发夹DNA支撑双信号分子传感界面的构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种发夹DNA支撑双信号分子传感界面的构建方法及其应用，传感界面的构建方法是将含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体I和含二茂铁探针的肿瘤标志物适体II共同孵育后，修饰在表面修饰有纳米金的电极表面即得；该方法获得的发夹DNA支撑双信号分子传感界面稳定性好，成本低，传感界面可以分别检测两种肿瘤标志物，也可以在同一界面上同时检测两种肿瘤标志物，且具有检测更简单、检出限低、灵敏度高、特异性强的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种发夹DNA支撑双信号分子传感界面的构建方法以及用所述传感界面同步检测两种肿瘤标志物的电化学方法；属于电化学生物传感器领域。

背景技术

癌坯抗原CEA是一种蛋白多糖复合物，可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，是一个广谱性肿瘤标志物，根据血清中CEA的含量初步判断肿瘤的存在，评价疗效，预估癌细胞生长状况；MUC1粘蛋白是一种大分子量的糖蛋白，它在癌变上皮细胞表面高度异常表达，是一种常见肿瘤标志物，MUC1的血清水平还与肿瘤的恶性程度相关。因此对这两种肿瘤标志物的检测对癌细胞的侦探和检测有十分重要的作用。但是在已有的检测方法中，检测的灵敏度检和浓度范围还有待提高，并且分布检测效率低，为了更好的评估疾病的发展情况，对这两种标志物的检测显得尤为重要，特别是如果能同时检测两种肿瘤标志物，将大大提高检测效率和准确性。

中国专利(申请号为201410181470.2)公开了一种同时检测两种急性白血病标志物的电化学传感器的制备方法，具体公开了将溶菌酶报告探针和γ-干扰素报告探针分别在含有TCEP的溶液中静置，以打开二硫键并分别与溶菌酶适体和γ-干扰素适体形成双链结构；对金电极进行预处理，将处理好的金电极浸在预处理后的溶菌酶报告探针-适体双链和γ-干扰素报告探针-适体双链的混合液中，室温静置过夜，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗；然后将电极浸在含有MCH的溶液中，以封闭电极，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗；将上述步骤处理后的电极作为工作电极，和参比电极、对电极连接在化学工作站上，以得到可用于两种急性白血病标志物溶菌酶和γ-干扰素的同时检测电化学传感器。但是其构建的传感器和方法还存在以下明显的缺点：1、两种探针分别和对应的适体形成双链时存在竞争反应；形成的两种发夹结构连接到电极上又存在竞争反应，步骤繁琐，传感 器性质不稳定；2、接到电极上的分子存在四种形式：两种探针分子及两种发夹结构分子，每次接上去的有效的发夹结构的数量和比例不确定，其重复性差，并且两种探针分子在电极上对检测形成干扰；3、用到四种核酸分子链，造成传感器的成本高。

发明内容

针对现有的检测肿瘤标志物的方法存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种操作简单、重复性好、成本低的构建发夹DNA支撑双信号分子传感界面的方法，构建的传感界面稳定性好、信号强、特异性高、灵敏度高，且可以用于检测一种或同时检测两种肿瘤标记物。

本发明的第二个目的是在于提供一种发夹DNA支撑双信号分子传感界面的应用，该生物传感器可以分别用于检测两种肿瘤标志物，也可以在同一界面上同时检测两种肿瘤标志物，且具有检测更简单、检出限低、灵敏度高、特异性强的特点。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种发夹DNA支撑双信号分子传感界面的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)在电极表面通过沉积法修饰纳米金；

(2)含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体I和含二茂铁探针的肿瘤标志物适体II在25～40℃温度下，于避光环境中，在溶液中混合孵育2～4h，得到孵育混合溶液；

所述的孵育混合溶液中含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体I和含二茂铁探针的肿瘤标志物适体II浓度分别为1～10μM和1～10μM；

(3)在避光环境中，将表面修饰纳米金的电极置于所述孵育混合溶液中，孵育14～16h后，用水冲洗；

(4)再将(3)处理后的表面修饰纳米金的电极置于MCH溶液中封闭，即得发夹DNA支撑双信号分子传感界面。

优选的方案，(1)中所述电极置于浓度为2～5mM的氯金酸溶液中，进行恒电位沉积，电位为-0.4V到-0.1V，沉积时间为150～200s，得到表面修饰纳米金电极。在电极上沉积一层纳米金颗粒后，电极比表面增大，一方面有利于结合适体， 另一方面可以大大增强信号强度，具备更高的检测量。

优选的方案，发夹DNA支撑双信号分子传感界面包括含亚甲基蓝(MB)探针的肿瘤标志物适体I和含二茂铁(Fc)探针的肿瘤标志物适体II。

较优选的方案，含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体I和含二茂铁探针的肿瘤标志物适体II经过孵育后共同修饰在表面修饰纳米金的电极表面。

进一步优选的方案，肿瘤标志物适体I为CEA适体。

进一步优选的方案，肿瘤标志物适体II为MUC1适体。

本发明的方法构建的发夹DNA支撑双信号分子传感界面采用适体来作用于相应的蛋白，具有更高的特异性和识别力，检测的灵敏度更高；同时引入了两种信号分子，分别检测两种不同肿瘤标记物，同时检测时互不干扰，检测限低，效率高。

本发明还提供了所述方法构建的发夹DNA支撑双信号分子传感界面的应用，将所述发夹DNA支撑双信号分子传感界面应用于检测肿瘤标志物适体I对应的肿瘤标志物I，或者检测肿瘤标志物适体II对应的肿瘤标志物II，或者同时检测肿瘤标志物适体I对应的肿瘤标志物I和肿瘤标志物适体II对应的肿瘤标志物II。本发明的传感器可以分别检测CEA和MUC1，而且也可以同时检测CEA和MUC1，并且两种肿瘤标记物的检测分别对应两种不同信号分子的变化量，特异性、独立性和稳定性更高。

优选的方案将发夹DNA支撑双信号分子传感界面用于检测肿瘤标志物I，根据肿瘤标志物I加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物I的含量；

或者，将发夹DNA支撑双信号分子传感界面用于检测肿瘤标志物II，根据肿瘤标志物II加入前后二茂铁电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物II的含量；

或者，将发夹DNA支撑双信号分子传感界面用于同时检测肿瘤标志物I和肿瘤标志物II，肿瘤标志物I和肿瘤标志物II同时加入，根据肿瘤标志物I加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物I的含量，根据肿瘤标志物II加入前后二茂铁电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物II的含量。

较优选的方案，肿瘤标志物I为CEA。

较优选的方案，肿瘤标志物II为MUC1。

本发明的含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体I和含二茂铁探针的肿瘤标志物适体II可以通过现有的常规方法筛选方法获得。或者直接通过购买得到，如生工生物工程上海(股份)有限公司。本发明采用的含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体I和含二茂铁探针的肿瘤标志物适体II一端修饰有巯基，主要通过巯基与电极表面的纳米金键合，将相应的适体固定在电极表面。

本发明采用的分子探针，Fc是还原性物质，于PBS中测量方波，在0.35V左右会有明显的Fc的峰；根据方波电流的变化量，可以定量检测MUC1的量。MB也是还原性物质，于PBS中测量方波，在-0.27V左右会有明显的亚甲基蓝的峰；根据方波电流的变化量，可以定量检测CEA的量。

相对现有技术，本发明技术方案带来的有益技术效果：

1)本发明的发夹DNA支撑双信号分子传感界面的构建方法关键在于将两种含不同分子探针的肿瘤标志物适体孵育杂交后，再修饰至表面修饰纳米金的电极表面。该方法可以通过简单调节孵育杂交过程中两种肿瘤标志物适体浓度来实现两种肿瘤标志物适体在电极表面的修饰比例，两种适体进行杂交，不存在竞争关系，两种分子杂交后形成一个整体，连接到电极上也不存在竞争，其可控性强，且构建的传感界面修饰物成分稳定。完全克服了现有技术中的同时检测两种肿瘤标志物电化学传感器存在稳定性差、重复性差的缺陷。

2)通过本发明的方法构建的发夹DNA支撑双信号分子传感界面，两种含不同分子探针的肿瘤标志物适体通过共同孵育杂交，再修饰在表面修饰金的电极表面，接到电极上的分子存在两种形式：单独检测一种物质的适体及支撑双信号的适体，两种适体的数量比例是一定的，接在电极上的分子都可以对标志物进行检测，没有干扰物质，检测限低，灵敏度更高。

3)本发明的发夹DNA支撑双信号分子传感界面构建方法简单、重复性好，且仅采用两种核酸分子链，成本相对更低。

4)本发明的发夹DNA支撑双信号分子传感界面修饰的探针分子即适体，可直接用来检测标志物。

5)本发明的发夹DNA支撑双信号分子传感界面通过修饰肿瘤标志物适体(aptamer)来作用于肿瘤标志物，同时根据分子探针的电化学信号的大小来检 测肿瘤标志物的含量，具有灵敏度高、检出限低、特异性强的特点。

6)本发明的发夹DNA支撑双信号分子传感界面同时修饰了两种不同肿瘤标志物适体以及引入了两种信号分子，可以用于检测一种肿瘤标志物也可以同时检测两种肿瘤标志物，实现了基于同一界面两种肿瘤标志物的同时检测，具有检测更简单、检出限更低、灵敏度高、特异性强的特点，且同时检测两种肿瘤标志物时，互不干扰，检测限低，效率高。

7)本发明的发夹DNA支撑双信号分子传感界面引入适体，稳定性好，且适体与相应的肿瘤标志物能形成稳定的聚合体，灵敏度高、检出限低。且适体相比较于抗体，其处理过程更为简单，且易合成，易修饰信号分子，能够更容易检测其出所需的电化学信号。

8)本发明发夹DNA支撑双信号分子传感界面引入的两种适体序列可变，适体更换序列后可以推广到检测相对应的其他标志物，如多肽，DNA，RNA，使得传感器能得到更广泛的应用，具有一定的普遍性。

附图说明

【图1】为构建传感界面的过程示意图；

【图2】为电沉积前后电极的cv表征

【图3】为传感界面构建过程的EIS表征；

【图4】为在构建的传感界面表面加入一系列不同浓度的MUC1后的SWV图；【图5】为在一定的浓度范围内MUC1的线性关系图。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

(1)在电极上构建的生物传感器的方法，步骤如下：

将两条可以部分互补的10μM DNA1-MB和10μM DNA2-Fc在25-40℃到下黑暗中混合孵育3h，得到DNA混合液。

电极在0.5mM的氯金酸溶液中进行恒电位沉积，电位为-0.25V，沉积时间为180s，表面得到一层纳米金颗粒，这层纳米金可以在随后的步骤中固定适配 体，同时起到信号放大的作用。在室温下，电极上修饰10μM的DNA混合物黑暗中孵育15h，然后用二次水冲洗，去除没有修饰上的残留的DNA，然后在将电极放在MCH中，加入MCH的目的是为了封闭电极上未反应的位点以及使得修饰的DNA呈直立结构。由于亚甲基蓝见光容易分解，所以所有的操作过程都是在黑暗条件下进行的。

对CEA的定量分析步骤如下：

(2)分别配制不同浓度的CEA，分别依次加入到以上构建的生物传感器上，由于DNA1-MB部分片段是CEA的aptamer，它能够和CEA形成稳定的聚合结构。从而使得DNA1-MB的发夹结构打开，使得MB距离电极更远，根据DNA-MB上亚甲基蓝信号的变化量来定量分析CEA。

对MUC1的定量分析步骤如下：

(3)分别配置不同浓度的MUC1，分别依次加入到以上构建的生物传感器上，由于DNA2-Fc是MUC1的aptamer，它能够和MUC1形成稳定的聚合结构从而脱落至溶液中，使得电极上Fc信号降低。根据二茂铁信号的变化量来定量分析MUC1。

(4)对CEA和MUC1的同步检测的步骤如下：

检测制备好的传感器的亚甲基蓝和二茂铁信号为初始信号，同时加入不同浓度的CEA和MUC1，通过亚甲基蓝信号的变化量来定量检测CEA，通过二茂铁信号的变化量来定量检测MUC1。

从图2可以看出电沉积纳米金后0.8-1V的金的还原峰出现，且比裸金电极的大，表明纳米金成功沉积到了电极上。

从图3可以看出随着电极表面构建的越多，其阻抗增大，表面生物传感器的成功构建。

从图4随着加入的肿瘤标志物MUC1的量逐渐增多，其响应信号逐渐增大。

从图5可以看出在一定的浓度范围内MUC1浓度越大，其电流的变化量越大，达到某一浓度后会趋于平衡，在低浓度范围内有很好的其线性关系。

对比实施例1

对照组的具体实验如下：按照已公开专利(申请号为201410181470.2)的方法，将两种探针分别在含有TCEP的溶液中静置，以打开二硫键并分别与各自相 应的适体形成双链结构；对金电极进行预处理，将处理好的金电极浸在预处理后的两种探针-适体双链的混合液中，室温静置过夜，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗；然后将电极浸在含有MCH的溶液中，以封闭电极，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗；将上述步骤处理后的电极作为工作电极，和参比电极、对电极连接在化学工作站上，以得到可用于两种标志物同时检测的电化学传感器。不加入任何检测物，用方波伏安法检测制备好的传感器的亚甲基蓝和二茂铁初始信号，并计算得到两种信号大小的比值，分别进行5次平行实验，得到5次实验的相对标准偏差。

实验组组的具体实验如下：按照本文所述方法，将含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体I和含二茂铁探针的肿瘤标志物适体II在25～40℃温度下，于避光环境中，在溶液中混合孵育2～4h，得到含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体I和含二茂铁探针的肿瘤标志物适体II的混合溶液；对金电极进行预处理，并电沉积一层纳米金，在室温下，电极上修饰DNA混合物黑暗中孵育15h，用二次水冲洗；然后将电极浸在含有MCH的溶液中，以封闭电极，之后用二次蒸馏水清洗；将上述步骤处理后的电极作为工作电极，和参比电极、对电极连接在化学工作站上，以得到可用于两种标志物同时检测的电化学传感器。不加入任何检测物，用方波伏安法检测制备好的传感器的亚甲基蓝和二茂铁初始信号，并计算得到两种信号大小的比值，分别进行5次平行实验，得到5次实验的相对标准偏差。

实验次数12345RSD(％)(对照组)I_MB/I_Fc1.180.911.131.080.9910.25(实验组)I_MB/I_Fc1.641.61.621.591.631.28

由实验结果可得可知，对照组和实验组的RSD分别为10.25％，1.28％，由此可知，本方法构建的传感界面修饰物成分更稳定，重复性更高。