一种基于双模式竞争激发的超分辨显微方法和装置

摘要

本发明公开了一种基于双模式竞争激发超分辨显微方法及装置，用同一光源发出的被调制为两种光束同时照射到荧光样品表面，其中一束光通过空间光调制器后在样品上聚焦形成高能量的空心光斑，用于产生饱和效应；另一束光被声光调制器调制为脉冲光，在样品上聚焦形成低能量的实心光斑，收集样品各扫描点发出的信号光，提取出与脉冲光频率相同的信号光作为的有效信号光以用于获取超分辨图像。本发明装置简单，操作方便；利用实心斑和空心斑在激发样品荧光时的竞争机制，仅使用一个激光光源实现了饱和荧光激发超衍射极限的分辨率。

说明书

技术领域

本发明属于超分辨领域，尤其涉及一种利用荧光饱和原理在远场实现超衍射极限的分辨率的超分辨显微方法和装置。

背景技术

由于光学系统衍射的影响，常规远场光学显微方法可实现的分辨率存在限制。根据阿贝衍射极限理论，光束经显微物镜聚焦后所成光斑的尺寸用半高全宽表示为其中λ为显微镜的工作波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。因此，常规远场光学显微镜的极限分辨率一般被限制在了半波长左右。

为了突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，科研工作者们提出了多种超分辨光学显微方法，其中荧光激发受到了很大的关注。一些比较常用的方法有：受激发射损耗显微术(STED：Stimulated Emission Depletion Microscopy)、结构光照明荧光显微术(SIM：Structured Illumination Microscopy)、随机光场重建显微术(STORM:Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)等。

这几种方法均可以在远场实现荧光超分辨显微，在实际测试中也得到了相应的应用，但是都还仍然存在着不足。其中，STED显微术的分辨率由所加损耗光的光功率决定，因此当实现高分辨率时，其所要求的光功率很强，容易导致荧光分子的漂白。SIM显微术对光功率的要求虽然不高，但是由于其需要光栅扫描，成像速度较慢，成像系统也较为复杂。STORM显微术的成像速度也很慢，目前还很难运用于活体细胞的实时检测当中。

常规荧光显微中，样品发射的荧光强度是与激发光强度成正比的；当激发光强不断增加，激发态的荧光分子数目就会达到饱和，正比关系就不再成立并且荧光的点扩散函数也会改变，可以用于得到更精细的结构信息。

发明内容

本发明提供了一种超分辨显微方法和装置，可以利用荧光饱和原理在远场实现超衍射极限的分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、分辨率高等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。

一种基于双模式竞争激发的超分辨显微方法，包括以下步骤：

1)调节经准直后的激光光束的偏振情况，使P偏振分量光强远大于S偏振分量光强(至少相差两个数量级)；

2)将经步骤1)处理的激光光束分成两束线偏振光，分别为P光和S光；

3)对所述的P光进行相位调制，并将S光调制为预设频率的脉冲光；

4)将经过相位调制的P光和所述的脉冲光合为一束光，再根据偏振特性转化为左旋圆偏振光和右旋圆偏振光；

5)将转化为左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的光束投射到样品以对样品进行扫描，扫描时使经过相位调制的P光在样品上汇聚成空心光斑，使所述的脉冲光在样品上汇聚成实心光斑；

6)接收样品在扫描时发出的信号光，并对接收到的信号光进行解调得到与所述脉冲光对应的光信号以用于获取相应扫描位置处的图像。

当待测样品(即样品)为荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后经样品表面的反射光束。

待测样品上的x，y轴方向由二维扫描方向决定。

作为优选，本发明的超分辨显微方法中利用0～2π涡旋位相板对P光进行相位调制。

本发明还提供了一种基于双模式竞争激发的超分辨显微装置，包括光源、承载待测样品的样品台，所述光源与样品台之间依次设有：

用于改变所述光源发出光束的偏振特性的1/2波片，

用于将偏振特性改变后的光束分成两束线偏振光的偏振分束器，所述的两束线偏振光分别为P光和S光，

用于对所述P光进行相位调制的空间光调制器，用于对所述S光进行强度调制得到预设频率的脉冲光的声光调制器，

用于将所述偏振光偏振特性改变的两块1/4波片，

用于将经过空间光调制器的P光和经过声光调制器的S光合并为一束的偏振合束器，

用于改变偏振合束器出射的光束中振光偏振特性、且依次设置的两块1/4波片，

用于对依次经过两块1/4波片转化为左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的光束进行光路偏转使其投射到样品，并使经过相位调制的P光在样品上汇聚成空心光斑，使所述的脉冲光在样品上汇聚成实心光斑以对样品进行扫描、且依次设置的扫描振镜系统、扫描透镜、场镜和显微物镜，

用于采集样品发出的信号光的探测系统，

用于对接收到的信号光进行解调得到与所述脉冲光对应的光信号以用于获取相应扫描位置处的图像的锁相放大器，

以及用于控制所述空间光调制器和扫描振镜系统的控制器和用于控制声光调制器频率和锁相放大器频率的信号发生器。

本发明中圆偏振光通过显微物镜投射到所述待测样品上，具体如下：

扫描振镜系统对经过两个1/4波片的光束进行光路偏转；

扫描透镜和场镜分别用于对扫描振镜系统出射的光束进行聚焦和准直。

本大明中通过探测系统接收样品发出的信号光，该探测系统包括：

布置在空间光调制器和扫描振镜系统之间的分束器，所述分束器在待测样品为荧光样品时应选用二色镜，当待测样品为非荧光样品时应选用偏振分光棱镜；

用于滤去分束器出射的信号光中的杂散光的带通滤波片，所述带通滤波片在待测样品为非荧光样品时可以省略；

用于探测信号光束的光强信号的探测器，所述探测器选用光电倍增管(PMT)；

用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；

用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径。

作为优选，所述光源与1/2波片之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波的单模光纤和准直的准直透镜。

本发明中所述空间光调制器具有可变的调制函数其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

进一步优选，所述空间光调制器为涡旋位相板。

所述的锁相放大器和声光调制器共用同一信号发生器。

该信号发生器用于确定锁相放大器和声光调制器所调控的光束频率相同。预设频率根据实际测试样品设定，在实际应用时，调节该信号发生器即可以使锁相放大器和声光调制器的工作于该预设频率处。

所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

所述信号发生器加载在声光调制器和锁相放大器上的频率相等。

本发明原理如下：

由于光学系统衍射的影响，平行入射的照明光束经显微物镜聚焦之后，在待测样品上所成的光斑并非一个理想的点，而是一个具有一定尺寸的衍射斑。在衍射斑照射范围内的样品均会发出相应的信号光，从而使得这一范围内样品的细节无法被分辨，由此限制了显微系统的分辨率。因此，要突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，如何减小在扫描点处有效信号光的发光面积便成为了关键。

在本发明方法中，当信号发生器的输出频率为f时，经过调制后的光束经显微镜聚焦在样品上形成一个脉冲频率为f的实心光斑(即脉冲光的频率为f)。该实心光斑的尺寸与常规光学显微术中所用照明光束聚焦所成衍射斑的尺寸相同。当空间光调制器的调制函数为时，由德拜积分计算可得，调制后光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个面包圈型的空心光斑。

实心光斑和空心光斑来自于同一光源，经过不同的调制后到达成像面，其中未引入任何其他专门改变光斑大小的器件。经过涡旋位相图调制后，空心光斑的大小比实心光斑大，但是其中心暗斑区域比实心斑小。

空心光斑的光强远大于实心光斑的光强，在其照射范围内竞争该处实心光斑照射样品发出的信号光，使探测器收集到的信号为实心斑中心部分以及空心斑照射样品发出的光。将f作为锁相放大器的参考信号频率，接收到的信号光经过锁相放大器，只有脉冲频率为f的信号能够得到输出，即只有实心斑中心部分照射样品发出的信号光得到输出。显然该信号对应的各扫描点处的有效发光面积将小于完整实心斑对应的各扫描点处的有效信号光发光面积。

因此，与常规光学显微方法相比，本发明减小了有效信号光的发光面积，从而可以实现超衍射极限的分辨率，而且不用通过数据的处理和计算，可以直接得到高分辨率的图像。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)首次提出了通过同色光饱和空心斑竞争受激辐射的显微方法；

(2)比起原有的荧光辐射差分显微，分辨率有提高；

(3)装置简单，操作方便。

附图说明

图1为本实施例的超分辨显微装置的结构示意图；

图2为本实施例脉冲光所成实心光斑的归一化光强分布曲线；

图3为本实施例中所成面包圈型空心光斑的归一化光强分布曲线；

图4为本实施例中有效信号光的光斑与常规光学显微术中信号光光斑的归一化光强分布比较曲线；

图5为本实施例与常规光学显微方法对同一样品扫描所得图像中的光强分布比较曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，本实施例的超分辨显微装置，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，1/2波片4，偏振分束器5，空间光调制器6，声光调制器7，偏振合束器8，1/4波片9，1/4波片10，二色镜11，扫描振镜12，扫描透镜13，场镜14，显微物镜15，样品台16，带通滤波片17，聚焦透镜18，针孔19，探测器20。

其中，单模光纤2、准直透镜3、1/2波片4、偏振分束器5、空间光调制器6依次位于激光器1出射光束的光轴之上；所述1/2波片4的透光轴方向经过调整使得光束通过后P偏振分量强度远大于S偏振分量强度，相差两个数量级。

其中，声光调制器7位于经偏振分束器5调制后光束的光轴之上。

其中，偏振合束镜8位于经空间光调制器6调制后光束的光轴之上。

其中，1/4波片9、1/4波片10、二色镜11依次位于偏振合束器8的出射光经反射镜偏折之后的光轴之上；扫描振镜12位于经二色镜11反射后光束的光轴之上。

其中，扫描透镜13，场镜14，显微物镜15，样品台16依次位于扫描振镜12出射光束的光轴之上。

其中，带通滤波片17、聚焦透镜18、针孔19、探测器20依次位于经二色镜11后反射镜反射光束的光轴之上；所述针孔19位于聚焦透镜18的焦平面处。

其中，控制器分别与空间光调制器6以及扫描振镜系统7相连，用于加载空间光调制器6的调制相位以及扫描振镜系统7的扫描。

上述装置中，显微物镜15的数值孔径NA＝1.4；所用针孔19的直径为0.73个艾里斑直径，探测器20为光电倍增管(PMT)。

采用图1所示的装置进行超分辨显微的方法如下：

从激光器1发出的激光光束，首先被导入单模光纤2，从单模光纤2出射的激光光束，经过准直透镜3完成准直。经过准直后的光束入射到1/2波片4改变偏振情况，使P偏振分量光强远大于S偏振分量光强，之后被偏振分束器5分为两束线偏振光。P光照射到空间光调制器6上受到调制，S光偏转后受到声光调制器7调制。

利用控制器对空间光调制器6进行控制，使空间光调制器6的相位调制函数切换为：

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

因此，经空间光调制器6进行相位调制之后，出射光束的电矢量强度可由下式表示：

其中，为入射到空间光调制器6上的光束在处的电矢量强度，为经过空间光调制器6相位调制后的出射光束在处的电矢量强度，i为虚数单位。

而经过声光调制器7之后的光变成具有一定频率的脉冲光，具体频率可根据测试样品调节。

分别由空间光调制器6和声光调制器7出射的两束线偏振光通过偏振合束器8重新合为一束光，经过1/4波片9和1/4波片10，使P光输出为左旋圆偏振光。

调制后的光入射到扫描振镜12上，经扫描振镜12出射的光束依次被扫描透镜13聚焦、场镜14准直，之后经显微物镜15投射到位于样品台16上的待测样品之上。

入射光在显微物镜15的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

$>\overrightarrow{E}(r_2,{\phi }_2,z_2)=iC\int {\int }_{\Omega }sin\left(\theta \right)·A_1(\theta ,\phi )·A_2(\theta ,\phi )·\left(\begin{array}{c}\begin{array}{c}{p}_x\end{array}\\ \begin{array}{c}{p}_y\end{array}\\ \begin{array}{c}{p}_z\end{array}\end{array}\right)·e^{ikn(z_2\cos \theta +r_2\sin \theta \cos (\phi -{\phi }_2))}d\theta d\phi$>

式中，是以显微物镜15的焦点位置为原点的柱坐标系下的坐标，代表了处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，φ为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，A₁(θ,φ)是入射光的振幅分布，A₂(θ,φ)表征了显微物镜15的结构，则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。

由上式计算可以发现，此时入射的P光经显微物镜15聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个面包圈型空心光斑，其具体光场分布归一化曲线如图2所示。而入射的S光经显微物镜15聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个实心光斑，其具体光场分布归一化曲线如图3所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜15收集，之后依次通过场镜14、扫描透镜13、扫描振镜12，通过二色镜11，最后被反射。信号光束通过带通滤波片17滤去杂散光，之后经聚焦透镜18聚焦并通过针孔19进行空间滤波，最终被探测器20接收。

通过控制器调节扫描振镜12，实现对于待测样品的二维扫描。

当信号发生器的输出频率为f时，经过调制后的光束经显微镜聚焦在样品上形成一个脉冲频率为f的实心光斑。该实心光斑的尺寸与常规光学显微术中所用照明光束聚焦所成衍射斑的尺寸相同。当空间光调制器的调制函数为时，由德拜积分计算可得，调制后光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个面包圈型的空心光斑。

空心光斑的光强远大于实心光斑的光强，其具体光场分布对比归一化曲线如图4所示。空心斑在照射的范围内竞争该处实心光斑照射样品发出的信号光，使探测器收集到的信号光为实心斑中心部分以及边缘大多数空心斑照射样品发出的光。将f作为锁相放大器的参考信号频率，接收到的信号光经过锁相放大器，只有脉冲频率为f的信号能够得到输出，即只有实心斑中心部分照射样品发出的信号光得到输出。显然该信号对应的各扫描点处的有效发光面积将小于完整实心斑对应的各扫描点处的有效信号光发光面积，由此可以得到超分辨显微图像。

本实施例中有效信号光光斑与常规共聚焦显微方法中信号光光斑的归一化光强分布曲线比较如图5所示。由图5可以看出，本发明中有效信号光的光斑尺寸较常规共聚焦显微方法中信号光光斑尺寸有所减小，因此本发明方法可以实现超衍射极限的分辨率。