矮牵牛和小花矮牵牛原生质体分离培养及再生

摘要

矮牵牛（Petunia hybrida）素有“花坛植物之王”的美誉。目前矮牵牛花色品种丰富，但由于花色素代谢特征和基因资源限制，黄色花及橙色花品种极为少见；小花矮牵牛（Calibrachoa hybrida）与矮牵牛为同科不同属的植物，近几年广为栽培，具有各种鲜亮的黄色、橙色品种，可以为黄色矮牵牛品种培育提供基因资源，但两者亲缘关系相对较远，存在明显的有性杂交障碍，难以获得远缘杂交后代。植物体细胞融合技术可克服远缘杂交亲和性差的困难，为培育黄色矮牵牛种质资源提供一条可行途径。本实验以矮牵牛锦浪系列(Petunia hybrida?Shock Wave‘)白色花品种和小花矮牵牛（Calibrachoa hybrid?lindurayellow‘）黄色花品种为材料，探索影响叶肉原生质体分离及培养的诸多因素，建立适合该品种矮牵牛和小花矮牵牛的原生质体分离以及培养体系，为矮牵牛和小花矮牵牛通过体细胞融合培育矮牵牛新品种奠定基础。　　1.矮牵牛原生质体分离培养及再生　　（1）原生质体分离体系的建立　　以顶芽下第3-5节上完全伸展的幼嫩叶片为材料，通过对甘露醇浓度、水解酶种类及浓度、酶解时间、离心加速度等因素的比较得到适宜分离条件为，酶解液由2%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.4%离析酶+0.5 M甘露醇+20 mM MES+0.1%BSA+0.11%CaCl2组成，静置酶解5 h，1100 rpm离心2 min，升降加速度为0。原生质体产量及活性可分别达到2.90×106个·g-1和88.1%。　　（2）原生质体培养及再生　　通过对培养方法、激素浓度及原生质体培养密度等因素的比较得到，适宜的培养条件为，纯化后的原生质体在KM8P+0.5 mg/l6-BA+2.0 mg/l NAA培养基中固液培养，培养密度为0.5×105个/ml，黑暗环境24℃恒温培养。培养17 d后形成肉眼可见的乳黄色微愈伤组织，培养30 d后，将微愈伤组织转移至增殖培养基，培养基成分为MS+2%蔗糖+0.7%琼脂+0.5 mg/l6-BA+0.5 mg/l NAA，培养温度(24±1)℃，光照14h·d-1，光照强度3000 lux，20 d后微愈伤组织长至5 mm，转移至分化培养基中:　　（1）培养基成分为MS+2%蔗糖+0.7%琼脂+0.5 mg/l6-BA+0.1 mg/l NAA，第13 d分化出根；　　（2）培养基成分为MS+2%蔗糖+0.7%琼脂+1.0 mg/l ZT+0.1 mg/l NAA，第16 d分化出芽。　　2．小花矮牵牛原生质体分离及培养　　（1）原生质体分离体系的建立　　以幼嫩叶片为材料，通过对甘露醇浓度、水解酶种类及浓度、酶解时间、预处理方式等因素的比较得到，适宜分离条件为，4℃黑暗预处理叶片24 h，酶液成分为2%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.8%离析酶+0.25 M甘露醇+20 mM MES+0.1%BSA+0.11%CaCl2，静置酶解5 h，1200 rpm离心2 min，升降加速度为0。原生质体产量及活性可分别达到5.60×106个·g-1和87%。　　（2）原生质体培养体系的建立　　通过对原生质体培养方法、激素浓度及培养密度等因素的比较得到，适宜的培养条件为，纯化后的原生质体在KM8P+0.5 mg/l6-BA+0.5 mg/l NAA培养基中固体培养，培养密度为0.5~1.0×105个/ml，黑暗环境24℃恒温培养。培养第3 d原生质体再生细胞壁，第4-5 d开始第一次分裂，分裂频率为0.6%，21 d后可肉眼观察到培养皿中白色的微愈伤组织。

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缩略词表

第一章 绪论

1.1概述

1.2 植物原生质体再生体系的建立

1.3原生质体的发育及植株再生

1.4矮牵牛及小花矮牵牛原生质体研究进展

1.5本研究的目的和意义

第二章 矮牵牛原生质体分离培养及再生

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 本章小结

第三章小花矮牵牛原生质体的分离及培养

3.1材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4本章小结

第四章总结与展望

4.1研究总结

4.2展望

图版

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文