一种斜生栅藻藻株及其分离纯化方法、培养方法及应用

摘要

一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2的分离纯化方法，将采集的水样稀释后均匀涂布在1.5‑2%琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养；待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养；再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释涂平板的方法进一步纯化藻种；挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2～4次后得到纯净的单一藻落。一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的N或P浓度降低到原来的1/4或增加到原来的三倍，即采用1/4 N或3倍N、P浓度的BG11培养基。本发明的斜生栅藻能够在较低浓度的N源条件下持续快速生长，藻细胞能够有效积累大量油脂，可进行转脂化生产生物柴油。

说明书

技术领域

本发明属于微生物和生物能源领域，尤其是涉及一种斜生栅藻藻株及其分离纯化、培养、收集方法及其用途。

背景技术

随着社会经济的日益繁荣，人类可利用资源日渐枯竭，为了社会的可持续发展，当今世界各国政府及有关技术人员逐渐将研究方向转向了可再生能源。

因为地球上的藻类资源物种丰富，其中不乏富油藻种。因此从油藻中提取油脂用于生物柴油的生产，以代替日渐枯竭的石油来源，成为科学界十分关注的课题。而现有技术已有富油藻类的培养提取方法及其有关应用公开，但对于其丰富应用而言，仅仅是九牛一毛。因此，对这类技术的研究仍在不断地持续深入和扩大中，尚有大量的富油藻类物种，需要去发现，需要去实现有效的培养和分离，需要去进行深入的应用研究。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提出了一种斜生栅藻藻株的分离纯化和培养方法，并对其应用进行了研究。从野外采集水样，通过培养、分离、纯化得到一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2（Scenedesmus>），并进行了保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2016253，分类命名: Scenedesmus> SoHNCJ2,保藏日期为2016年5月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心,地址：中国.武汉.武汉大学。

本发明所采用的技术方案：

一株斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其保藏编号为CCTCC NO：M2016253， 保藏日期为2016年5月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

一种如上所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2的分离纯化方法，1)将采集的水样稀释后均匀涂布在1.5-2％琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养；2)待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养；3)再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释涂平板的方法进一步纯化藻种；4)挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2～4次后得到纯净的单一藻落；所述培养基采用淡水蓝藻培养基BG11。

一种如上所述的斜生栅藻的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的N浓度降低到原来的1/4，即采用1/4N浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：

NaNO₃，0.375g

K₂HPO₄，0.04g

MgSO₄.7H₂O，0.075g

CaCl₂.7H₂O，0.036g

Na₂CO₃，0.02g

柠檬酸，0.006g

柠檬酸铁，0.006g

微量元素溶液，A5 1mL

采用蒸馏水定容至1000mL。

一种如上所述的斜生栅藻的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的N浓度增加到原来的三倍，即采用3N浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：

NaNO₃，4.5g

K₂HPO₄，0.04g

MgSO₄.7H₂O，0.075g

CaCl₂.7H₂O，0.036g

Na₂CO₃，0.02g

柠檬酸，0.006g

柠檬酸铁，0.006g

微量元素溶液，A5 1mL

采用蒸馏水定容至1000mL。

一种如上所述的斜生栅藻的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的P浓度增加到原来的三倍，即采用3P浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：

NaNO₃，1.5g

K₂HPO₄，0.12g

MgSO₄.7H₂O，0.075g

CaCl₂.7H₂O，0.036g

Na₂CO₃，0.02g

柠檬酸，0.006g

柠檬酸铁，0.006g

微量元素溶液，A5 1mL

采用蒸馏水定容至1000mL。

所述的斜生栅藻的培养方法，使藻株在温度15～40℃，光强500～2500lux，pH7-9的条件下生长，培养至对数生长后期，藻细胞在6～12h内完全自然沉降，倒出上层的培养基，即得到高浓度的藻液。

所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其在1/4N BG11培养基中大量培养，生长不受影响，油脂含量最高，获得的含油藻细胞在转脂化生产生物柴油中的应用。

所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其大量培养获得的斜生栅藻SoHNCJ2的多不饱和脂肪酸含量较高，用于动物饲料的添加。

所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其在3N和3P培养基中生长不受影响，其培养方法在有机污染污水处理中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明的斜生栅藻能够在较低浓度的N源条件下持续快速生长，节约成本。在较低N浓度条件下，藻细胞能够有效积累大量油脂，能够进行转脂化生产生物柴油。

2、本发明斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法，藻细胞能够在6～12h内自然沉降，无需添加絮凝剂，收集方法简单，节约成本，减少对环境的污染。

3、本发明斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法，藻细胞内油脂中多不饱和脂肪酸含量高，能够作为动物饲料的直接营养添加剂。

4、本发明斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法，应用于有机污染污水处理，具有一定的水体净化效果，可以降低水体的富营养化。因为栅藻对有机污染物具有较强的耐性，因此可在培养基中添加一定比例的有机污染污水，既净化水体，又减少成本。

附图说明

图1是本发明分离纯化的藻细胞在高倍显微镜下的藻细胞形态示意图；

图2是本发明分离纯化的藻株16SrDNA序列的进化树分析；

图3是本发明分离纯化藻株在不同N浓度下的生长曲线；

图4是本发明分离纯化藻株大量培养后自然沉降示意图；

图5是本发明分离纯化的斜生栅藻在高N、P浓度中的生长曲线。

具体实施方式

实施例1

一株斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其保藏编号为CCTCC NO：M2016253， 保藏日期为2016年5月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

实施例2

一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2的分离纯化方法，包括如下步骤：

1)从平顶山市新城区平西湖水库多点采集水样，将采集的水样稀释后均匀涂布在1.5～2％琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养；

2)待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养；

3)再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释涂平板的方法进一步纯化藻种；

4)挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2～4次后得到较为纯净的单一藻落。

培养基采用淡水蓝藻培养基BG11。

分离纯化的斜生栅藻藻株SoHNCJ2的鉴定方法：

1)藻细胞形态鉴定：

藻细胞在在1000倍光学显微镜下进行观察，藻细胞形态见图1所示：藻细胞黄绿色，呈卵圆形，多为2个细胞成对排列，细胞壁平滑，细胞两端具弯曲的长刺，细胞内有大量颗粒物，色素体周生，具1个蛋白核。单个细胞大小：长6-8um，宽2-3um，初步鉴定为栅藻。

2)16S rDNA分子鉴定：

采用CTAB法提取基因组DNA，方法如下：先将2×CTAB在65度预热备用；12000rpm离心收集1.5mL或更多的生长至对数后期的藻细胞于eppendorf管中；破细胞，加入约100μL的2×CTAB及少量石英砂涡旋震荡，再加入约300μL预热的2×CTAB，置于65度温浴0.5-2h；待冷却至室温，加入400μL氯仿：异戊醇(24：1)，颠倒混匀乳浊状，12000rpm离心10min，上清转入新的eppendorf管中，加入1/5体积的5M NaCl和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20度沉降。12000rpm离心10min，弃上清，得到的沉淀加入500μL 70％的乙醇，离心3min，弃上清。得到的总DNA在超净台晾干后溶于适量体积灭菌水或TE缓冲液中。

以藻细胞基因组DNA为模板，通过引物18S-1：(5＇-TGGTTGATCCTGCCAGTAGTC-3＇)和18S-2：(5＇-TGATCCTTCTGCAGGTTCACC-3＇)进行PCR扩增。50μL的PCR反应体系包括：10×Taq buffer 5μL、MgCl₂>

扩增得到的PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测扩增得到目的片段后，再用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶回收试剂盒(Bioflux)回收纯化目的片段。按照实际盒提供的说明书进行操作，基本过程如下：切下含目的片段的胶条，向其中加入等体积的Extraction buffer，55度温浴10min左右；待样品冷却至室温后转至纯化柱 中，6000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；再加入500μL Extraction buffer 12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；加入750μL Washing buffer 12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；然后12000rpm离心1min至Washing buffer除尽；将纯化柱置于干净的1.5mL离心管中，加入30μL预热的灭菌水或TE缓冲液于纯化柱上，放置1min后12000rpm离心1min，回收纯化的DNA送往上海生工进行测序。测序结果在NCBI上进行Blast分析，鉴定藻株所属的种类。

分离纯化的藻株的16SrDNA序列(测序结果)如下：

>SoHNCJ2

CGCAGGGCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAACGAGATCTTTTTCTTGTGCCGTTCCGCGGACCAAGAGAAAGATTGCAGTGGCGGACGGGTGAGGAACACGTAAGAACTTACCTTTTGGCGGGGGATAACATCGGGAAACTGTTGCTAATACCCCATAATGCTGAGGAGCGAAAGGGAAACCACCAAAAGAGAGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGCGGAGGTAAATGCTCCCCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAATACCGCGTGAGGGATGACGGATCGTGGTCTGTAAACCTCTTTTCTTAAGGAAGAATCAATGACGGTACTTAAGGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGGGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATGATTGGGCGTAAAGCATCTGTAGGTGGTTCTTCAAGTCGACTGTTAAAGCCCAGGGCTTAACTTTGGAGAAGCGGTCGAGTACTTAGGGACTTGAGTTTGGTAGGGGTAGAGGGAATTCCTAGTGGAGCGGTGAAATGCACAGAGATTAGGAAGAACACCGAGGGCGAAAGCACTCTACTGGGCCACAACTGACACTGAGAGATGAAAGTTGGGGGAGCGAAAAGGATTAGATACCCTTGTAGTCCCAACTGTAAACGATGGATACTAAGTGCTGGCAAAACCAGTGCTGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGAACTGGCACAAGCGGTGGATTATGCGGGTTTAATTCGATGATACACGAAGAACCTTACCATGGATTGACATGCTCATAACTTCTGAGAGATCGGGACGGTGCCCGTTTTCAAACACGGGAGTTGAGACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGAGTTAAGTCTTTAAACGAGCGCAACCCTTATCTTTTGCTACCACTTTTTTGAAAAGAACTCAAAAGAGACTGCCGCGTAATCGGGAGGCATGAGAGGATGACGTCAGTCAGCATGCCCGTACATCATGGGCCTACCGCGTACTACATGCAAGAACAATAGGACCGAACTCGGGAGGGGGGAAGCATCTAGCTAACTTTGTTCTCTCAGTTCGGAATTGAAAGT

下表为分离纯化的藻株16S rDNA序列比对结果：

序列比对结果显示，所分离纯化的藻株SoHNCJ2的16S rDNA序列与斜生栅藻的相似度最高，达到90％。

图2是本发明分离纯化的藻株16S rDNA序列的进化树分析。进化树分析结果表明，所分离纯化的藻株与斜生栅藻的进化关系最近。

实施例3

本实施例为所述斜生栅藻藻株SoHNCJ2的规模化培养方法及其用于转脂化生产生物柴油方法。

1.藻细胞的培养

培养基配方：淡水蓝藻培养基BG11的N浓度降低到原来的1/4，即为1/4N BG11的培养基。培养基配方：NaNO₃，0.375g；K₂HPO₄，0.04g；MgSO₄.7H₂O，0.075g；CaCl₂.7H₂O，0.036g；Na₂CO₃，0.02g；柠檬酸，0.006g；柠檬酸铁，0.006g；微量元素溶液A5>

微量元素溶液A5：H₃BO₄，2.86g；MnCl₂.4H₂O，1.81g；ZnSO₄，0.222g；Na₂MoO₄，0.39g；CuSO₄.5H₂O，0.079g；Co(NO₃)₂.6H₂O，49.4g。

藻细胞培养温度30℃，光强2000lux。

2.1/4N浓度对藻株生长的影响

配置1/4N浓度和正常的BG11液体培养基，每500mL三角瓶中装入300nL培养基。藻种培养至对数生长期后，离心收集洗涤一次后，接种于不同N浓度的培养基中，调整初始OD值为0.05左右，然后放置于30℃、2000lux的条件下培养，每天摇动两次，每隔三天测定OD₇₃₀吸光值。

图3所示为本发明分离纯化藻株在不同N浓度下的生长曲线。如图3所示，N浓降低不影响藻细胞的生长速率，藻细胞持续对数生长，说明斜生栅藻能够耐受较低N浓度，在大规模培养时节约N源，降低成本。

3.藻细胞的收集

如图4所示藻细胞在6-12h内能够完全沉降，因此所采用的收集方法为自然沉降，收集方法简单，无需添加任何絮凝剂。

4.油脂的提取方法

培养至平台期的微藻，离心收集藻细胞，80℃烘干至恒重后，按照以下方法提取总脂，称取总脂的重量，然后计算油脂的百分率。

用氯仿/甲醇萃取的方法提取油脂。6000rpm离心10min收集藻细胞；弃上清，加入1mL的1:1的氯仿/甲醇，涡旋振荡1-2min；加入0.3mL的1mol/L的KCl+0.2mol/L的磷酸混合液，振荡，使相位分离；6000rpm离心10min，取下层氯仿相至称量瓶中；置于通风橱中吹干溶剂，称取油脂的重量。

培养基中N浓度 油脂含量 1/4N 26.54％ 1N 15.42％

在1/4N浓度的BG11培养基中，细胞内油脂积累增高，高达27％，显著高于BG11培养基，因此1/4N BG11培养基大量培养斜生栅藻可用于油脂的提取，制备生物柴油，同时减少N的使用，节约成本，减少对水体的污染。

实施例4

本实施例为所述斜生栅藻藻株SoHNCJ2的规模化培养方法及其用于动物饲料多不饱和脂肪酸添加应用。

配置1/4N、3N、3P浓度和正常的BG11液体培养基，每500mL三角瓶中装入300nL培养基。藻种培养至对数生长期后，离心收集洗涤一次后，接种于不同N、P浓度的培养基中，培养至平台期后收集藻细胞，冷冻干燥用于脂肪酸成分分析

脂肪酸成分分析

油脂提取:收集藻体至10mL离心管中。加入3mL提取液(氯仿:甲醇＝2:1，含0.5mg/mL 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)，试管轻柔振荡过夜。5000rpm离心5min，分离开细胞碎片和油脂提取液。细胞碎片再次用3mL提取液浸泡，试管轻柔振荡过夜，再次分离细胞碎片和油脂提取液。合并两次的提取液即提取的油脂，用氮气吹干，4℃保存至分析时使用。

脂肪酸甲酯化及检测:

脂肪酸的甲酯化反应采用硫酸－甲醇加热法进行。脂肪酸的检测采用气相色谱法，检测系统：Agilent 7890A型气相色谱仪，FID检测器；色谱柱：

HP-5弹性石英(30m×0.32mm)。程序升温：初温210℃，保持9min，20℃/min升温，升温240℃，保持13min。内标法定量，内标物为二十二烷酸。

脂肪酸分析结果如下表所示：

脂肪酸成分分析结果显示在不同的N、P浓度培养条件下，多不饱和脂肪酸十八碳二烯酸和三烯酸含量较高，能够直接添加到动物饲料中，以提高动物饲料中的不饱和脂肪酸含量。

实施例5

所述斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法在有机污染污水处理中的应用。

配置3N和3P浓度和正常的BG11液体培养基，每500mL三角瓶中装入300nL培养基。藻种培养至对数生长期后，离心收集洗涤一次后，接种于高N、P浓度的培养基中，调整初始OD值为0.05左右，然后放置于30℃、2000lux的条件下培养，每天摇动两次，每隔三天测定OD₇₃₀吸光值。

如图5所示：斜生栅藻在高浓度的N、P中的生长速率与BG11培养基中速率基本一致在生长后期，在高N浓度培养基中的生长速率甚至略高于普通BG11培养基，说明斜生藻能够耐受有机污水中的高N、P浓度。此外，如下表所示高N、P浓度对藻细胞内油脂含量没有显著的影响。

培养基中N、P浓度 油脂含量 3N 23.16％ 3P 21.39％

因此在培养过程中添加一定比例的有机污水，既节约了成本，净化了水体。收集的细胞又可用于油脂提取，转脂化生产生物柴油。

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