一种快速检测含油微生物含油量的方法

摘要

本发明提供了一种快速检测含油微生物含油量的方法，包括制备若干与待测含油微生物相同品种的微生物菌体样品、采集各样品低场核磁信号、测定各微生物样品的含油量真实值、构建预测模型、采集待测样品的低场核磁CPMG衰减曲线谱图、检测待测样品含油量等。本发明方法无需破坏微生物菌体，测试速度快，准确性高；本发明方法样品不需要复杂的前处理，无需使用有毒的有机试剂，成本低，对环境污染小，充分体现了绿色环保的观念；本发明方法降低含油微生物油脂含量检测的成本、提高检测效率，促进微生物菌株的优选，促进微生物油脂产业发展，进一步保证油脂原料的稳定和连续供应。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速测定微生物含油量的方法，属于微生物油脂测定的技术领域，特别涉及一种利用低场核磁共振技术测量微生物油脂含量的方法。

背景技术

长链脂肪酸甘油酯(油脂)是重要的食用品和化工原料。此外，随着能源的短缺现象加剧，油脂还被广泛应用于生产生物柴油燃料，油脂资源的需求量日益增加。目前，油脂资源的获取以动物油脂和植物油脂为主。然而，传统的油料来源受到耕地、季节和自然条件的制约，难以保证原料的稳定和连续供应。

自然界中一些微生物经过发酵，可在体内积累油脂。部分微生物油脂的脂肪酸组成和常见的植物油脂如菜籽油、棕榈油、大豆油等相似，可作为食用品、化工原料、生物柴油的替代品。此外，利用微生物生产油脂还具有不受季节和气候的影响、生产原料来源广泛、生产周期短、产品高值化等优点，因此具有重要应用前景。

目前，制约微生物油脂产业发展的瓶颈问题是昂贵的生产成本，其根本取决于微生物菌株的含油量，而含油量的提高相对降低了生产成本。因此，培育出生长迅速、适应性强、油脂含量高的微生物新品种是加快其产业化进程的关键环节。微生物油脂是胞内产物，因此，通常采取有机溶剂提取后称重的方式定量。现常用的方法有：索氏提取法(李超.食品分析原理与技术.北京:科学技术文献出版社,1987)、溶剂浸提法(李植峰,张玲.微生物学通报,2001,28(6),72)、酸热法(李植峰,张玲.微生物学通报,2001,28(6),72)、超声波辅助溶剂浸提法(Vicente G,Bautista LF,Rodríguez R,et al.Biochemical Engineering Journal,2009,48(1),22)、微波辅助溶剂浸提法(Young JC.Journal of Agricultural and Food Chemistry,1995,43(11),2904)等。上述方法的共同特点是：操作复杂，样品需要大量前处理过程，使用高毒性有机溶剂，易造成环境污染，耗时长，难以满足含有微生物大规模筛选的要求。因而，寻找快速高效测定微生物油脂含量的方法，对于富油微生物高通量筛选及胞内油脂含量的快速测定等具有重要意义。

低场核磁共振是近年来发展的一种快速检测方法。其基本原理是通过对处于恒定磁场中的样品施加射频脉冲，使氢质子发生共振，质子以非辐射的方式释放所吸收的射频波能量返回到基态，此过程将产生弛豫信号，该弛豫信号强度与被测样品中所含核自旋数目成正比，信号衰减过程与被测物质的成分结构密切相关。对弛豫信号进行反演分析，可以获得被测样品的各种成分和微观结构信息，从而达到了检测目的。低场核磁共振技术现已广泛应用于污泥中油含量的检测(CN201510166615.6)、液态食用油品质鉴定(CN201410495096.3、CN201010268825.3)等方面，具有分析结果准确，重复性好，测量时间短等优点。目前，将低场核磁共振技术应用于微生物胞内产物检测的技术暂未发现。

发明内容

本发明目的在于，提供一种简单、快速、准确、环保的检测微生物油脂含量方法，同时降低检测成本，进而，促进微生物菌株的优选，促进微生物油脂产业发展，进一步保证油脂原料的稳定和连续供应。

为达到上述目的，本发明提供了一种快速检测含油微生物含油量的方法，包括如下步骤：

S1、取若干与待测含油微生物相同品种的微生物菌体，干燥至恒重，得到微生物样品；

S2、采集步骤S1得到的各微生物样品的低场核磁CPMG衰减曲线谱图；采用一维反拉普拉斯算法作为横向弛豫时间谱反演算法，得到各微生物样品的弛豫时间谱T2曲线；

S3、提取步骤S1得到的各微生物样品的油脂、称重，得到各微生物样品含油量真实值；

S4、将步骤S2得到的各样品回波衰减曲线数据与步骤S3得到的各微生物样品的含油量真实值相关联，利用主成分分析和最小二乘回归方法进行拟合得到含油微生物含油量PLSR预测模型；

S5、将所述待测含油微生物烘干至恒重，得到待测含油微生物样品；采集所述待测样品的低场核磁CPMG衰减曲线谱图，分析谱图数据，调用步骤S4建立的预测模型，获得待测含油微生物的含油量。

优选方式下，步骤S1所述含油微生物为经发酵培养后，油脂含量超过细胞干重10wt％的真菌、微藻、细菌、基因工程菌、经过自然或人工改造的突变菌株；最优方式下，所述真菌为圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、白 色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、乳糖红酵母(Rhodotorula lactosa)、小红酵母(Rhodotorula minuta)、橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)、健强地霉(Geotrichum robustum)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、小克银汉霉(Cunninghamella)或伯顿拟内孢霉(Endomycopsis burtonii)；所述微藻为布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、小球藻(Chlorella protothecoides)、微绿球藻(Nannochloropsis sp.)或裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)；所述细菌为棒状杆菌(Corynebacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)、分枝杆菌(Mycobacterium)。

优选方式下，步骤S2、步骤S5所述低场核磁分析的CPMG序列参数为：90度脉宽P1：13μs；180度脉宽P2：26μs；重复采样等待时间Tw：2000ms；模拟增益RG1：[10到20，均为整数]；数字增益DRG1：[2到5，均为整数]；前置放大增益PRG：[0到3]；重复采样次数NS：4，8，16；回拨个数NECH：2000；接收机带宽SW：100，200，300KHz；开始采样时间的控制参数RFD：0.002-0.05ms；时延DL1：0.1-0.5ms进行核磁共振信号采集。

优选方式下，步骤S2所述采集样品低场核磁信号，每组所述含油微生物样品低场核磁CPMG谱图进行两次及以上的平行检测。

每组样品进行多次平行检测分析，一方面，可以了解前后两次或多次测试数据的误差，从而了解低场核磁共振方法在微生物油脂品质鉴定中的误判概率；另一方面，同一个样品多测几组，可以排除仪器误差。

优选方式下，步骤S3采用有机溶剂提取步骤S1制备的含油微生物样品的油脂。最优方式下，步骤S3提取所述含油微生物样品油脂的方法为氯仿-甲醇法、索氏抽提法、正己烷-异丙醇法、正己烷-乙醇法、乙醚-石油醚法中的一种或几种组合。

本发明的有益效果是：

1、与传统微生物含油量测定方法相比，本发明方法无需破坏微生物菌体，测试速度快，准确性高。

2、本发明方法仅前期建立模型涉及到提取微生物油脂过程，一旦建立模型后，之后含油量的测定不需要再提取油脂、直接低场核磁分析即可。因而，采用本发明方法检测时，样品不需要复杂的前处理，无需使用有毒的有机试剂， 成本低，对环境污染小，充分体现了绿色环保的观念。

3、本发明方法降低含油微生物油脂含量检测的成本、提高检测效率，促进微生物菌株的优选，促进微生物油脂产业发展，进一步保证油脂原料的稳定和连续供应。

附图说明

图1为微生物油脂含量CPMG衰减曲线；

图2为微生物油脂含量横向弛豫图谱；

图3为微生物油脂含量PLSR模型残余方差和主成分数量关系图；

图4为校正集微生物油脂含量PLSR模型的预测值与真实值回归谱图；

图5为交互验证集微生物油脂含量PLSR模型的预测值与真实值回归谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施实例对本发明做进一步说明。

实施例1

(1)发酵性丝孢酵母(Trichosporonfermentans CICC1368)培养方式参考文献(WuSG,ZhaoX,ShenHW,WangQ,ZhaoZK.BioresourceTechnology,2011,102(2):1803)。发酵液50ml，经120h限硫培养。其中，培养基中硫元素浓度设置6个梯度，硫元素(S)浓度分别为0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，分别标记为1，2，3，4，5，6组，每个梯度设置3个平行，通过限制硫元素，获得不同含油量的菌体。发酵完毕后，将发酵液于6000rpm离心10min，收集菌体。菌体105℃干燥24h至恒重，将干菌体搜集后置于2ml试管中。

(2)低场核磁仪器(NM120-030H-I)经过校正后，设置CPMG序列参数为：90度脉宽P1：13μs，180度脉宽P2：26μs，重复采样等待时间Tw：2000ms，模拟增益RG1：12，数字增益DRG1：2，前置放大增益PRG：1，重复采样次数NS：16，回拨个数NECH：2000，接收机带宽SW：300KHz，开始采样时间的控制参数RFD：0.02ms，时延DL1：0.2ms。将所有样品进行核磁共振信号采集，获得含油菌体低场核磁CPMG衰减谱图(如图1所示)，共6组样品。采用一维反拉普拉斯算法作为横向弛豫时间谱反演算法，得出微生物油脂的弛豫时间谱图T2曲线(如图2所示)。

(3)微生物油脂的提取：(1)中所述所有菌体使用酸热-有机溶剂法抽提获得油脂，称重计算菌体油脂含量，即得到微生物油脂质量的真实值，1，2，3， 4，5，6组油脂量分别为0.155g，0.300g，0.445g，0.180g，0.140g，0.120g，。

(4)预测模型构建：将所获得的回波衰减曲线数据与所对应的油脂质量真实值相关联，利用主成分分析和最小二乘回归方法进行拟合，获得的CPMG序列回波衰减曲线数据与上述步骤中对应的微生物油脂质量进行拟合，获得微生物油脂质量PLSR预测模型。图4为校正集微生物油脂含量PLSR模型的预测值与真实值回归谱图，图5为交互验证集微生物油脂含量PLSR模型的预测值与真实值回归谱图；校正集和交互验证集相关系数R_cal²和R_cv²分别为0.9264，0.9037,均大于0.9；校正集和交互验证集的标准差RMSE分别为2.09％和2.38％，均较小，说明利用低场核磁共振仪准确地预测微生物油脂含量的方法切实可行。通过预测残余方差和主成分关系图来确定建立模型所需的最佳主因子数为1(如图3所示)。

(5)未知样品的测定：发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans CICC 1368)发酵液20ml，经96h培养后，将发酵液于6000rpm离心10min，收集菌体，菌体105℃干燥24h至恒重。干菌体搜集置于2ml试管中，进行低场核磁快速测定。

按照所设参数分析样品，对所得数据利用Unscramb软件进行分析，再利用建立的预测模型获得预测值为0.1186g。

利用酸热-有机溶剂法抽提获得油脂，实际测量值0.1205g，相对误差为2％。因此，采用低场核磁技术测定的油脂含量与实测值相当，说明低场核磁法测量结果准确可靠。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。