一种罗汉果外植体表面灭菌技术

摘要

本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，属于植物组织培养技术领域，使用本发明的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15％以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50％以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术，尤其涉及一种罗汉果外植体表面灭菌技术。

背景技术

罗汉果(学名：Siraitiagrosvenorii)是葫芦科多年生藤本植物。其叶心形，雌雄异株，夏季开花，秋天结果。中医以其果实入药，含有罗汉果甜苷、多种氨基酸和维生素等药用成分，主治肺热痰火咳嗽、咽喉炎、扁桃体炎、急性胃炎、便秘等。因为罗汉果是雌雄异株，又花期不遇，加之花粉粘重且着生于花药不易被昆虫触及的地方，所以很难像普通的风媒花或虫媒花那样传粉，因此自然条件下，结果的机率极低(目前人工栽培仍然必须人工授粉)。同时，罗汉果种子实生苗有70％左右为雄株，且要等到2～3年之后，开花时才能判定，生产上基本无实用价值。但是，罗汉果的习性是，到了秋季分枝藤蔓会向下垂，并迅速伸长，一经着地就会膨大变作指头大小的块茎(俗称“薯块”、“薯仔”)，可以顽强地越冬，来年萌发成为独立的新植株。这是罗汉果自然繁殖的重要方式。在人工栽培之后，演化成了人工压蔓，小“块茎”依然是罗汉果最重要的种源。然而，这些传统块茎容易传播病毒及其它病虫害，又难以大批量生产，无法满足现代规模化种植的需求。

世纪末无菌无毒的罗汉果组培苗研究成功，很快就取代传统块茎成为最重要的种源。先研究在罗汉果组培技术前，其消毒杀菌下过不 是很理想，导致后面的组织培养成活率不高。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种罗汉果外植体表面灭菌技术。

本发明通过以下技术方案得以实现。

本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：

1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

2)用浓度为3～5％的肥皂水浸泡5～10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

3)再用浓度为0.05～0.1％的柠檬酸溶液浸泡5～10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

4)再用浓度50～60％的酒精溶液浸泡15～20s，捞起后使用无菌水冲洗一次；

5)再使用浓度为0.1～0.3％的高锰酸钾溶液浸泡3～5min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

进一步的，包括以下步骤：

1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

2)用浓度为4％的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

3)再用浓度为0.08％的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

4)再用浓度55％的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一 次；

5)再使用浓度为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

进一步的，得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10～20s。

进一步的，得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.5～0.7mg/L+IAA0.1～0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。

本发明的有益效果在于：使用本发明的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15％以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50％以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。

为了证明本发明的技术效果，本发明还提供以下试验例：

试验例一

试验组1：其处理步骤为：

1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

2)用浓度为4％的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

3)再用浓度为0.08％的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

4)再用浓度55％的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；

5)再使用浓度为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

6)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒 MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润

试验组2：其处理步骤为：

1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

2)用浓度为4％的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

3)再用浓度为0.08％的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

4)再用浓度55％的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；

5)再使用浓度为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体；

6)得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10～20s；

7)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润

对照组：其处理步骤为：

1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

2)使用无菌水进行处理；

检测上述试验的诱导率、污染率和褐化率，具体如下表：

结果表明，使用本发明的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15％以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50％以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。

具体实施方式

下面进一步描述本发明的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。

实施例一

本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：

1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

2)用浓度为3％的肥皂水浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

3)再用浓度为0.05％的柠檬酸溶液浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

4)再用浓度50～60％的酒精溶液浸泡15s，捞起后使用无菌水冲洗一次；

5)再使用浓度为0.1％的高锰酸钾溶液浸泡3min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

6)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。

实施例二

本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：

1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

2)用浓度为5％的肥皂水浸泡10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

3)再用浓度为0.1％的柠檬酸溶液浸泡10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

4)再用浓度60％的酒精溶液浸泡20s，捞起后使用无菌水冲洗一次；

5)再使用浓度为0.3％的高锰酸钾溶液浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

6)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。

实施例三

本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：

1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

2)用浓度为4％的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

3)再用浓度为0.08％的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

4)再用浓度55％的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；

5)再使用浓度为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体；

6)得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10～20s；

7)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。