矮牵牛叶肉原生质体分离及培养方法

摘要

本发明公开了一种矮牵牛叶肉原生质体分离及培养方法，所述原生质体分离方法包括以下步骤：称量矮牵牛幼嫩叶片进行处理后用酶解液酶解；向酶解后的溶液中加入CPW洗液，经过滤、离心，吸去上清液；再次加入CPW洗液洗涤，离心，收集沉淀，即得纯化后的原生质体。所述原生质体培养方法包括：将制备的原生质体加入原生质体培养液中，24℃黑暗环境固液培养法培养30d后，将培养形成的微型愈伤组织转移至增殖培养基；培养21d后，转移至分化培养基；培养即可。用本发明的分离及培养方法可获得高活性、高产量的原生质体，对其培养可诱导出愈伤组织，最终分化出芽，为矮牵牛进一步体细胞融合等研究提供实验材料，可为矮牵牛种质资源创新奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种矮牵牛叶肉原生质体分离及培养方法。

背景技术

矮牵牛(Petunia hybrida)为茄科矮牵牛属草本花卉，因其具有花色丰富、花期长等优点，在世界各国广泛应用，素有“花坛植物之王”的美誉。但黄色花及橙色花品种极为少见，尤其缺乏颜色鲜亮、稳定的黄色花品种。目前矮牵牛育种技术多采用杂交育种，由于基因资源限制和有性杂交亲和性差等原因，通过传统杂交育种技术培育黄色花品种存在一定难度。植物体细胞融合技术可克服远缘杂交亲和性差的困难，可为矮牵牛新品种的培育开辟新途径。

原生质体的成功分离及培养是体细胞融合的前提，在矮牵牛原生质体分离研究中，迄今没有查阅到关于酶种类及浓度、酶解时间、渗透压等因素影响矮牵牛原生质体分离的报道；在原生质体培养研究中，尚缺乏培养基种类、培养密度、培养方法等因素影响原生质体培养的报道。

专利文献CN201510363007.4，专利名称为“小花矮牵牛原生质体的制备方法”中，公开了一种小花矮牵牛原生质体的制备方法，发明人曾尝试采用该方法制备本发明矮牵牛的原生质体，未能获得较好的结果。原因是由于所用材料是同科不同属植物，品种有区别，基因型不同，导致矮牵牛原生质体分离及培养结果存在差异。本发明以矮牵牛锦浪系列白色花品种的叶片为材料，通过对影响矮牵牛叶肉原生质体分离及培养的诸多因素探讨分析，建立了一套完整的分离及培养体系，原生质体产量提高，原生质体纯化方式简化，可重复性好，成功培养原生质体并诱导出芽，为矮牵牛通过体细胞融合培育新品种奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种矮牵牛叶肉原生质体分离及培养方法；该方法可高效分离原生质体，且可重复性好，成功培养原生质体并诱导出芽。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了一种矮牵牛叶肉原生质体分离方法，所述方法包括以下步骤：

A、称量矮牵牛幼嫩叶片，依次经肥皂水浸泡、流水冲洗、75wt％酒精浸泡、1wt％双氧水消毒、无菌水冲洗后，吸干水分，切成细丝；

B、用酶解液酶解步骤A处理后的叶片；所述酶解液的溶剂为水溶液，溶质为如下终浓度的物质：2wt％纤维素酶、0.4wt％离析酶、0.2wt％果胶酶、0.5M甘露醇、0.11wt％CaCl₂、0.10wt％牛血清白蛋白、20mM>

C、向步骤B酶解后的溶液中加入CPW洗液，经300目细胞筛过滤后1100r/min离心2min，吸去上清液；所述CPW洗液的溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.5M的甘露醇；

D、再次加入CPW洗液洗涤，1100r/min离心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得纯化后的原生质体。

优选地，步骤A中，所述幼嫩叶片为顶芽下端第3～5片幼嫩叶片。

优选地，所述步骤C和D中，所述离心采用的离心机型号为Centrifuge 5810R离心机(Eppendorf)。

优选地，所述步骤C和D中离心的试管均为50ml的大试管；所述步骤C和D中离心机的加速度为0(离心机加速度一般是指从0转到10000转能力，共分0～9个等级。如加速度为0时表示从0转到10000转所用时间较长，加速度为9表示从0转到10000转所用时间较短)。

优选地，步骤B中，所述纤维素酶为纤维素酶R-10(5-10U/mg,Yakult)，离心酶为离析酶R-10(5-10U/mg,Yakult)，果胶酶为果胶酶Y-23(1U/mg,Yakult)。

优选地，步骤B中，所述酶解温度为25～27℃，酶解时间为5h。

优选地，步骤C中，所述CPW盐溶液是由每升水中加入27.2mg KH₂CO₃、101.0mg>3、1480mg>3·2H₂O、246.0mg>4·7H₂O、0.16mg>4·5H₂O制备而得；所述CPW盐溶液的pH为5.6～5.7。在调配CPW洗液时，需要用微量氢氧化钠调到5.6～5.7；从而不仅保证最初CPW盐溶液是5.6～5.7,还保证最后含有甘露醇和其它物质最终的CPW洗液的PH值为5.6～5.7。

优选地，所述矮牵牛为矮牵牛锦浪系列Petunia hybrida‘Shock Wave’白色花品种，种子来源于泛美种子公司。

更优选地，所述矮牵牛的培养方法为：植株置于HP1500GS-B型全智能人工培养箱， 生长条件为：温度26℃，光照时间14h·d^-1，光照强度为3000lux。

本发明还提供了一种矮牵牛叶肉原生质体培养方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一、将前述方法制备的原生质体加入原生质体培养液中，24℃黑暗环境中固液培养法培养，分别在培养15d、22d、29d时添加一次新鲜原生质体培养基；所述原生质体在原生质体培养液中的密度为0.5～1.0×10⁵个/ml；所述原生质体培养液的溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.375wt％KM₈P、20mM>

步骤二、培养30d后，将经步骤一中培养形成的微型愈伤组织转移至增殖培养基；培养21d后，转移至分化培养基；培养即可；所述增殖培养基的溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.44wt％MS培养基、2wt％蔗糖、0.7wt％琼脂、0.5mg/l 6-BA、0.5mg/l NAA；所述分化培养基的溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.44wt％MS培养基、2wt％蔗糖、0.7wt％琼脂、1.0mg/l ZT、0.1mg/l NAA。

优选地，步骤一中，所述固液培养法为先将含0.8％琼脂糖的固体培养基平铺在培养皿底部，待其凝固后，再加入原生质体培养液和原生质体进行培养。

优选地，步骤一中，所述分别在培养15d、22d、29d时添加的新鲜原生质体培养基的渗透压依次递减，即培养15d时添加的新鲜原生质体培养基的葡萄糖浓度为9wt％，培养22d时添加的新鲜原生质体培养基的葡萄糖浓度为6wt％，培养22d时添加的新鲜原生质体培养基的葡萄糖浓度为3wt％。

优选地，步骤一中，所述原生质体培养过程中，待形成肉眼可见的乳黄色微型愈伤组织后，置于散射光下培养。

优选地，步骤二中，将微型愈伤组织转移至增殖培养基后，培养条件为：温度(24±1)℃，光照14h·d^-1，光照强度3>

本发明以甘露醇作渗透压稳定剂，酶解液中不同甘露醇浓度对分离原生质体产量和活性的影响较大。当浓度为0.2M时，原生质体产量和活性分别为1.05×10⁶个·g^-1和41.6％，原生质体破裂情况严重，细胞碎片较多；甘露醇浓度0.3M时，原生质体产量达到最高值，而后随渗透压升高而小幅度下降；原生质体活性先升高后降低，在0.5M时活性达到最高值82.4％，且获得的原生质体形状、大小基本相同，边缘清晰，内含物较多，碎片和杂质少。综合考虑原生质体产量和活性，矮牵牛叶肉原生质体分离较适宜的甘露醇浓度为0.5M。

本发明所用的纤维素酶R-10与离析酶R-10和果胶酶Y-23的配合使用效果显著。 果胶酶对原生质体游离效果有较大影响，在同一纤维素酶和离析酶浓度下，随果胶酶浓度提高，原生质体产量先增加后降低，而活性逐渐降低；离析酶对原生质体产量有较大影响，对活性没有显著影响；纤维素酶显著影响原生质体的游离效果。在一定浓度范围内，随着纤维素浓度的升高，原生质体产量和活性均同步增加，在所有的酶液组合中，以2.0wt％纤维素酶+0.2wt％果胶酶+0.4wt％离析酶的组合，原生质体分离效果最好，原生质体产量和活性分别达到2.90×10⁶个·g^-1和88.1％。

本发明在纯化原生质体过程中，离心时将升降加速度均设为0。当升降加速度处于0时，离心机转速自0rpm上升到1100rpm需要时间较长，原生质体在离心力的作用下沉降速度会减慢，彼此之间受挤压程度较轻，完整性良好；当升降加速度处于最大值9时，原生质体沉淀在一起，相互挤压程度严重，在显微镜下可观察到较多破碎的原生质体。综合考虑原生质体产量和活性，矮牵牛叶肉原生质体离心纯化时较适宜的升降加速度为0。

本发明中培养原生质体时激素组合为0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA。刚分离出的叶肉原生质体呈球形，边缘清晰，细胞质较浓，并含有较大的颗粒内含物。培养1-2d，多数原生质体体积增大，其中的一些再生细胞变为卵圆形，这标志原生质体新的细胞壁形成。与此同时，原生质体再生细胞中含有的颗粒内含物渐渐消失。培养3d后，再生细胞开始第一次细胞分裂，细胞分裂有均等分裂和不均等分裂，并伴有原生质体之间轻度粘连现象的发生。再生细胞一旦分裂便能持续分裂。14d后在显微镜下可观察到小细胞团的形成，培养17d左右，会形成肉眼可见的微愈伤组织，颜色为乳黄色。

本发明中培养密度为0.5～1.0×10⁵个/ml，原生质体均可维持较高的分裂频率(20％)。当培养密度为0.1×10⁵个/ml时，再生细胞分裂频率只有8.33％，出现第一次分裂时间为4-5d。当密度为5×10⁵个/ml时，原生质体聚集情况较为严重，培养4d后只有外围聚集的细胞出现细胞分裂，但分裂频率大幅下降，10d后聚集在一起的大多数细胞出现褐化。

本发明以固液培养法培养原生质体。与固体培养法相比，固液培养法培养原生质体初次分裂频率无显著差别，操作相对简便，对原生质体损害较小。

本发明中培养愈伤组织时激素组合为1.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA，可诱导出芽。在转移第16d分化出绿色芽点，生芽率为20％。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明利用含2wt％纤维素+0.2wt％果胶酶+0.4wt％离析酶+0.5M甘露醇 的酶液酶解叶片5h，离心法纯化原生质体；利用固液培养法培养原生质体，培养密度为0.5～1.0×10⁵个/ml，激素组合为0.5mg/l>

2)利用激素组合为0.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA的增殖培养基培养微型愈伤组织，21d后愈伤组织长至5mm；利用激素组合为1.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA的分化培养基诱导愈伤组织，16d后诱导出芽，出芽率为20％。

3)本发明中添加0.2wt％的果胶酶可明显提高原生质体的产量，原生质体产量可高达2.90×10⁶个·g^-1；离心法纯化原生质体时，将升降加速度都设为0，可显著提高原生质体活性，活性可达到88.1％，原生质体大小一致，边缘清晰，细胞质较浓；0.1％的生长素有利于愈伤组织的分化，以1.0mg/l>

4)用本发明的方法可分离出高产量和高活性的原生质体，对其进行培养可获得愈伤组织，并诱导出芽，为矮牵牛进一步体细胞融合等研究提供实验材料，可为矮牵牛种质资源创新奠定基础。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为渗透压对分离原生质体效果的影响结果；

图2为酶解时间对分离原生质体的影响结果；

图3为果胶酶浓度对分离原生质体的影响结果；

图4为离析酶浓度对分离原生质体的影响结果；

图5为纤维素酶浓度对分离原生质体的影响结果；

图6为离心的升降加速度对分离原生质体的影响结果；

图7为实施例分离的矮牵牛叶肉原生质体的图片；其中，图7-A为.酶解2-3h正在解离的组织，×800；图7-B为酶解3h正解离细胞壁的细胞，×800；图7-C为酶解5h具活性的原生质体，×400；图7-D为显微镜下的原生质体产量检测,×100；图7-E为FDA检测有活性的原生质体,×100。

图8为实施例培养的矮牵牛叶肉原生质体的图片；其中，图8-1为具活性原生质体，×400；图8-2为培养2d的原生质体，×400；图8-3为培养4d再生细胞第一次分裂，×400；图8-4为培养5-6d再生细胞第二次分裂，×400；图8-5为培养5-6d再生细胞第三次分 裂，×400；图8-6为培养12d形成的微细胞团，×200；图8-7为第17d固液培养法形成的微愈伤组织；图8-8为6-BA0.5mg/l+NAA0.5mg/微愈伤增殖情况；图8-9和8-10为第16d在ZT 1.0mg/l+NAA0.1mg/l的激素组合中愈伤组织分化出的芽。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明涉及一种矮牵牛叶肉原生质体分离及培养的方法，所述方法包括以下步骤：

A、称量0.5g矮牵牛幼嫩叶片，肥皂水浸泡20min，流水冲洗1.5h。于无菌操作台中，75％酒精浸泡20s，立即转入1％双氧水消毒2min，无菌水冲洗3遍，无菌滤纸吸干水分，切成0.5mm宽彼此相连的细丝；

B、用5ml酶液酶解步骤A处理后的叶片；所述酶解液的溶剂为水溶液，溶质为如下终浓度的物质：2wt％纤维素酶、0.4wt％离析酶、0.2wt％果胶酶、0.5M甘露醇、0.11wt％CaCl₂、0.10wt％牛血清白蛋白、20mM>

C、向步骤B酶解后的溶液中加入10ml CPW洗液，摇晃30s，经300目细胞筛过滤后1100r/min离心2min，升降加速度均设为0，吸去上清液；所述CPW洗液的溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.5M的甘露醇；

D、向步骤C中加入15ml CPW洗液洗涤，1100r/min离心2min，升降加速度均设为0，吸去上清液，收集沉淀，向沉淀中加入原生质体培养液，获得纯化后的原生质体；所述原生质体培养液的溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.375wt％KM₈P、20mM>

E、将步骤D中的原生质体密度调整为0.5～1.0×10⁵个/ml，24℃黑暗环境固液培养法培养，培养15d添加新鲜原生质体培养基，此后每隔7d添加一次；

F、培养30d后，将步骤E中形成的微愈伤组织转移至增殖培养基；21d微愈伤组织长至5mm，转移至分化培养基；所述增殖培养基的溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.44wt％MS、2wt％蔗糖、0.7wt％琼脂、0.5mg/l 6-BA、0.5mg/l NAA；所述分化培养基的溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.44wt％MS、2wt％蔗糖、0.7wt％琼脂、1.0mg/l ZT、0.1mg/l NAA。

(1)针对步骤B中的甘露醇浓度，本发明设置5个浓度梯度：0.2、0.3、0.4、0.5和0.6M。结果表明，综合原生质体产量和活性来看，0.5M为分离矮牵牛叶肉原生质体较适宜的甘露醇浓度。具体如下：

将供试材料分别放入甘露醇浓度为0.2、0.3、0.4、0.5和0.6M的酶液组合中进行酶解，测定各处理原生质体的产量和活性，确定最适的甘露醇浓度。

甘露醇浓度对原生质体产量和活性的影响：

从图1可以看出，甘露醇浓度对原生质体的产量和活性有明显影响。当浓度为0.2M时，原生质体产量和活性分别为1.05×10⁶个·g^-1和41.6％，原生质体破裂情况严重，细胞碎片较多，0.3M甘露醇条件下，原生质体产量达到最高值，之后随渗透压升高而小幅度下降；原生质体活性先升高后降低，在0.5M浓度时产量为2.45×10⁶个·g^-1，活性达到最高值82.4％，并且获得的原生质体形状、大小基本一致，边缘清晰，内含物多，碎片少。综合考虑原生质体产量和活性，矮牵牛叶肉原生质体分离较适宜的渗透压为0.5M。

(2)针对步骤B中的酶解时间，本发明设置3、4、5、6和7h共5个酶解时间。结果表明，综合原生质体产量和活性来看，5h为分离矮牵牛叶肉原生质体较适宜的时间。具体如下：

将供试材料分别酶解3、4、5、6和7h，测定各处理原生质体的产量和活性，确定最适的酶解时间。

酶解时间对原生质体产量和活性的影响：

结果如图2所示，酶解时间对原生质体的产量和活性都有明显的影响。不同酶解时间下，原生质体产量和活性存在差异，且二者达到峰值的时间同步。酶解一段时间后，组织被解离成单细胞(图7-A)，随后细胞壁被解离(图7-B)，形成单个原生质体(图7-C)；随着酶解时间的延长，原生质体产量和活性都增加，在酶解5h时，原生质体产量和活性分别为2.91×10⁶个·g^-1和86.9％，均达到最高值(图7-D和7-E)。超过5h后，活性随酶解时间的增加而大幅下降，而原生质体活性的降低与细胞碎片的增多对原生质体的纯化和培养均不利，因此最佳酶解时间为5h。

(3)针对步骤B中的果胶酶浓度，本发明设置0wt％、0.2wt％、0.4wt％、0.6wt％共4个浓度。结果表明，综合原生质体产量和活性来看，0.2wt％为分离矮牵牛叶肉原生质体较适宜的果胶酶浓度。具体如下：

在最适宜的甘露醇浓度和酶解时间下，酶混合液添加2％纤维素酶和0.6％离析酶外， 另分别添加0wt％、0.2wt％、0.4wt％、0.6wt％果胶酶共4个浓度梯度，分离原生质体。测定各处理原生质体的产量和活性，确定最适的果胶酶浓度。

果胶酶对原生质体产量和活性的影响：

从图3可看出，在原生质体分离过程中，果胶酶对原生质体产量和活性都有较大影响。在同一纤维素酶和离析酶浓度下，随果胶酶浓度提高，原生质体产量先增加后降低，而活性逐渐降低。综合考虑原生质体产量和活性，矮牵牛叶肉原生质体分离较适宜的果胶酶浓度为0.2wt％。

(4)针对步骤B中的离析酶浓度，本发明设置0.2wt％、0.4wt％、0.6wt％、0.8wt％共4个浓度梯度。结果表明，综合原生质体产量和活性来看，0.4wt％为分离矮牵牛叶肉原生质体较适宜的离析酶浓度。具体如下：

在最适宜的甘露醇浓度和酶解时间下，酶混合液成分为2wt％纤维素酶和适宜的果胶酶浓度，另分别添加0.2wt％、0.4wt％、0.6wt％、0.8wt％离析酶4个浓度梯度，分离原生质体。测定各处理原生质体的产量和活性，确定最适的离析酶浓度。

离析酶对原生质体产量和活性的影响：

试验结果如图4所示，离析酶对原生质体产量有较大影响，对原生质体的活性没有显著影响。当离析酶浓度为0.4wt％时，原生质体产量和活性都达到最高值，分别为2.90×10⁶个·g^-1和88.1％，当低于或高于这个浓度时，原生质体产量和活性都有不同程度下降，当离析酶浓度为0.8wt％，原生质体产量大大降低，仅1.90×10⁶个·g^-1。综合考虑原生质体产量和活性，矮牵牛叶肉原生质体分离较适宜的离析酶浓度为0.4wt％。

(5)针对步骤B中的纤维素酶浓度，本发明设置1.0wt％、1.5wt％、2.0wt％、2.5wt％共4个浓度。结果表明，综合原生质体产量和活性来看，2.0wt％为分离矮牵牛叶肉原生质体较适宜的纤维素酶浓度。具体如下：

在最适宜的甘露醇浓度和酶解时间下，酶混合液添加0.2％果胶酶和适宜的离析酶浓度外，另设置1.0wt％、1.5wt％、2.0wt％、2.5wt％共4个浓度梯度，分离原生质体。测定各处理下原生质体的产量和活性，确定最适的纤维素酶浓度。

纤维素酶对原生质体产量和活性的影响：

由图5可看出，纤维素酶显著影响原生质体的产量及活性。在一定浓度范围内，随着纤维素浓度的升高，原生质体产量和活性同步增加，且当浓度为2.0wt％时，产量及活性均达到峰值，分别为2.87×10⁶个·g^-1和87.5％。当浓度为1.0％时，原生质体产量较低，形状不规则，大小不一，部分原生质体观察不到清晰的边缘，说明此 时有的细胞壁还没有完全被游离。当浓度为2.5wt％时，原生质体产量及活性都开始下降，原生质体破裂程度开始严重。综合考虑原生质体产量和活性，矮牵牛叶肉原生质体分离较适宜的纤维素酶浓度为2.0wt％。

(6)针对步骤C中升降加速度，本发明设置0、5、9共3个升降加速度。结果表明，综合原生质体产量和活性来看，当升价加速度为0时，纯化原生质体效果最好。具体如下：

适宜的条件下获得原生质体，分别设置0、5和9共3个升降加速度纯化原生质体。测定各处理原生质体的产量和活性，确定最适的升降加速度。

离心时升降加速度对原生质体纯化的影响

由图6可看出，纯化原生质体时，升降加速度影响原生质体活性，对原生质体产量无显著影响。当升降加速度处于0时，离心机转速0rpm上升到1100rpm需要时间较长，原生质体在离心力的作用下沉降速度减慢，彼此之间受挤压程度较轻，完整性良好；当升降加速度处于最大值9时，原生质体沉淀在一起，相互挤压程度严重，在显微镜下观察到破碎的原生质体较多，活性为66.7％。综合考虑原生质体产量和活性，矮牵牛叶肉原生质体离心纯化时较适宜的升降加速度为0。

(7)针对步骤E原生质体培养液中的激素组合，本发明设置7个激素组合。结果表明，由原生质体启动分裂时间和分裂频率考虑，以0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA的激素组合培养原生质体最好。具体如下：

按照上述游离方法获得矮牵牛叶肉原生质体，以KM₈P为基础培养基，培养密度为1.0×10⁵个/ml，进行固液培养，激素浓度比例见下表1。每天观察原生质体生长状态，记录再生细胞启动分裂时间，统计分裂频率。

表1原生质体初期培养基(KM8P)

激素比例对矮牵牛原生质体培养的影响：

结果如表2所示，所用7种激素组合均可以促进叶肉原生质体分裂，以0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA的组合(组合3)最好，叶肉原生质体在培养第3d出现第一次分裂，且在第5-6d达到分裂高峰期，分裂频率达到27.33％。在此基础上，增加6-BA浓度(组合5和7)，原生质体一次分裂频率下降，所以6-BA浓度不宜超过0.5mg/l。当6-BA浓度一定时，增加2.4-D的浓度可刺激再生细胞的分裂。在组合3中，刚分离出的叶肉原生质体呈球形(图8-1)，边缘清晰，细胞质较浓，并含有较大的颗粒内含物。培养1-2d，多数原生质体体积增大，其中的一些再生细胞变为卵圆形，这标志原生质体新的细胞壁形成(图8-2)。与此同时，原生质体再生细胞中含有的颗粒内含物渐渐消失。培养3d后，再生细胞开始第一次细胞分裂(图8-3)，细胞分裂有均等分裂和不均等分裂，并伴有原生质体之间轻度粘连现象的发生。再生细胞一旦分裂便能持续分裂(图8-4和8-5)。14d后在显微镜下可观察到小细胞团的形成(图8-6)，培养17d左右，会形成肉眼可见的微愈伤组织，颜色为乳黄色(图8-7)。

表2激素比例对原生质体初期培养的影响

注：同一列字母不同者差异显著(P<0.05)，字母相同者差异不显著(P>0.05)

(8)针对步骤E原生质体培养密度，本发明设置0.1×10⁵个/ml、0.5×10⁵个/ml、1.0×10⁵个/ml、5.0×10⁵个/ml共4个培养密度。结果表明，由原生质体启动分裂时间和分裂频率考虑，适宜的培养密度为0.5～1.0×10⁵个/ml。具体如下：

按照上述游离方法获得矮牵牛叶肉原生质体，以KM₈P为基础培养基，激素组合选择上述最优组合，设置0.1×10⁵个/ml、0.5×10⁵个/ml、1.0×10⁵个/ml、5.0×10⁵个/ml共4个培养密度。每天观察原生质体生长状态，记录再生细胞启动分裂时间，统计分裂频率。

培养密度对矮牵牛原生质体培养的影响：

结果如表3所示，当培养密度0.1×10⁵个/ml时，再生细胞分裂频率只有8.33％，出现第一次分裂时间为4-5d。随着培养密度增加，原生质体第一次分裂频率随之增加，当培养密度为0.5×10⁵～1.0×10⁵个/ml时，原生质体均可维持较高的分裂频率(20％)， 培养3d后会有少数再生细胞聚集。当密度为5×10⁵个/ml时，原生质体聚集情况较为严重，培养4d后只有外围聚集的细胞出现细胞分裂，但分裂频率大幅下降，10d后聚集在一起的大多数细胞出现褐化。

表3培养密度对原生质体初期培养的影响

注：同一列字母不同者差异显著(P<0.05)，字母相同者差异不显著(P>0.05)

(9)针对步骤E原生质体的培养方法，本发明设置固液培养和固体培养两种方法。结果表明，两种培养方法效果无差异，从操作简便考虑，宜采用固液培养法。具体如下：

按照上述游离方法获得矮牵牛叶肉原生质体，以KM₈P为基础培养基，选择优化后的激素浓度和培养密度，分别利用固液培养法和固体培养法培养原生质体。每天观察原生质体生长状态，记录再生细胞启动分裂时间，统计分裂频率。

培养方式对矮牵牛原生质体培养的影响：

结果如表4所示，固体培养时再生细胞第3d开始第一次分裂，仅比固液培养提前1d，分裂频率为26％，且原生质体再生细胞中含有的颗粒内含物消失时间快于固液培养，在5-8d出现细胞分裂高峰，此时再生细胞持续分裂并形成小细胞团，约15d后即发育成肉眼可见的微型愈伤组织，至30d后，有部分小愈伤组织直径可达2mm，质地疏松，颜色为浅黄色。

而采用固液培养，第一次分裂时间与固体培养差不多，分裂频率也仅略低于固体培养，但是固液培养操作相对固体培养更为简便，且对原生质体损害更小。因此，本发明选择固液培养。

表4培养方式对原生质体培养的影响

注：同一列字母不同者差异显著(P<0.05)，字母相同者差异不显著(P>0.05)

(10)针对步骤F中增殖培养基，本发明设置3个激素组合，分别为0.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA、0.5mg/l 6-BA+1.0mg/l NAA和0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA。结果表 明，由愈伤组织增殖状态考虑，适宜的激素组合为0.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA。具体如下：

当原生质体再生细胞发育成肉眼可见的愈伤组织长到1-2mm时，需要转移至增殖培养基中，增殖培养基设置3个激素组合，分别为0.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA、0.5mg/l6-BA+1.0mg/l NAA和0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA。定期观察愈伤组织生长状态，记录生长情况。培养温度(24±1)℃，光照14h·d^-1，光照强度3000lux。

增殖培养基中激素组合对愈伤组织增殖的影响：

结果如表5所示，编号3培养基(0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA)中，愈伤组织增殖速度缓慢，颜色呈米黄色，阻碍愈伤组织的进一步分化。编号1培养基中愈伤组织增殖速率最快，状态良好，颜色由刚接种时的乳黄色变为绿色或鲜绿色，致密程度较好，适于分化培养(图8-8)，增殖效果稍好于编号2。因此编号1(0.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA)为最佳微愈伤组织增殖培养基。

表5激素比例对微愈伤组织增殖的影响

(11)针对步骤F中分化培养基，本发明设置4个激素组合，分别为0.5mg/l ZT+0.1mg/l NAA、1.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA和2.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA、40mg/l ZT+0.1mg/l NAA。结果表明，由愈伤组织分化情况考虑，适宜的激素组合为1.0mg/l 6-BA+0.1mg/l NAA。具体如下：

选择生长状态良好的愈伤组织，转至分化培养基中，分化培养基设置4个激素组合，分别为0.5mg/l ZT+0.1mg/l NAA、1.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA和2.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA、40mg/l ZT+0.1mg/l NAA。定期观察愈伤组织生长状态，记录生长情况。培养温度(24±1)℃，光照14h·d^-1，光照强度3000lux。

ZT对矮牵牛愈伤组织分化的影响：

结果如表6所示，ZT有利于促进愈伤组织芽的分化，其中以1.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA的激素组合为最佳，愈伤组织第16d分化出芽，出芽率为20％，愈伤组织长势良好，颜色鲜绿，结构致密，直径约1.2-1.5cm；在激素组合4中，虽然愈伤组织长势良好，与组合2类似，但没有分化出芽(图8-9和8-10)。可见适宜浓度的ZT对矮牵牛 原生质体再生愈伤组织的芽的分化有促进作用。

表6ZT对愈伤组织分化的影响

激素组合ZT(mg/l)NAA(mg/l)出芽率(％)10.50.16.721.00.120.032.00.113.344.00.10

实施例

本实施例涉及矮牵牛叶肉原生质体分离及培养的方法，矮牵牛品种为锦浪系列(Petunia hybrida‘Shock Wave’)白色花品种，种子来源于泛美种子公司。具体包括如下步骤：

1、准备材料：取矮牵牛顶芽下第3～5片幼嫩叶片，称量0.5g。肥皂水浸泡20min，流水冲洗1.5h。于无菌操作台中，75％酒精浸泡20s，立即转入1％双氧水消毒2min，无菌水冲洗3遍，无菌滤纸吸干水分，切成0.5mm宽彼此相连的细丝；

2、酶解：向6cm小培养皿中加入5ml的酶解液中，把经过消毒的叶片平铺在酶液中，使之相互不重叠。26℃黑暗条件静置酶解，每隔1h轻晃培养皿，以使两相充分接触。酶解液的溶剂为水溶液，溶质为如下终浓度的物质：2wt％纤维素酶、0.4wt％离析酶、0.2wt％果胶酶、0.5M甘露醇、0.11wt％无水氯化钙、0.10wt％牛血清白蛋白、20mM>

3、纯化：酶解结束后，向酶混合液中加入10ml洗液，摇晃30s，移液枪吸取溶液到300目不锈钢细胞筛上，经细胞筛过滤细胞团和组织，把滤液转移到50ml大试管中，Centrifuge 5810R离心机1100r/min室温离心2min，升降加速度设为0。吸去上清液，向沉淀中加入15ml洗液，以相同的转速和离心时间重复洗涤2次。吸取纯化后的上清液，收集底部的原生质体。CPW洗液中溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.5M的甘露醇，pH为5.6～5.7(0.5M NaOH溶液微调即可)。

4、悬浮原生质体：加入原生质体培养液，获得纯化后的原生质体；所述原生质体培养液溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.375wt％KM₈P、20mM>

5、统计原生质体产量。每个样品重复6次，取平均值，最后计算原生质体产量。

计算公式：细胞数/ml＝100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数

原生质体产量(个/g)＝[原生质体数(个/ml)×稀释后的体积(ml)]/叶片总质量(g)

6、检测原生质体活性：将5mg双醋酸乙酸酯溶于1ml丙酮作为双醋酸乙酸酯母液(0℃保存)，然后向1ml悬浮的原生质体中加25ul双醋酸乙酸酯母液，室温3min反应后，取少量溶液置于载玻片用荧光显微镜观察。原生质体活性以一个视野中有活性的原生质体占该视野中原生质体总数的百分数来表示，选取10个有代表性的视野进行统计。

7、培养原生质体：向沉淀中加入原生质体培养液，将密度调整为0.5～1.0×10⁵个/ml，于24℃黑暗环境中，固液培养法培养，培养15d添加新鲜原生质体培养基，此后每隔7d添加一次；所述原生质体培养液溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.375wt％KM₈P、20mM>

8、对愈伤组织增殖及诱导：培养30d后，将步骤E中形成的微愈伤组织转移至增殖培养基；21d微愈伤组织长至5mm，转移至分化培养基；所述增殖培养基的溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.44wt％MS培养基、2wt％蔗糖、0.7wt％琼脂、0.5mg/l 6-BA、0.5mg/l NAA；所述分化培养基的溶剂为水溶液，溶质为终浓度的0.44wt％MS培养基、2wt％蔗糖、0.7wt％琼脂、1.0mg/l ZT、0.1mg/l NAA。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。