一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法

摘要

本发明公开了一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法。本发明的二联重组蛋白包括连接在一起的创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分，其氨基酸序列分别包括SEQ ID NO 01的第238～456位和第467～695所示的氨基酸序列。本发明将创伤弧菌的外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分通过基因工程手段连接在一起构建二联重组蛋白，该蛋白免疫鳗鲡后，能同时防御创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌的感染，相比二联灭活疫苗具有更高的相对免疫保护效果和更低的毒副作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法。

背景技术

近20年来，我国淡水养殖鱼类出现暴发性败血症，给养殖业带来了不可估量的经济损失，研究表明该病的主要病原菌为创伤弧菌和迟顿迟钝爱德华氏菌。创伤弧菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是鳗鲡的重要病原菌，在春夏交替时节能引起鳗鲡出血性败血症、肝肾肿大、烂鳃病、烂尾病等传染性很强的疾病，人工养殖的美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡和日本鳗鲡均可发生。水产养殖业长期使用化学药物治疗该病，由于产生耐药性等原因，致使可用的安全药物越来越少。最近可见有关创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌全菌灭活苗和亚单位疫苗相关的研究，但要应用这些研究成果对鳗鲡进行免疫以预防多种病原菌的侵害，需要对鳗鲡进行多次注射操作，对鱼体伤害较大，且操作繁琐。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可作为疫苗使用的鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。

本发明的另一目的在于提供该二联重组蛋白的制备方法。

本发明的一技术方案是：

一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，包括连接在一起的创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分，其氨基酸序列分别包括SEQ ID NO 01的第238～456位和第467～695所示的氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分通过一段连接肽连接在一起，该连接肽的序列包括SEQID NO 01的第457～466所示的氨基酸序列。

本发明的另一技术方案是：

一种编码所述鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的基因序列，包括连接在一起的创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分的编码核苷酸序列和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分的编码核苷酸序列，上述编码核苷酸序列分别包括SEQ ID NO 02的第712～1368位和第1399～2085位所示的核苷酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分的基因序列和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分的基因序列通过一段包括SEQ ID NO 02的第1369～1398位所示的核苷酸序列编码一段连接肽的核苷酸序列连接起来。

本发明的再一技术方案是：

一种表达所述鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的质粒，包括负载有包括SEQ ID NO 02所示核苷酸序列的原核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为融合表达载体。

本发明的再一技术方案是：

一种表达所述鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的大肠杆菌，该大肠杆菌转化有负载包括SEQ ID NO 02所示核苷酸序列的原核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为融合表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为pGEX-2T-His或pGEX-2TH-his。

在本发明的一个优选实施方案中，所述用于表达的大肠杆菌为大肠杆菌BL21。

本发明的再一技术方案是：

一种上述鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别扩增编码创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分的基因序列，其氨基酸序列分别包括SEQ ID NO 01的第238～456位和第467～695所示的氨基酸序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO 02的第831～1612位和第1399～2085位所示；

(2)将步骤(1)所得的两个基因序列连接在一起，得到融合基因序列；

(3)将步骤(2)所得的融合基因序列连接到原核表达载体中，构建重组表达载体；

(4)将步骤(3)中所构建的重组表达载体转化到原核宿主细胞中，并在适于表达所述融合基因的条件下培养被转化的原核宿主细胞；

(5)回收并纯化所培养的原核宿主细胞表达的融合蛋白；

(6)对步骤(5)所得的融合蛋白进行复性。

本发明的有益效果是：

1、本发明将创伤弧菌的外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分通过基因工程手段连接在一起构建二联重组蛋白，该蛋白免疫鳗鲡后，能同时防御创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌的感染，相比单种外膜蛋白的免疫具有更好的免疫效果；

2、本发明的二联重组蛋白仅需对鱼体进行一次注射，即可获得对两种病原菌的免疫效果，减少了对鱼体的伤害，简化了免疫步骤；

3、本发明的二联重组蛋白的制备方法适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例2中免疫后28d创伤弧菌攻毒后的鳗鲡存活率曲线图。

图2为本发明实施例2中免疫后28d迟顿爱德华氏菌攻毒后的鳗鲡存活率曲线图。

图3为本发明实施例2中鳗鲡经免疫后不同时期血清特异性抗体的ELISA效价变化图。

图4为本发明实施例2中鳗鲡经免疫后在血清、粘液、肝脏组织和肾脏组织悬液不同时期的溶菌酶的活性变化图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

本实施例进行本发明的鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。

(OMP-Vibrio-Edwa)的制备

(1)选取的创伤弧菌外膜蛋白ompU和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白ompA基因中膜外区域免疫原性和亲水性均较好的DNA片段，将选取的两个片段中间用接头连接起来，设计扩增OmpU基因部分片段的上游和下游引物分别为:P1:5'CCG GAA TTC TAC GCAGGT CTA GGC GGC AAG T 3'(SEQ ID NO 03，31bp，引入EcoRⅠ位点)；P2:5'ACC CGAGCC ACC ACC GCC CGAGCC TAT ACG AGC GTA GCC AGC ACC GCC AAC T 3'(SEQID NO 04，52bp)；扩增OmpA部分基因的上游和下游引物分别:P3:5'TCG GGC GGT GGCGGC TCG GGT GGC GGA TCA GTA TGG CGT TCT GAT ATC CAC GG3’(SEQ ID NO 05，53bp)；P4:5'CGC GTC GAC CTG CGG CTG AGA AAC TTC TTC TT 3'(SEQ ID NO 06，32bp，引入SalⅠ位点)。上述引物均由上海捷瑞生物工程公司合成，其中引物P 2 5″端的21个碱基(3't caa ccg cca cga ccg atg cga gca tat ccg agc ccg cca cca ccg agc cca)5'和P3 5'端21个碱基(5'tcg ggc ggt ggc ggc tcg ggt ggc gga tca gta tgg cgt tct gat atc cac gg3’)互补，中间接头共30bp。(cgtataggctcgggcggtggtggctcgggt)。

以创伤弧菌的基因组DNA作为PCR反应模板,以P1和P2为引物，扩增OmpU基因片段，回收PCR产物；采用如下体系(50μL)扩增基因片段：

PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃梯度退火1min(每个梯度增加一度)，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。采用1％琼脂糖电泳检验PCR产物后，发现最佳退火温度为56℃，然后再大量跑胶割胶回收创伤弧菌OmpU基因片段，使用胶回收试剂盒进行回收，并使用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测回收后的核酸浓度。

以迟钝爱德华氏菌的基因组DNA作为PCR反应模板，以P3和P4为引物,扩增OmpA基因片段，回收PCR产物，PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃梯度退火1min(每个梯度增加一度)，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。采用1％琼脂糖电泳检验PCR产物后，发现最佳退火温度为58℃，然后PCR扩增后胶回收迟钝爱德华氏菌OmpA基因片段，并使用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测回收核酸的浓度。

(2)将上述所得的创伤弧菌的外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分的核苷酸序列连接在一起，得到融合基因序列，连接方法具体如下：

a将扩增到的目的序列胶回收，方法同E.Z.N.A.^TM>

b采用两步法连接上述两个胶回收的DNA基因片段：采用梯度PCR法确定最佳退火温度，条件和体系如下：

第一步，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸4min，13个循环；4℃保存。反应体系：

第二步，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，56.3℃退火45s，72℃延伸4min，13个循环；72℃延伸，4℃保存。反应体系：

反应完成后，纯化PCR产物，即得PCR产物G-Vibrio-Edwa(包括SEQ ID NO 02所示的序列)；

(3)对获得的PCR产物G-Vibrio-Edwa进行加polyA尾，采用加尾试剂盒进行加尾，然后用胶回收试剂盒进行回收，获得带有polyA尾的目的片段，将该目的片段和融合表达载体pGEX-2TH-his(购自GE healthcare)均用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后在T4DNA连接酶的作用下进行连接以获得重组表达载体；

(4)将重组表达载体转化入大肠杆菌BL21感受态细胞内，得重组菌BL21；用终浓度0.25mM～2.0mM的IPTG在16～37℃的温度下诱导重组菌BL21表达重组蛋白(OMP-Vibrio-Edwa)1.5～9小时，其中菌液初始浓度为OD₆₀₀nm＝0.1～1.0。

(5)收集诱导后的重组菌BL21的菌体，进行超声波破碎，离心(4℃，10000rpm，5min)收集洗涤沉淀后，用预冷的PBS重悬沉淀并，同样条件离心后，取上清液进行纯化；将上述上清液用镍柱进行结纯化，得融合蛋白OMP-Vibrio-Edwa；

(6)将洗脱的OMP-Vibrio-Edwa用透析法进行复性，复性完成后进行冻干即得本发明的鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白(包括SEQ ID NO 01所示的序列)。

实施例2

(1)将PBS空白对照、创伤弧菌与迟钝爱德华氏菌二联灭活菌液和实施例1所得的本发明的鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白分别用腹腔注射的方式对三组鳗鲡(50g/尾)进行免疫，每组鳗鲡分别对应PBS对照组(PBS Group)、二联灭活菌免疫组(Bivalent FKC Group)和双表达外膜蛋白免疫组(Bivalent OMP Group)，其中本发明的鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白在试验前用0.01M的PBS(pH＝7.4)配制成1mg/mL，将之与等量的弗氏不完全佐剂充分混匀，终浓度为0.5mg/mL；创伤弧菌和迟顿爱德华氏菌分别于28℃和32℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养24h后，用0.01M的PBS(pH＝7.4)分别配成5.0×10⁸cfu/mL的菌液(OD_595nm＝0.5)后等量混匀，于混合液中加入与菌体等量的弗氏不完全佐剂和终浓度为0.4％的福尔马林，4℃静置24h后取少量菌液涂布于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，培养24h无菌落生长时即为创伤弧菌与迟钝爱德华氏菌二联灭活菌液；PBS空白对照为0.01M>

实验样品的采集方法具体为：鳗鲡分别于免疫后14d、21d、28d和42d用丁香酚(100ppm)麻醉采血，每组每次取5尾鳗鲡血液。每尾鳗鲡约0.5mL血液用20μL的肝素钠抗凝(0.5UI/μL)后4℃静置过夜，吸取上层血浆测定其抗体效价和溶菌酶含量，同时分离不同细胞成分进行培养与转化实验。于采血前每尾鳗鲡取粘液0.1g，采血后取肝脏和肾脏组织各0.1克，上述粘液和组织均加入0.5mL 0.01M的PBS(pH＝7.4)进行匀浆和超声处理，10000rpm离心后取上清，-70℃保存备用

(2)上述三组鳗鲡免疫后28d，采用创伤弧菌(6×10⁸cfu/尾)和迟顿爱德华氏菌(2×10⁶cfu/尾)分别进行攻毒感染。如图1所示，感染创伤弧菌后PBS对照组、二联灭活菌免疫组和双表达外膜蛋白免疫组的鳗鲡在14d内的死亡率分别为50％、10％和0％；与PBS对照组相比，二联灭活菌免疫组和双表达外膜蛋白免疫组对鳗鲡的相对免疫保护率分别为80％和100％，卡方检验结果表明，攻毒后第5d至14d以后，双表达外膜蛋白免疫组的存活率与对照组相比显著提高(p<0.05)，但PBS对照组和二联灭活菌免疫组的区别在攻毒14d后的区别未达到显著水平(p>0.05)；如图2所示，攻毒感染迟顿爱德华氏菌后，PBS对照组、二联灭活菌免疫组和双表达外膜蛋白免疫组的鳗鲡在14d内的死亡率分别为60％、30％和10％；与PBS对照组相比，二联灭活菌免疫组和双表达外膜蛋白免疫组对鳗鲡的相对免疫保护率分别为50％和83％。卡方检验结果表明，攻毒感染后第12d至14d，双表达外膜蛋白免疫组的相对免疫保护率显著(p<0.05)高于对照组，而PBS对照组和二联灭活菌免疫组的区别在攻毒14d后的区别未达到显著水平(p>0.05)。

如图3所示，鳗鲡经免疫处理后，二联灭活菌免疫组和双表达外膜蛋白免疫组相对PBS对照组在实验期内(14、21、28和42d)均具有更高的抗体反应，但除了42d(^##P<0.01)以外，双表达外膜蛋白免疫组和二联灭活菌免疫组之间的抗体滴度均无显著差别。从14d至28d，双表达外膜蛋白免疫组和二联灭活菌免疫组的log>

如图4所示，免疫后14d，二联灭活菌免疫组的血清溶菌酶活性显著(*P<0.05)低于对照组，而免疫后21d，双表达外膜蛋白免疫组的血清溶菌酶活性显著(*P<0.05)高于其他两组，到28d和42d，三组中的血清溶菌酶活性降低到相同水平(图4A)；免疫后14至42d，除了21d时，双表达外膜蛋白免疫组与其他二组出现显著性(P<0.05)差异，其余时间，三组的粘液溶菌酶活性保持在相同水平(图4B)；免疫后21d，二联灭活菌免疫组的肝脏溶菌酶活性显著(P<0.01)高于其他两组，免疫后28d，双表达外模蛋白免疫组与PBS对照组之间具有显著性(P<0.01)差异，二联灭活菌免疫组与PBS对照组之间具有显著性(P<0.05)差异(图4C)；与PBS对照组相比，二联灭活菌免疫组的肾脏溶菌酶活性在免疫后14d相比PBS对照组显著性(P<0.01)增加，双表达外膜蛋白免疫组的肾脏溶菌酶活性在免疫后28d相比PBS对照组显著性(P<0.01)增加，双表达外膜蛋白免疫组和二联灭活菌免疫组的肾脏溶菌酶活性在免疫后28d出现显著性差异(P<0.01)(图4D)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。