矮牵牛原生质体分离的优化及PhAAE13a、PhAAE13b和PhERF6的亚细胞定位

摘要

具有气味的挥发性物质和表现出颜色的花色苷类是植物的次生代谢产物，研究其合成途径尤为重要。本实验室前期做了矮牵牛PhAAE13a基因的沉默，结果显著降低花色素的积累，但PhAAE13b的沉默并不改变矮牵牛花中的花色素苷含量。该基因在拟南芥中定位于细胞质和线粒体中，但是在矮牵牛中的定位还不清楚。乙烯响应因子（Ethylene-responsive element-binding factor，ERFs）位于乙烯信号转导途径的最下游。本实验室前期的研究结果表明：矮牵牛PhERF6基因在调控花香的合成方面起重要作用。但关于其定位以及与乙烯之间的调控关系还未做研究。本实验对PhAAE13a、PhAAE13b和PhERF6进行亚细胞定位，并对PhERF6在花发育过程中的表达和乙烯与PhERF6之间的调控关系进行探索。此外，还对原生质体的提取进行优化，以获得好的原生质体，有利于亚细胞定位。结果如下：
　　原生质体提取溶液配方和提取方法进行优化，包括选择‘玫红’、植株大小30d左右、叶片处理方式为纵向切丝、溶液渗透压为500Os、酶解容器为25ml小烧杯和酶解时间为1h等。这些优化能提高原生质体的数量与质量，有利于亚细胞定位。
　　将PhAAE13a和PhAAE13b基因片段连接到pSAT6-eGFP载体，重组后的质粒导入矮牵牛原生质体进行观察，结果表明PhAAE13a与PhAAE13b都定位于细胞核和细胞质中。
　　PhERF6定位于细胞核中，且PhERF6在花的发育过程中的表达出现一定的规律性。在花蕾初期表达量最高，随着花蕾的伸长，表达量逐渐降低；在花完全展开后其表达量又缓慢升高。说明PhERF6可能在花发育的早期和花开放之后发挥重要作用。在乙烯处理后，PhERF6的表达量明显升高。

目录

声明

英文缩略词与英汉对照

1 前言

1. 1 次生代谢概况

1. 2 花青素的研究概况

1. 3 花香的研究进展

1.4 ERF基因的研究进展

1. 5 亚细胞定位的研究进展

1. 6 目的与意义

2 材料与方法

2. 1 实验材料与用品

2. 2 实验方法

3 结果与分析

3. 1 PhAAE13a和PhAAE13b全长序列的分析

3. 2 PhAAE13b基因的克隆

3. 3原生质体提取方法的优化

3. 4 亚细胞定位

3. 5 PhERF6荧光定量PCR结果

4. 1 讨论

4. 2 结论

致谢

参考文献

附录A

附录B