用于同时检测四种病原菌的试剂盒及其非诊断性检测方法

摘要

本发明公开了采用荧光定量PCR同时检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的试剂盒和非诊断性检测方法，试剂盒中包括对应四种病原菌的特异性引物和探针。本发明提供的试剂盒使用方便，所用的试剂少，成本低，检测的特异性强，灵敏度高；检测方法实现了对同一个样本，可进行四种病原菌的检测，大大简化了操作过程，减少了重复操作的步骤，节省时间，减轻重复操作消耗的劳动力，并有效节约成本，实现快速筛查。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及同时检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的试剂盒及其非诊断性检测方法。

背景技术

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)为革兰染色阴性短小杆菌，是鼠疫的病原菌，动物和人间鼠疫的传播主要以鼠蚤为媒介。当鼠蚤吸取含病菌的鼠血后，细菌在蚤胃大量繁殖，当蚤再吸入血时，又将病原菌带入动物或人体内。蚤粪也含有鼠疫杆菌，可因搔痒进入皮内。此种“鼠→蚤→人”的传播方式是鼠疫的主要传播方式，少数可因直接接触病人的污染物而受染，并且肺鼠疫患者可借飞沫传播，造成人间肺鼠疫大流行。鼠疫在临床上有腺型、肺型、败血型及轻型等四型，除轻型外，各型初期的全身中毒症状大致相同。其主要的检测肝脏、肺部、淋巴组织等器官。

土拉菌(Francisella tularensis)是一种革兰氏染色阴性的球杆菌，能引起的土拉菌病(tularem ia，简称土拉热或野兔热)，是一种典型的人兽共患病，该病原菌因其传播途径多样，易扩散，毒性强，土拉菌在自然界的媒介主要为节肢类动物如多种蜱类，而宿主主要包括野兔及野鼠类等。在许多疫源地内，通过蜱叮咬而感染的病例非常普遍，而近年来有关经鼠类传播感染人“野兔热”的报道日益增多，严重威胁人类的生命安全。

类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)为细胞内寄生的革兰阴性杆菌，能引起的类鼻疽病是一种重要的人兽共患病疾病，由于对人或动物具有高度致病性、死亡率很高。人鼻疽的传播途径通常是经过感染材料进入皮肤擦伤或伤口引起慢性形式的疾病；但通过蓄意释放或气溶胶浓缩获得的感染常引起急性鼻疽，不及时治疗，几天内死亡且可作为潜在的生物武器，美国CDC将其列为B类生物恐怖剂。

目前，类鼻疽伯克霍尔德菌引发的类鼻疽病已经成为世界性问题(Dance D，2000)，且迄尚没有可供使用的抗类鼻疽的疫苗。因此，及时、准确地做出诊断，对于提高治愈率、控制感染菌扩散和流行病学研究等，均具有重要意义。

布鲁菌(Brucella)是一种革兰氏阴性、无芽孢、兼性细胞内寄生的细菌，根据抗体的变化和主要宿主把布鲁菌属的细菌分成6个种：羊种布鲁菌(B.mel itensis)、猪种布鲁菌(B.sui s)、牛种布鲁菌(B.a bortus)、犬种布鲁菌(B.cani s)、绵羊种布鲁菌(B.ovis)、森林鼠种布鲁菌(B.neotoma e)。鲁氏菌引起的布鲁菌病是引起的世界五大人畜共患传染病之一能引起人和多种动物的急性和慢急性感染，目前已知有60多种家畜、家禽，野生动物是布鲁菌的宿主。与人类有关的传染源主要是羊、牛及猪，其次是犬和鼠。染菌动物首先在同种动物间传播，造成带菌或发病，随后波及人类被感染的人和动物表现为流产及不孕不育等症状。本病流行于世界各地(Jonas M et al，2010)据调查全世界160个国家中有123个国家有布鲁菌病发生，给人类的生命和财产带来了巨大的威胁。

综上所述，鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌是四种重要人兽共患病的病原体，分布广泛、危害严重。因此建立一种同时快速检测这四种病原体的方法，在公共卫生安全、生物恐怖袭击、出入境检验检疫方面具有重要的意义。

现有技术中用于单一检测病原的方法很常见，但能够实现同时检测上述四种病原的检测方法很罕见，现有专利公开号为CN101560557，公开了一种联合检测五种烈性病原菌的基因液相芯片及其非诊断性检测方法，采用基因液相芯片检测同时检测炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁菌和类鼻疽伯克霍尔德菌五种病原体。检测过程中需要有5种编码微球与与捕获探针偶联，需要将微球洗涤，活化，操作复杂，有时偶联失败，会导致后续检测结果无效，浪费了人力物力。且采用的悬浮芯片检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色激光对表面结合的荧光染料进行识别，编码微球的试剂较贵，所用试剂EDC、链亲和素-藻红蛋白需要进口试剂，国产试剂效果不佳，仪器也不是普通的检测单位所具备的，采用血球计数器计数微球的数量时需要高倍数的微生物显微镜，检测荧光时需要悬浮芯片检测仪，所以采用基因液相芯片检测这几种病原的局限性很大，为此需要一种能同时检测这几种病原，且检测试剂容易获得，适用于现有单位均可实现检测目的的检测试剂及检测方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一组用于同时检测检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的核酸。本发明还提供一种用于荧光定量PCR同时检测检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的试剂盒及其非诊断检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于多重PCR同时检测四种病原菌的核酸，包括鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物，其中，所述鼠疫耶尔森菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

所述土拉菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；

所述类鼻疽伯克霍尔德菌的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示；

所述布鲁菌的上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示。

一组用于荧光定量PCR同时检测四种病原菌的核酸，包括如上所述鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物和各病原菌对应的探针，

所述鼠疫耶尔森菌的探针序列如SEQ ID No.3所示；

所述土拉菌的探针序列如SEQ ID No.7所示；

所述类鼻疽伯克霍尔德菌的探针序列如SEQ ID No.11所示；

所述布鲁菌的探针序列如SEQ ID No.15所示。

如上所述的核酸，优选地，该组核酸还包括包含检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的阳性扩增产物序列，其中，

所述检测鼠疫耶尔森菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.4所示的序列；

所述检测土拉菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.8所示的序列；

所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.12所示的序列；

所述检测布鲁菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.16所示的序列。

一种用于荧光定量PCR同时检测四种病原菌的试剂盒，该试剂盒包括：上述鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记FAM-BHQ1、Texred-BHQ2、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。

如上所述的试剂盒，优选地，还包括检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的阳性扩增产物序列，其中，

所述检测鼠疫耶尔森菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.4所示的序列；

所述检测土拉菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.8所示的序列；

所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.12所示的序列；

所述检测布鲁菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.16所示的序列。

如上所述的试剂盒，优选地，还包括Premix EX TaqTM×2。

一种用于荧光定量PCR同时检测四种病原菌的非诊断性检测方法，该方法用于检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌，具体包括以下步骤：

(1)从样品中提取细菌DNA；

(2)对提取的所述细菌DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，所述鼠疫耶尔森菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM和BHQ1；所述土拉菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，其探针5'端和3'端分别对应标记Texred和BHQ2；所述类鼻疽伯克霍尔德菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，其探针5'端和3'端分别对应标记JOE和TAMRA；所述布鲁菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14和SEQ ID No.15所示，其探针5'端和3'端分别对应标记CY5和BHQ3；

(3)收集荧光信号，选择步骤(2)中的荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：

1×Premix EX TaqTM，

所述鼠疫耶尔森菌上游引物的终浓度为0.48μmol/L，下游引物的终浓度为0.48μmol/L，探针的终浓度为0.104μmol/L；所述土拉菌上游引物的终浓度为0.48μmol/L，下游引物终浓度为0.48μmol/L，探针的终浓度为0.104μmol/L；所述类鼻疽伯克霍尔德菌上游引物终浓度为0.64μmol/L，下游引物终浓度为0.64μmol/L，探针的终浓度为0.136μmol/L；所述布鲁菌上游引物终浓度为0.64μmol/L，下游引物终浓度为0.64μmol/L，探针的终浓度为0.136μmol/L；

所述样品的DNA为1μL；

同时设置无核酸酶水为阴性对照；

同时分别设置包含如SEQ ID No.4所示的序列、SEQ ID No.8所示的序列、SEQ IDNo.12所示的序列、SEQ ID No.16所示的序列的基因作为阳性对照。

如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：预变性阶段95℃，5min；扩增阶段94℃，15sec；60℃，30sec；72℃，1min，45个循环；72℃，10min；4℃保温。

如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为35，当Ct值≤35时，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40时，无明显扩增曲线为阴性结果。

本发明提供了用于检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的核酸组，该组核酸可用于单一病原菌的检测，也可用于几种病原菌同步检测的多重扩增使用。用于同步检测这四种病原菌时，经过验证，相互之间不发生交叉反应，其检测灵敏度高，特异性强。

本发明还提供了一种用于荧光定量PCR同时检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的试剂盒，同时建立了一种比较高效、灵敏的，可同时检查这四种病原的非诊断性方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性结果的发生。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统病原菌分离培养来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，成本低，大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，也就减少了在操作过程的污染，避免重复操作而消耗过多的劳动力，节省时间，有效节约成本，实现了快速筛查，所用试剂盒的检测效果好，特异性强，灵敏度高。

提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号的变化来获得定量的结果，不需要普通PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的筛查检测。

被病原菌感染，在潜伏期和隐性阶段，没有出现相应病理病症，一般很难发现和控制，而本发明提供的试剂盒具有较高的检测灵敏度，且对1个样本的检测可实现对四种病原菌的排查，且主要是检测待测样本中是否含有鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的核酸，并不是针对疾病的诊断。一般疾病的诊断，应对病人的病症综合评价，才能确诊，该检测方法只是检查是否有相应病原菌的核酸，属于非诊断性的检测。该检测方法可以有助于，提前发现感染这四种病原菌的携带者，以及出现无病症症状的潜伏期及不发病的隐性感染者，为能及时有效控制鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的传播与扩散，提供有效的技术支持。

附图说明

图1为本发明荧光定量PCR同时检测四种病原菌时，检测鼠疫耶尔森菌的灵敏度测试结果图。

图2为本发明荧光定量PCR同时检测四种病原菌时，检测土拉菌的灵敏度测试结果图。

图3为本发明荧光定量PCR同时检测四种病原菌时，检测类鼻疽伯克霍尔德菌灵敏度测试结果图。

图4为本发明荧光定量PCR同时检测四种病原菌时，检测布鲁菌的灵敏度测试结果图。

图5为本发明荧光定量PCR同时检测四种病原菌的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容，所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1 引物、探针的设计

首先分别筛选四种病原菌的特异目标基因，根据检测目的，对每种病原菌从GenBank下载多条病原菌基因序列，进行比对分析，选取保守区，采用Array Designer4.0software软件辅助设计扩增引物及适合荧光定量PCR反应体系的杂交探针。

由于本发明是多重荧光定量，首先探针标记的选择比较关键，其次软件设计出来的探针要经过筛选，四个基因的探针信号不能相互干扰，这就需要在设计探针时考虑四对引物和四条探针之间都不能相互干扰。

荧光定量PCR检测是在普通PCR检测的基础上，进一步通过特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。所以荧光定量PCR检测的前提是要进行PCR扩增反应，扩增反应之间的引物及产物需尽量避免交叉反应，再进一步保证特异性探针与各个扩增产物、引物均不应有交叉反应。又由于本发明是多重荧光定量，所以探针标记的选择也比较关键，不仅要对软件设计出来的探针要经过筛选，四个基因的探针信号还不能相互干扰。

分别设计出鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌特异的多条引物序列和杂交探针序列，采用NCBI Blast在线分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对拟选用的探针和引物组合进行序列同源性和适配性分析评估，并通过检测试验验证，最终选定这四种病原菌特异，且适合多重荧光定量反应体系的引物与探针组合。

需要注意的是，设计时，普通PCR引物的设计原则并不适用荧光定量PCR引物的设计，荧光定量PCR引物的设计比普通PCR引物的设计要求苛刻，但是荧光定量PCR引物是肯定可用于普通PCR扩增反应的。

对于每种病原菌设计的扩增引物首先要进行单个病原菌的扩增检测，确认单个病原菌扩增检测没有非特异性扩增后，再进行多重病原菌的扩增，设计引物就需要尽量避免发生交叉反应，还要考虑扩增条件要尽量一致，最终通过杂交反应排除交叉反应；根据上述设计、生物信息学分析和发明人的经验设计及大量实验检测试验筛选结果确定以下序列：

鼠疫耶尔森菌特异的扩增引物对和探针：如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.3所示的杂交探针序列，具体如下：

SEQ ID No.1：5′-atgtcacacctaatgccaaagtctt-3′

SEQ ID No.2：5′-gccaatagagacagaatctccacta-3′

SEQ ID No.3：5′-cagtaaatatgatgagggcaaaggaggtactc-3′

土拉菌特异的扩增引物对和探针：如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.7所示的特异探针序列，具体如下：

SEQ ID No.5：5′-ttggtagatcagttggtggga-3′

SEQ ID No.6：5′-agctactttactatcatgag-3′

SEQ ID No.7：5′-cctaaagcatcagtcatagcatgg-3′；

类鼻疽伯克霍尔德菌特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10所示的特异扩增上下游引物，以及如SEQ ID No.11所示的杂交探针序列，具体如下：

SEQ ID No.9：5′-cggaaaaagagccgacacgcgtct-3′

SEQ ID No.10：5′-ggtcagtatccgtaacagcttcat-3′

SEQ ID No.11：5′-cgtgcacaccggtcagtatc-3′。

布鲁菌亚型特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.15所示的特异探针序列，具体如下：

SEQ ID No.13：5′-cgcgcttgcctttcaggtctg-3′

SEQ ID No.14：5′-tggctcggttgccaatattca-3′

SEQ ID No.15：5′-accgatttgatgtttgcatccttacgc-3′。

本发明中，探针的设计尤为关键，探针可以在引物扩增的片段之间进行选择，但自身不可形成引物二聚体，否则会导致假阴性检测结果，用于多重病原菌进行检测时，不可进行多重检测的片段之间有交叉反应，否则会导致假阳性结果。设计探针时要使每种病原体探针的报告基团的荧光发射最大波长处于不同的光谱范围，以确保荧光定量PCR仪的检测通道能区分每种病原体的探针。所以设计中，除了用primer select软件进行评估，确保理论上的尽可能符合多重反应以外，还应根据反应的扩增曲线进行引物和探针浓度的适当调整，直至扩增出最佳扩增曲线。

本发明选用的FAM、JOE、Texred和CY5四种荧光染料，其波长处于不同光谱范围，相互间不能干扰，具有明显的区分效果和信号强度。

经大量实验验证，采用上述引物、探针时，可单独用于检测各对应的病原菌的检测，其探针的5′端和3′端分别可选用标记FAM-BHQ1、Texred-BHQ2、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。但进行同时检测四种病原菌时，各探针标记则应对应标记这四种组合关系，也就是说采用FAM-BHQ1、Texred-BHQ2、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3分别标记鼠疫耶尔森菌的探针，土拉菌的探针，类鼻疽伯克霍尔德菌的探针，布鲁菌的探针，各探针5′端和3′端标记是不重合的，但是可随意进行组合，检测结果不受影响，当然单独一个病原菌进行检测时，探针也可选用其它荧光基团如VIC、NED等作为发光基团，使用如BHQ和MGB等作为非荧光淬灭基团。

具体在本发明中，当的探针5′荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，以ABI7500(Applied biosyste)荧光定量PCR仪为例，第一到第四条检检测通过分别以FAM、Texred、JOE和Cy5标记。第一条检测通道检测鼠疫耶尔森菌,其荧光染料的检测波长约为520nm；第二条检测通道检测土拉菌，其荧光染料的检测波长约为580nm；第三条检测通道检测类鼻疽伯克霍尔德菌，其荧光染料的检测波长约为550nm；第四条检测通道检测布鲁菌，其荧光染料的检测波长约为650nm。以下实施例采用最优选的实施例来说明本发明。

实施例2 普通PCR检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌

根据实施例1筛选鼠疫耶尔森菌的Pla基因片段的保守序列，设计一对寡聚核苷酸序列(引物)和探针。最终确定鼠疫耶尔森菌引物扩增片段大小为113bp，核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。

SEQ ID No.4：atgtcacacc taatgccaaa gtctttgcgg aatttacata cagtaaatatgatgagggca aaggaggtac tcagatcatt gataagaata gtggagattc tgtctctatt ggc。

土拉菌选用ISFtu基因，引物扩增片段大小为113bp，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

SEQ IDNo.8：agctacttta ctatcatgag ttttaccttc tgacaacaat atttctattggattacctaaagcatcagtc atagcatgga ttttagtggt tatcccacca actgatctac caa。

类鼻疽伯克霍尔德菌选用BpTT基因，引物扩增片段大小为124bp，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

SEQ IDNo.12：cggaaaaaga gccgacacgc gtctctatac tgtcgagcaa tcggcggatatccggaatct ggatcaccac cactttccgt ccttgccctg gaatgagacc atgaagctgt tacggatactgacc。

布鲁菌选用BCSP31基因，引物扩增片段大小为224bp，核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

SEQ ID No.16：ggctcggtt gccaatatca atgcgatcaa gtcgggcgct ctggagtccggctttacgca gtcagacgtt gcctattggg cctataacgg caccggcctt tatgatggcaagggcaaggtggaagatttg cgccttctgg cgacgcttta cccggaaacg atccatatcg ttgcgcgtaa ggatgcaaacatcaaatcgg tcgcagacct gaaaggcaag cgcg。

应用设计的引物对同时对鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌进行普通PCR扩增，采用宝生物工程(大连)有限公司公司的Premix EX TaqTM×2，25μL反应体系：各上下游引物1.25μL；Premix EX TaqTM×2 12.5μL；模板1μL，其余用无核酸酶水补足。

PCR扩增反应条件优选为：

反应条件：预变性阶段95℃，5min；扩增阶段94℃，15sec；60℃，30sec；72℃，1min，45个循环；72℃，10min；4℃保温。

其中，设有阳性和阴性对照样品的检测，阴性对照为无核酸酶水；阳性对照为携带有如序列表SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12及SEQ ID No.16所示序列的质粒DNA。

对扩增产物进行电泳，结果显示，所设计的引物可有效扩增出对应鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌的阳性条带。

实施例3 四种病原菌荧光定量PCR检测试剂盒

鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的荧光定量PCR检测试剂盒包括以下成分：

Premix EX TaqTM×2；

鼠疫耶尔森菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示，探针SEQ IDNo.3的5′标记FAM，3′标记BHQ1；

所述土拉菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示，探针序列如SEQ ID No.7所示其中，探针SEQ ID No.7的5′标记Texred，3′标记BHQ2；

所述类鼻疽伯克霍尔德菌的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示，探针序列如SEQ ID No.11所示，其中，探针SEQ ID No.11的5′标记JOE，3′标记TAMRA；

所述布鲁菌的上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示，探针序列如SEQ ID No.15所示，其中，探针SEQ ID No.15的5′标记CY5，3′标记BHQ3。

进一步，为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有作为阳性对照及阴性对照试剂，阴性对照采用无核酸酶水；

阳性对照采用携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列分别如SEQID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16所示。

阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。

其中，所述Premix EX TaqTM×2、无核酸酶水可购自宝生物工程(大连)有限公司；引物、探针、质粒委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

实施例4 同时检测四种病原菌荧光定量PCR的方法

采用荧光定量PCR同时检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的方法包括以下步骤：

(1)病原菌DNA提取

病原菌DNA提取，即样品DNA的提取可选用QiagenDNA提取试剂(如可购Qiagen试剂公司)进行提取。

(2)荧光定量PCR扩增

采用实施例3制备的试剂盒配置反应体系，采用25μL反应体系：鼠疫耶尔森菌、土拉菌的上下游引物终浓度为0.48μmol/L，探针浓度为0.104μmol/L，类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌的上下游引物终浓度为0.64μmol/L，探针终浓度为0.136μmol/L，Premix EX TaqTM×2加入12.5μL，每个样品提取的DNA量加入1μL。

设置阳性对照时，分别采用含有各病原菌的阳性扩增序列的质粒替换样本DNA，设置阴性对照时，采用无核酸酶水替换样本DNA。

扩增条件：优选以下扩增条件：

预变性阶段95℃，5min；扩增阶段94℃，15sec；60℃，30sec；72℃，1min，45个循环；72℃，10min；4℃保温。

(3)收集荧光信号信号，分别选择FAM、Texred、JOE、Cy5的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性，具体本实施例中，阈值为35，当Ct值≤35，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40无明显扩增曲线为阴性结果。

实施例5 本发明试剂盒灵敏度的检测

用生理盐水分别悬浮鼠疫耶尔森菌、土拉菌和布鲁菌的菌体制成菌悬液，OD600在0.6～0.8之间时菌悬液浓度大概为10⁸cfu/mL以此为基础，使用无菌生理盐水做10倍系列稀释，直至稀释至浓度为10cfu/mL，取菌体浓度为10¹～10⁶cfu/mL的几个稀释梯度，进行涂板计数，每个浓度涂块板，于26℃培养；同时将系列稀释菌液(浓度为10¹～10⁶cfu/mL)取100μL，100℃加热10min，12000rpm离心3min，上清用作定量PCR反应的模板，反应时各取1μL均匀混合后，加入反应体系。

利用实施例3制备的试剂盒进行鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的检测，其中，

1)NTC：无核酸酶水；

反应体系采用25μL反应体系，由12.5μL Premix EX TaqTM×2，鼠疫耶尔森菌、土拉菌的上下游引物(20μM)均为0.6μL，类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌的上下游引物(20μM)均为0.8μL；鼠疫耶尔森菌、土拉菌的的探针(20μM)为0.13μL，类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌的探针(20μM)为0.17μL，样品DNA的量1.25μL。样本DNA采用上述稀释的阳性模板进行检测，优选扩增条件：95℃-10min；95℃-15s，60℃-60s；45个循环。实时荧光定量PCR检测在ABI7500PCR仪上进行。

2)每个梯度做三个平行样。

结果判定：Ct值≤35有明显扩增曲线为阳性结果，Ct值＞40无明显扩增曲线为阴性结果。

检测结果的荧光值图，其中，鼠疫耶尔森菌的灵敏度测试结果如图1所示，土拉菌的灵敏度测试结果如图2所示，类鼻疽伯克霍尔德菌灵敏度测试结果如图3所示，布鲁菌的灵敏度测试结果如图4所示。本发明方法检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、布鲁菌的灵敏度分别为100cfu/mL、140cfu/mL、80cfu/mL、60cfu/mL。

由标准曲线图5可知，鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的扩增斜率分别为-3.045、-3.238、-3.099、-3.47。根据扩增效率公式E＝10-1/k-1，分别计算出其扩增效率为112.8％，103.7％，109.8％和94.1％，其扩增效率在理论波动变化范围之内(90％<R2<120％)，具有很好的扩增效果。其r值分别为0.998、0.995、0.99和0.997，具有良好的线性关系。

实施例6 本发明试剂盒的特异性检测

1)对如下表中的菌株进行DNA提取，用QiagenDNA提取试剂盒提取肝脏组织DNA，表中菌株由中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所提供；

2)阴性对照：无核酸酶水；

3)模板：步骤1中提取的9株阳性菌株和20株同源菌株的DNA作为模板，

4)反应体系按照实施例4反应体系中配制，之后进行荧光定量PCR扩增。

检测结果如下表1，9株阳性菌株都呈阳性，20株同源菌株呈阴性，结果表明所建立的四种病原菌的荧光定量PCR方法具有很强的特异性。

表1 检测结果

实施例7：利用本发明试剂盒对样品进行检测

摘取3只体重约为20g的健康BALB/C小鼠的肝脏，按1g肝脏各注射入0.05ml四种病原菌的菌液(0.45×10⁶cfu/mL菌体)，室温下静止1小时后，用QiagenDNA提取试剂盒提取肝脏组织DNA作为检测模板，具体DNA提取操作详见试剂盒说明书。本发明的试剂盒对病原菌提取液进行检测。用实施例4所述方法检测鼠肝脏模拟DNA样本，结果显示，鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌都有明显示扩增曲线，结果都呈阳性，说明该检测方法对样品的检测具有很好的适用性，该检测在ABI7500荧光定量PCR仪进行。