH7.5,2mM磷酸根,1mM DTT,10mM MgCl2,0.5mM核糖-5-磷酸,0.5mM ATP,PRPS1蛋白。
②测定GDP/ADP对PRPS1蛋白活性的抑制:GDP/ADP起始浓度为5mM,依次做3倍浓度梯度稀释,配制15μL PRPS1体外酶学反应体系加入384孔板,37℃反应30分钟。加入10μl Promega公司的Kinase-Glo试剂(货号V3722)终止反应,室温反应15分钟,在酶标仪中读取化学发光数值。用Graphpad 5.0计算GDP/ADP对PRPS1的活性抑制。
实验结果见图12A、B,可见GDP/ADP对PRPS1突变体S103T、S103N、N144S、T303S、K176N、D183E、A190T、A190V、L191F的抑制明显低于PRPS1野生型,而已知的功能缺失性突变A87T与M115T与野生型无明显差异,即PRPS1的复发特异性突变逃逸了核苷酸GDP/ADP对PRPS1活性的负反馈抑制,为功能获得性突变。
2.细胞水平
本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术,通过同位素标记的方法,检测PRPS1在细胞中的活性,在此基础上评估核苷酸GDP/ADP对PRPS1活性的影响。具体实施方式如下:
①细胞培养:将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿,每个皿3×106细胞;
②细胞处理:在培养皿中加入2mM ADP或0.5mM GDP处理4小时后用无葡萄糖培养基(Gibco,cat#11879-020)悬浮细胞,每个6cm培养皿中加入10mM>13C6-葡萄糖(Cambridge>
③收集细胞:将细胞转移到离心管中,3,000g离心5分钟,弃上清,按照3×106细胞/200μl>
④LC-MS(ABI 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测13C5-PRPP的含量,用PRPP(sigma,cat#P8296)做标准曲线定量。根据PRPP的含量来判定PRPS1酶活性的变化。
实验结果见图12C,表达野生型实验组在加入核苷酸GDP/ADP后PRPP的浓度有所下降,实验组各PRPS1突变基因的催化反应产物PRPP的浓度均不受核苷酸GDP/ADP的影响,证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞中PRPS1突变体酶的活性不受核苷酸GDP/ADP的反馈调节。
实施例13
嘌呤代谢途径活性的检测
本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术,通过同位素标记的方法,检测细胞中嘌呤从头合成途径与补救合成途径的活性。具体实施方式如下:
①细胞培养:将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿,每个皿3×106细胞;
②细胞处理:第二天用无氨基酸培养基(Gibco定制,cat#ME100031L1)悬浮细胞,分别用20μg/ml>13C2,15N-甘氨酸(sigma,cat#489522)标记从头合成途径,2μM>13C5,15N4-次黄嘌呤(Cambridge>
③收集细胞:将细胞转移到离心管中,3,000g离心5分钟,弃上清,按照3×106细胞/200μl>
④LC-MS(ABI 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测13C2,15N–次黄嘌呤核苷酸(IMP+3)与13C5,15N4-次黄嘌呤核苷酸(IMP+9)的含量,用IMP(sigma,cat#I4625)做标准曲线定量。
实验结果如图13、图9B和图18所示。实验组中表达各PRPS1基因耐药突变体的Reh细胞内的13C2,15N–次黄嘌呤核苷酸(IMP+3)和13C5,15N4-次黄嘌呤核苷酸(IMP+9)的浓度和与表达空载与野生型PRPS1基因的Reh细胞相比有显著的上升,即表明嘌呤从头合成与补救合成两条途径活性均有显著提高。
实施例14
检测样本中的次黄嘌呤、AICAR以及Inosine的含量
本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术,通过LC-MS检测细胞中次黄嘌呤的含量。具体实施方式如下:
①细胞培养:将PRPS1的野生型和各类突变体病毒转染人Reh细胞(此处请参见实施例4),培养细胞;
②细胞计数:当每个反应孔细胞达到5×106/5ml时,根据实验所需细胞数量进行取样;
③收集细胞:细胞从孔中吸出,1500rpm离心后弃去上清。PBS洗涤1次,再次离心(500g),吸去上清;
④细胞裂解:按照3×106细胞/200μl>
⑤4℃ 14,000g离心10分钟,离心后将上清转移到1.5ml EP管中;
⑥LC-MS(ABI 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测次黄嘌呤、AICAR以及Inosine的含量,分别用13C5,15N4-次黄嘌呤(Cambridgeisotope>
实验结果如图13所示。实验组中表达各PRPS1基因耐药突变体的Reh细胞内的次黄嘌呤、AICAR以及Inosine的浓度与表达空载和野生型PRPS1基因的对照细胞相比都有显著地提高。
实施例15
靶向嘌呤合成途径的核酸药物
针对嘌呤从头合成途径的慢病毒LV-CRISPR-ATIC与LV-CRISPR-GART的制备及其逆转PRPS1基因突变引起的6-MP药物耐受中的应用
①CRISPR慢病毒载体的构建:根据CRISPR设计原则与GART和ATIC的序列,分别设计对应序列如下:CRISPR-ATIC:TGAATCTGGTCGCTTCCGGA(SEQ ID NO.40),CRISPR-GART:GCAGCCCGAGTACTTATAAT(SEQ ID NO.39),构建到CRISPR慢病毒载体(Addgene,cat#49535)中,得到慢病毒载体lentiCRISPR-ATIC与lentiCRISPR-GART;
②按已报道的方法(Shalem O,Sanjana NE,Hartenian E,Shi X,Scott DA,Mikkelsen TS,Heckl D,Ebert BL,Root DE,Doench JG,Zhang FScience.2014 Jan 3;343(6166):84-7.doi:10.1126/science.1247005.Epub 2013Dec 12)包装获得表达针对ATIC与GART基因的CRISPR RNA的慢病毒LV-CRISPR-ATIC与LV-CRISPR-GART;
③将包装得到的空载慢病毒、慢病毒LV-CRISPR-ATIC与LV-CRISPR-GART分别感染细胞系Reh-PRPS1-S103T与Reh-PRPS1-A190T后形成稳定细胞系,感染Reh细胞的病毒MOI=10,加入8μg/ml聚凝胺,感染24个小时后换液,培养48小时候加入0.8μg/ml嘌呤霉素抗性筛选一周后形成下述稳定细胞系:对照细胞系Reh-LV-CRISPR、Reh-S103T-CRISPR-ATIC、Reh-S103T-CRISPR-GART、Reh-A190T-CRISPR-ATIC和Reh-A190T-CRISPR-GART。
④细胞处理:将药物6-MP进行稀释,加入铺好如步骤③所述的几种细胞系的96孔板中,每种细胞系设置5个复孔,检测慢病毒感染细胞对6-MP的敏感性变化。具体实施方式同实施例8;
实验结果如图14所示,与空载病毒的对照细胞系Reh-LV-CRISPR相比Reh-S103T-CRISPR-ATIC、Reh-S103T-CRISPR-GART、Reh-A190T-CRISPR-ATIC和Reh-A190T-CRISPR-GART的IC50值都显著下降,即表明对药物6-MP的耐药性显著降低。
实施例16
外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的药物耐受
通过检测外源加入嘌呤对Reh细胞的药物敏感性,步骤如下:
①细胞接种:将表Reh细胞计数后接种到96孔板中,每孔接种104个细胞,每组设置5个复孔;
②细胞处理:每组分别加入10μM、50μM、100μM的次黄嘌呤(HX)或次黄嘌呤核苷酸(IMP)预处理1小时,然后将药物6-MP进行梯度稀释,起始浓度为100μg/ml,依次3倍稀释,稀释10个梯度,加入铺好细胞的96孔板中,37℃培养72小时;
③细胞活性测定:72小时后,每孔中加入50μl CellTiter-Glo试剂(Promega公司),室温混匀孵育10分钟,放入酶标仪(Biotek公司)读化学发光值;
④计算IC50:用Graphpad>50值,比较组间差异。
实验结果如图15所示。与嘌呤溶剂水对照相比,实验组分别加入次黄嘌呤与雌黄嘌呤核苷酸的细胞IC50值都有显著上升,证明外源加入嘌呤的细胞在6-MP处理后存活率显著提高,即耐药性显著增加。
实施例17
外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的代谢
①细胞接种:将Reh细胞计数铺6cm培养皿,每个皿3×106细胞;
②细胞处理:每个6cm培养皿中加入50μM的次黄嘌呤(HX)或次黄嘌呤核苷酸(IMP)预处理1小时,后加入10μM化疗药物6-MP处理4个小时;
③收集细胞:将细胞转移到离心管中,3,000g离心5分钟,弃上清,按照3×106细胞/200μl>
④LC-MS(ABI 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测化疗药物6-MP的代谢产物TIMP,TGMP的含量,分别用TIMP(JeanBioscience,cat#NU-1148),TGMP(Jean Bioscience,cat#NU-1121)做标准曲线定量。
实验结果如图16所示,对于实验组加入外源嘌呤处理后的Reh细胞,6-MP的代谢产物TIMP和TGMP在胞内的含量与对照相比都显著减少。
实施例18
次黄嘌呤竞争性抑制化疗药物6-MP的反应
化疗药物6-MP是次黄嘌呤的类似物,6-MP与次黄嘌呤都是HGPRT的底物,本发明建立了体外酶学反应测定次黄嘌呤与6-MP与HGPRT反应的Km值,反映次黄嘌呤与6-MP与HGPRT的亲和力。具体实施方式如下:
建立体外酶学反应,如图17A所示:
具体反应体系如下:
表7
表8
表9
次黄嘌呤与6-MP依次做浓度梯度稀释,37℃反应1小时,加入80%甲醇终止反应,通过LC-MS分别检测IMP与TIMP的含量。绘制反应曲线,通过Graphpad 5.0软件分别计算次黄嘌呤与6-MP的Km值。
实验结果如图17B所示,次黄嘌呤与HGPRT的亲和力明显高于6-MP与HGPRT的亲和力;且在100μM 6-MP作为反应底物时,随着加入次黄嘌呤浓度的升高,TIMP的生成受到了明显的抑制。
实施例19
洛美曲沙(Lometrexol)逆转PRPS1基因突变导致的6-MP药物耐受
洛美曲沙为一种GART的小分子抑制剂。本发明检测到洛美曲沙可以逆转PRPS1基因突变导致的6-MP药物耐受,具体步骤如下:
①细胞接种:将Reh-PRPS1-S103T与Reh-PRPS1-A190T细胞计数后接种到96孔板中,每孔接种104个细胞,每种细胞系设置5个复孔;
②细胞处理:用药物5ng/ml洛美曲沙(Lometrexol)或二甲亚枫(DMSO)对照预处理细胞1小时,对6-MP进行梯度稀释,加入铺好细胞的96孔板中,37℃培养72小时;
③读值:72小时后,每孔中加入50μl CellTiter-Glo试剂(Promega公司),室温混匀孵育10分钟,放入酶标仪读化学发光值;
④计算:用Graphpad 5.0软件计算IC50值,比较差异;
⑤6-MP代谢产物浓度的检测:同实施例13;
⑥次黄嘌呤胞内浓度的检测:同实施例14。
实验结果如图18所示。与各自的对照相比,Reh-PRPS1-S103T与Reh-PRPS1-A190T细胞用洛美曲沙(Lometrexol)处理后药物6-MP的IC50值都显著下降,同时6-MP在体内的代谢产物TIMP与TGMP都显著上升,表明洛美曲沙使得Reh-PRPS1-S103T与Reh-PRPS1-A190T细胞系对6-MP的耐药性显著降低。并且处理后的Reh-PRPS1-S103T与Reh-PRPS1-A190T胞内的6-MP代谢产物TIMP与TGMP都有非常显著地上升,同时次黄嘌呤浓度有显著下降。
实施例20
质谱检测嘌呤代谢产物及嘌呤类似物药物代谢产物
药物及试剂
甲醇、乙腈(HPLC级)购自Sigma-Aldrich公司(美国),甲酸(HPLC级)购自Merck公司(德国),实验用水由Millipore-Q制备。
试验仪器
液质联用仪(UPLC-MS/MS):
AB SCIEX
Waters Ultra Performance LC system(Singapore)
1.ACQUITYTM>
2.ACQUITYTM>
3.ACQUITYTM>
4.ACQUITYTM>
采用Analyst,version 1.5.2数据采集和处理系统。
其他仪器:Thermo Fisher-70℃超低温冰箱(美国);Eppendorf 5810R高速大容量低温离心机(德国);IKA Vibrax VXR小型摇床(德国);IKA Vortex振荡器(德国);KQ5200DA超声波清洗器(昆山)等。
1.样品分析方法
样品处理方法
80%甲醇收集细胞,4度12000rpm离心5分钟,转移上清至新EP管中,取20μl进行LC-MS/MS分析。
1)标记的PRPP,ADP and GDP:
色谱条件
流动相组成:流动相A:50mM碳酸氢铵(pH9.5)
流动相B:乙腈:水=6:1(v/v)
梯度洗脱:
表10
色谱柱:apHeraTM>
流速:0.6ml/min;进样体积:20μl;
质谱检测条件
采用电喷雾离子源(Turbo spray),选择多通道反应监测(MRM)模式进行二级质谱分析。质谱检测工作参数及离子源参数如下:
表11
2)IMP(labeled IMP+3 and labeled IMP+9),HX,TIMP,TGMP,AICAR,Inosine,6-MP,6-TG,MMP,r-MP,r-TG and r-MMP
色谱条件
流动相组成:流动相A:水-0.025%甲酸-1mM
流动相B:甲醇-0.025%甲酸-1mM醋酸铵
梯度洗脱:
表12
色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150mm,5μm);
流速:0.6ml/min; 进样体积:15μl;
质谱检测条件
采用电喷雾离子源(Turbo spray),选择多通道反应监测(MRM)模式进行二级质谱分析。质谱检测工作参数及离子源参数如下:
表13
应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明的相关条件作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
机译: 控释组合物,药物,用于预防或治疗疾病的药物,或避孕药,用于预防绝经前乳腺癌后乳腺癌复发的药物以及预防或治疗该控制释放的疾病的方法或避孕方法组合物,以及用于预防绝经前乳腺癌手术后的乳腺癌复发
机译: 包含针对HIF-1&alpha的SIRNA的药物组合物和抗氧化剂,用于治疗或预防复发性癌症或耐药性癌症
机译: 用于治疗可卡因成瘾或预防可卡因成瘾复发的药物组合物,用于治疗可卡因成瘾和预防可卡因成瘾复发的方法,使用(r)-2- {3- [1-(5-(5-甲基-1,2,3, (4-四氢萘-1-基)哌啶-4-基] -2,3-二氢-2-氧代苯并咪唑-1-基}-正甲基乙酰胺或其药学上可接受的盐,以及(r)-2- {3- [1-(1-(5-甲基-1,2,3,4-四氢萘-1-基)哌啶-4-基] -2,3-二氢-2-氧代苯并咪唑-1-基} -n -甲基乙酰胺或其药学上可接受的盐。