FATS作为黑色素瘤免疫治疗的靶点及应用

摘要

本发明创造提供了FATS基因或其表达产物在黑色素瘤免疫环境中发挥的作用，能够作为黑色素瘤相关疾病的功能产品的靶点，还可以用于黑色素瘤相关疾病的功能产品的体外筛选。

说明书

技术领域

本发明创造属于生物技术领域，具体涉及FATS作为黑色素瘤免疫治疗的靶点及应用。

背景技术

黑色素瘤是一种恶性肿瘤，起源于黑色素细胞，在所有的皮肤肿瘤中最具侵袭性。这些产生色素的细胞在体内可以来源于不同的组织包括皮肤，黏膜以及结膜等。几十年以来，许多用于恶性肿瘤的化疗药物与方法被不断的开发，但是转移性黑色素瘤病人的生存率却没有增加。2015年黑色素瘤在美国发病人数大约是73,870人次。尽管黑色素瘤没有其他皮肤癌症常见，例如基底细胞癌以及鳞状细胞癌，但是黑色素瘤引起的死亡在皮肤癌症中占巨大的比例。根据肿瘤程度的不同，黑色素瘤病人的存活率有着明显的差别，早期病人只需要手术切除，转移病人的5年生存率仅为16.6％。

幸运的是，近些年来，对黑色素瘤的了解为临床提供了有利的信息。随着强大的分子诊断工具的出现，许多基因突变，放大或者删除在肿瘤生长，存活以及对小分子抑制剂的敏感反应中被发现，这使高效的信号转导靶点以及免疫治疗靶点得以发展，先前不良的预后在系统治疗出现之后有了改观。自从2011年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了6种药物(易普利姆玛，维罗非尼，达拉非尼，曲美替尼等)，这些药物可以通过4种不同的机制(抑制CTL相关抗体抑制剂，抑制BRAF，抑制MEK以及抑制PD-1受体)对黑色素瘤进行治疗。

研究所发现的致癌的BRAF的突变在高达50％的黑色素瘤中促进着肿瘤的生长，BRAF以及其他基因，例如KIT的突变的发现，为系统治疗引入了不同的方法。靶点治疗，包括BRAF和MEK抑制剂，改变了BRAF V600突变的黑色素瘤病人总的存活率。在过去的5到10年里，黑色素瘤的治疗也由于新的一类免疫调节因子的发现而有了很大的变化，免疫检查点的抑制极大的改变了治疗现状。免疫调节检查点的失活限制了黑色素瘤中T细胞的免疫应答，这都是癌症免疫治疗的靶点。免疫检查点抑制剂易普利姆玛以及抗PD-1抗体，以CTLA-4和PD-1/PD-L1为靶点治疗的成功，在临床治疗中有了深远的意义。

大量的研究表明，肿瘤的免疫治疗是晚期肿瘤病人的一种治疗选择。目前，肿瘤的免疫治疗可以破坏肿瘤细胞，免疫系统的功能水平与肿瘤的预后以及肿瘤的临床治疗效果密切相关。研究发现，靶定肿瘤微环境(TME)已经成为目前抗肿瘤治疗的重要策略。目前已知，肿瘤微环境中的免疫细胞可以影响肿瘤的发生，发展，侵袭与最终的结果。

染色体脆性位点是正常基因组中位点特异的不稳定区域，包括88个普通型脆性位点(CFS)和39个稀有型脆性位点，CFS为染色体上的正常组成结构。但在细胞分裂中期出现复制异常时，染色体中脆性位点为最易发生裂隙或断点的部位。CFSs在进化过程中的高度保守性。C10orf90是最近被确定的一种通用脆性位点，最初发现，在几种肿瘤细胞系中过表达C10orf90后表现出抑制肿瘤的作用，因而将C10orf90命名为脆性位点相关的肿瘤抑制因子(Fragile-site associated tumor suppressor，FATS)。有报道指出，CFSs与免疫也具有相关性。然而，目前对于FATS基因的研究非常有限，FATS基因在肿瘤免疫中的作用尚没有报道。我们的前期研究结果提示，FATS基因可能是一种重要的免疫调节因子，在自身免疫疾病以及肿瘤免疫中可能具有潜在的作用。

发明内容

本发明创造的目的在于提供FATS作为黑色素瘤免疫治疗的靶点的应用。

在本发明的一个方面，提供FATS基因或其表达产物(FATS基因的编码蛋白)在：

i)开发、筛选黑色素瘤功能产品方面的应用；或

ii)制备治疗或预防黑色素瘤的功能产品方面的应用。

在本发明的另一个方面，提供一种作用于FATS基因或其表达产物的用于治疗或预防黑色素瘤的功能产品。

在本发明的另一个方面，提供一种：

i)开发、筛选黑色素瘤功能产品的方法；或

ii)制备治疗或预防黑色素瘤的功能产品的方法。

其中，所述功能产品包括药品(或药物、药剂等)、抑制剂(或抑制物等)等能够对黑色素瘤的发生、发展产生治疗、缓解、抑制、调节等有益作用的产品或潜在物质；所述功能产品可以为单一制剂，也可以为包含有效量制剂成分的组合物，所述组合物中可以包括药剂学上能接受的载体。

其中，所述功能产品包括下调FATS基因的表达、转录或其表达产物的功能；所述方法包括下调FATS基因的表达、转录或其表达产物的步骤。本领域技术人员可知的能够下调FATS基因的表达、转录或其表达产物的手段包括但不限于以下一种或多种，均可以用于本发明：(i)DNA水平上：降低FATS基因拷贝数、转染FATS基因低表达载体；(ii)转录水平上：阻碍或抑制FATS基因的表达、阻碍或失活调控FATS基因表达的启动子、激活负调控FATS基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对FATS基因表达进行干扰；(iii)转录后水平上：激活促进FATS基因mRNA降解的microRNA转录表达、导入抑制FATS基因表达的microRNA；(iv)翻译后水平上：导入抑制FATS基因编码蛋白的分子、促进负调控FATS基因表达的蛋白、抑制FATS基因表达的银子及蛋白的表达。

在一些优选方案中，所述功能产品用于：增加肿瘤组织中炎性细胞的浸润。

在另一些优选方案中，所述功能产品用于：在外周免疫器官或肿瘤免疫微环境中，促进抗肿瘤免疫和/或抑制促肿瘤的免疫反应。

在另一些优选方案中，所述功能产品用于：在巨噬细胞定向分化中，促进向M1型巨噬细胞极化，和/或抑制M2型巨噬细胞的极化。

在另一些优选方案中，所述功能产品用于以下一种或优选的多种作用：

i)提高细胞毒性T淋巴细胞，NK细胞，γδT细胞和/或M1型巨噬细胞的比例；

ii)降低调节性T淋巴细胞和/或M2型巨噬细胞的比例；

iii)提高T细胞增殖相关细胞因子IL-2和/或M1型巨噬细胞分泌细胞因子IL-12的表达；

iv)提高巨噬细胞杀伤能力；

v)提高T细胞的增殖能力；

vi)降低巨噬细胞表达VEGF；

vii)抑制肿瘤组织血管生成；

viii)骨髓细胞在巨噬细胞定向分化中，促进向M1型巨噬细胞极化，和/或抑制M2型巨噬细胞的极化；

ix)促进M2型巨噬细胞的凋亡；

x)激活NF-κB信号通路。

在一些优选方案中，所述功能产品选自或含有：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，FATS基因缺陷或沉默的免疫相关细胞(如巨噬细胞)、其分化细胞或构建物中的一种或多种，能够在基因或蛋白水平上下调FATS基因的表达或其表达产物。

在另一些优选方案中，所述功能产品选自或含有：以FATS基因或其转录本为靶序列、且能够抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

在另一些优选方案中，所述功能产品选自或含有以下任一种：

i)以SEQ ID NO：1或其转录本为靶序列，且能够抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；

ii)能表达或形成i)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；

iii)含有SEQ ID NO：1或其互补序列，且能够在转入体内后形成抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物；

iv)抑制或敲除SEQ ID NO：1基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物；

v)以根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其转录本为靶序列，且能够抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；

vi)能表达或形成v)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；

vii)含有根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其互补序列，且能够在转入体内后形成抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物；

viii)抑制或敲除根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物。

所述构建物可以为细胞(如转染细胞)或表达载体。所述同源序列的同源性优选地大于70％。

其中，所述FATS基因或其表达产物应理解为包括：

i)FATS基因或其表达产物的原始序列或片段；

ii)FATS基因或其表达产物的保守性变体、生物活性片段或衍生物；

iii)根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的FATS基因或其表达产物的原始序列或片段；

iv)根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的FATS基因或其表达产物的保守性变体、生物活性片段或衍生物。

本发明创造具有如下优势：(1)揭示了FATS基因或其表达产物与黑色素瘤密切相关，从而可以作为药物靶点开发黑色素瘤的相关药物；(2)揭示了FATS基因或其表达产物在黑色素瘤中作用的细胞机制以及分子机制，为黑色素瘤的相关药物的开发提供了有效的目标手段或重大依据。

附图说明

图1是FATS基因缺陷抑制B16细胞小鼠皮下荷瘤黑色素瘤的发生发展。2×10⁵个B16细胞皮下注射到小鼠右后背部(野生型小鼠，n＝16；FATS基因缺陷小鼠，n＝15)，观察并测量肿瘤大小至荷瘤第20天，处死小鼠，检测小鼠黑色素瘤的体积以及重量；其中，A图为野生型小鼠与FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤的生长曲线；B图为野生型小鼠与FATS基因缺陷小鼠肿瘤典型代表结果；C图为两组小鼠的最终肿瘤重量；图D为两组小鼠的未成瘤率(P＝0.0083)；E图为两组小鼠的典型代表结果(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图2是FATS基因缺陷增加了炎性细胞向小鼠黑色素瘤中的浸润。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠黑色素瘤的部分肿瘤组织，石蜡包埋切片(切片厚度为5μm)，对切片进行H&E染色；后面两列分别是第一列图片方框内的组织放大图，绿色箭头所指的是浸润的炎症细胞。

图3是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠脾脏中T细胞和γδT细胞的比例。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的脾脏，分离脾脏单个核细胞，流式细胞术检测免疫细胞亚群(总T细胞以及γδT细胞)变化。A图为总的T细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；B图是两组小鼠脾脏总T细胞比例的统计图；C图为γδT细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；D图是两组小鼠脾脏γδT细胞比例的统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图4是FATS基因缺陷对黑色素瘤小鼠脾脏中NK细胞的影响。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的脾脏，分离脾脏单个核细胞，流式细胞术检测NK细胞的比例与活化。A图为NK细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；B图是两组小鼠NK细胞比例的统计图；C图左侧为NK细胞活化的典型流式图，右侧为NK细胞活化情况的统计图，纵坐标表示平均荧光强度(MFI)(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图5是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠脾脏中CTL的比例与活化程度。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的脾脏，分离脾脏单个核细胞，流式细胞术检测CTL细胞比例与活化。A图为CTL细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；B图是两组小鼠CTL细胞比例的统计图；C图CTL细胞活化情况的典型流式图；D图为CTL高度活化的高阳性CD44比例的统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图6是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠脾脏中IFN-γ⁺CTL和Th1细胞的比例。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的脾脏，分离脾脏单个核细胞，流式细胞术检测IFN-γ⁺CTL和Th1细胞比例。A图为IFN-γ⁺CTL细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图和统计图；B图是两组小鼠脾脏Th1细胞比例的典型流式图和统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图7是FATS基因缺陷对黑色素瘤小鼠脾脏中Treg和MDSC的影响。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的脾脏，分离脾脏单个核细胞，流式细胞术检测免疫细胞亚群(Treg，MDSC)变化。A图为Treg细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；B图是两组小鼠Treg细胞比例的统计图；C图MDSC细胞的比例统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图8是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠血清中T细胞活化因子的表达。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，对两组小鼠进行眼球取血，在血浆中加入肝素钠，静置后离心，取血清，进行多细胞因子ELISA检测(Bio-Plex)。图为两组小鼠血清中IL-2，IFN-γ，IL-12，IL-1β，TNF-α以及IL-10的表达情况的统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图9是FATS基因缺陷促进了肿瘤免疫微环境中的T细胞比例。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术检测总T细胞和CTL的比例变化。A图为总的T细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；B图是两组小鼠肿瘤微环境中总T细胞比例的统计图；C图为CTL在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；D图是两组小鼠肿瘤微环境中CTL比例的统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图10是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠肿瘤免疫微环境中γδT以及NK细胞的比例。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术检测免疫细胞亚群(NKT以及γδT细胞)变化。A图为NK细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；B图是两组小鼠肿瘤微环境NK细胞比例的统计图；C图为γδT细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；D图是两组小鼠肿瘤微环境中γδT细胞比例的统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图11是FATS基因缺陷增强了黑色素瘤肿瘤微环境中CTL的活化。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术检测CTL的活化。A图为活化的CTL细胞在FATS基因缺陷也野生型小鼠黑色素瘤肿瘤微环境中比例的典型流式图；B图是两组小鼠肿瘤微环境活化的CTL细胞比例的统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图12是FATS基因缺陷增加了黑色素肿瘤微环境中IFN-γ+CTL以及Th1的比例。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术检测IFN-γ+CTL以及Th1的比例。A图为CTL细胞分泌IFN-γ在FATS基因缺陷与野生型小鼠黑色素瘤肿瘤微环境中比例的典型流式图与统计图；B图为两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中Th1细胞比例的典型流式图与统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图13是FATS基因缺陷对黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中Treg和MDSC的影响。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术检测免疫细胞亚群(Treg以及MDSC)的变化。A图为Treg细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；B图是两组小鼠肿瘤微环境中Treg细胞比例的统计图；C图MDSC细胞的比例统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图14是FATS基因缺陷促进了肿瘤微环境中M1型巨噬细胞，抑制了M2型巨噬细胞。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，部分组织甲醛固定，剩余组织分离单个核细胞，流式细胞术检测免疫细胞亚群(M1，M2型巨噬细胞)变化以及免疫荧光检测肿瘤组织切片中CD206的表达。A图为M1型巨噬细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；B图为M1型巨噬细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的统计图；C图为M2型巨噬细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；D图为M2型巨噬细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的统计图；E图为肿瘤组织切片中CD206的表达情况，红色箭头所指为染上CD206的细胞(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图15是FATS基因缺陷增加了M1型巨噬细胞，抑制了M2型巨噬细胞相关因子的基因表达。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术分选巨噬细胞，提取巨噬细胞RNA，检测M1和M2型巨噬细胞表达，极化相关因子的基因水平。A图为肿瘤微环境中巨噬细胞表达的M1型巨噬细胞相关因子(IL-12，TNFα和NOS2)的基因水平；B图为肿瘤微环境中巨噬细胞表达的M2型巨噬细胞相关因子(IL-10，Agr1，Mrc1(CD206)以及CCL22)的基因水平(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图16是FATS基因缺陷抑制了黑色素瘤肿瘤微环境中的血管生成。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，甲醛固定，切片，免疫荧光检测肿瘤组织切片中CD31的表达。图为FATS基因缺陷小鼠肿瘤组织中CD31表达情况，白色箭头所指为染上CD31的细胞，蓝色背景为DAPI染色。

图17是FATS基因缺陷并没有影响T细胞体外增殖。磁珠分选未荷瘤的野生型以及FATS基因缺陷小鼠的脾脏CD3⁺T细胞，CFSE染色后，培养在提前过夜抗体包被的48孔细胞培养板中，培养上清为还有10％FBS的1640培养基或者是B16细胞培养上清，培养4天后，流式细胞术检测T细胞的增殖情况。图左侧为B16细胞培养上清培养的两组小鼠的T细胞的增殖指数统计图；图右侧为含有10％FBS的1640培养基培养的FATS基因缺陷小鼠与野生型小鼠的T细胞的增殖指数统计图。

图18是FATS基因缺陷增强了黑色素瘤肿瘤微环境中巨噬细胞的提呈能力。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术分选巨噬细胞，丝裂霉素C处理巨噬细胞后与磁珠分选出的CD3⁺T细胞1：4混合，共培养，流式检测T细胞的增殖变化。A图为共培养后T细胞的增殖指数统计图；B图为培养上清中IL-2的表达情况(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图19是FATS基因缺陷小鼠肿瘤中的巨噬细胞具有更强的细胞杀伤功能。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术分选巨噬细胞，与B16细胞40：1混合，共培养，1天后，流式检测B16细胞的凋亡情况。A图为共培养后B16细胞的凋亡典型流式图；B图为B16细胞早期凋亡比例统计图；C图为共培养细胞培养上清中NO的表达情况(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图20是FATS基因缺陷促进了巨噬细胞向M1型巨噬细胞的极化，抑制了M2型巨噬细胞的极化。分离FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为M0型巨噬细胞，随后加入IFN-γ和LPS或者IL-4使M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞极化，16小时后收取细胞，流式细胞染色检测M1型和M2巨噬细胞的比例。图A为M0型巨噬细胞向M1型极化后，M1型巨噬细胞的比例的典型流式图；图B为极化后M1型巨噬细胞比例的统计图；图C为M0型巨噬细胞向M2型极化后，M2型巨噬细胞的比例的典型流式图；图D为极化后M2型巨噬细胞比例的统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图21是FATS基因缺陷促进了M1型巨噬细胞中IL-12，TNF-α和NOS2的基因表达。分离FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为M0型巨噬细胞，随后加入IFN-γ和LPS使M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，收取细胞，实时定量PCR检测M1型巨噬细胞相关因子的表达。图为M0型巨噬细胞向M1型极化后，M1型巨噬细胞中TNF-α，NOS2以及IL-12的基因表达的统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图22是FATS基因缺陷抑制了M2型巨噬细胞中Arg1，Mrc1，Retnla和CCL22的基因表达。分离FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为M0型巨噬细胞，随后加入IL-4使M0型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。收取细胞，实时定量PCR检测M2型巨噬细胞相关因子的表达。图为M0型巨噬细胞向M2型极化后，M2型巨噬细胞中Arg1，Mrc1，Retnla和CCL22的基因表达的统计图(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图23是FATS基因缺陷促进了M2型巨噬细胞凋亡。分离FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为M0型巨噬细胞，随后加入IL-4使M0型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。收取细胞，凋亡试剂盒检测两组小鼠M2型巨噬细胞凋亡情况以及免疫印迹检测凋亡相关蛋白表达。图A为M2型巨噬细胞凋亡典型流式图；图B为M2型巨噬细胞早期凋亡的比例统计图；C图为M2型巨噬细胞凋亡信号Cleaved-caspase3和Bcl2的表达水平(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

图24是FATS基因缺陷激活了巨噬细胞NF-κB信号通路。分离FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为M0型巨噬细胞。以上方法所得的两组小鼠的巨噬细胞用LPS刺激后提取蛋白，免疫印迹技术检测细胞内NF-κB信号通路。图A为骨髓定向分化的M0型巨噬细胞p65的表达情况；图B为骨髓M0型巨噬细胞IκBα信号的表达情况。

图25是FATS基因缺陷的骨髓来源巨噬细胞过继治疗能明显抑制肿瘤生长。选取10只C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，体重18-20g，皮下注射B16细胞，2×10⁵/只，构建小鼠皮下黑色素瘤移植瘤模型，随机将小鼠分成两组，每组5只。分别在小鼠荷瘤第2天和第7天，将野生型小鼠和FATS基因敲除小鼠骨髓来源的定向分化为M0型的巨噬细胞(LPS刺激12小时)过继输注到小鼠体内，连续监测小鼠肿瘤大小。荷瘤16天后，将处死小鼠，分离肿瘤组织，称量肿瘤重量并拍照。图A为过继输注野生型以及FATS基因缺陷小鼠骨髓来源巨噬细胞后，小鼠黑色素瘤的生长曲线；图B为过继输注野生型以及FATS基因缺陷小鼠骨髓来源巨噬细胞后，小鼠黑色素瘤肿瘤的典型代表结果；图C为过继输注野生型以及FATS基因缺陷小鼠骨髓来源巨噬细胞后小鼠肿瘤的最终重量(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。图26是过继输注FATS-siRNA转染的骨髓来源的巨噬细胞能明显抑制肿瘤的生长。分离野生型小鼠骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为M0型巨噬细胞，随后分别转染FATS-siRNA和NC-siRNA，24小时后，加入LPS(1μg/ml)12h刺激巨噬细胞，收集细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，尾静脉注射到小鼠体内，每只小鼠注射100μl。分别在荷瘤第2天和第7天进行两次过继治疗，连续监测小鼠肿瘤生长情况。图A为转染FATS/NC-siRNA>

具体实施方式

下面通过结合具体实施例对本发明创造进行进一步说明。

本说明书和权利要求书中使用的下列术语，除非另外说明具有下述一般含义，且下述含义被认为在本领域技术人员的知识范围之内：

“保守”指所涉及的氨基酸序列或核酸序列与原始序列具有较高的相似性或同一性，能够维持其原始序列基本的结构、生物学活性或功能，一般可以通过相似的氨基酸残基替换或等位基因(简并密码子)替换等获得。

“变体”指具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或核酸序列，所述改变可包括氨基酸序列或核酸序列中氨基酸或核苷酸的插入、缺失或替换。变体可具有保守性改变，其中替换的氨基酸与原氨基酸具有相似的结构或化学性质，如亮氨酸和异亮氨酸之间的替换，也可具有非保守性改变。

“同源”包括完全同源和部分同源，在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指具有相同或相似的结构或功能，或具有相似的氨基酸序列；在描述核酸序列时，指具有相似性或互补的核酸序列，也包括根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的核酸序列；“同源”在本发明具有相对较为广泛的含义，例如，包括具有一定百分比的相同性的序列(氨基酸序列或核酸序列)，或包括序列的变体。

“衍生物”在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指由原多肽、蛋白质或氨基酸序列衍生而来的关联多肽、蛋白质或氨基酸序列，其具有与原始多肽、蛋白质或氨基酸序列相似的性质、活性或功能，例如，本发明中多肽、蛋白质或氨基酸序列包括这样的衍生物：(i)成熟多肽与另一种化合物融合，或者(ii)在氨基酸序列中融合或插入附加的氨基酸序列(linker、蛋白质纯化标识序列、酶切位点等)；等；在描述核酸序列时，指由原始序列衍生未来的关联序列，其具有与原始核酸序列相似的性质、活性或功能，可以包括：(i)序列或基因中连续或间隔地插入、缺失、替换一个或多个碱基(优选为等位基因的替换)，且所述一个或多个氨基酸残基的插入、缺失、替换在同一序列或基因中可同时或不同时存在；(ii)序列或基因中一个或多个碱基被修饰；(iii)序列或基因中融合或插入编码附加的氨基酸序列的基因；等。

“抑制剂”包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。

“下调”指降低FATS基因或其表达产物的活性、降低FATS基因或其表达产物的稳定性、降低FATS基因表达产物的表达、减少FATS基因或其表达产物的有效作用时间、抑制FATS基因的转录和/或翻译等。

“干扰分子”是指能够下调FATS基因或其表达产物的物质的总称，包括所述的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸等。

根据特定的靶序列来设计干扰分子是本领域技术人员已知且能够实现的。这些干扰分子也可以通过本领域已知的多种手段(例如采用适当的试剂)被输送到体内，从而发挥其下调FATS基因或其表达产物的作用。

在通过本文得知了FATS基因或其表达产物与黑色素瘤之间的相关性后，可以基于该特征来筛选能够作用于、尤其是能够下调FATS基因或其表达产物的功能产品，所用的筛选方法也也可以通过本领域已知的多种手段得到实现。

下面通过具体实验及分析和讨论详细阐述FATS基因或其表达产物与黑色素瘤之间的相关性。

一、FATS基因缺陷对小鼠黑色素瘤以及肿瘤免疫微环境的调节作用

1.1对象和方法

1.1.1主要材料、试剂与仪器设备

1.1.1.1主要试剂

1.1.1.2细胞系

B16细胞

1.1.1.3抗体

1.1.1.4引物序列

上游引物下游引物TNF-αGAGGCCAAGCCCTGGTATGCGGGCCGATTGATCTCAGCNOS2GTTCTCAGCCCAACAATACAAGAGTGGACGGGTCGATGTCACIL-12ACAAAGGAGGCGAGGTTCTAACCCTTGGGGGTCAGAAGAGIL-1βGAAATGCCACCTTTTGACAGTGTGGATGCTCTCATCAGGACAGArg1CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAGGGAGCTGTCATTAGGGACATCACCL22CTCTGCCATCACGTTTAGTGAAGACGGTTATCAAAACAACGCCMrc1CTCTGTTCAGCTATTGGACGCTGGCACTCCCAAACATAATTTGARetnlaCCAATCCAGCTAACTATCCCTCCACCCAGTAGCAGTCATCCCATGF-βCCACCTGCAAGACCATCGACCTGGCGAGCCTTAGTTTGGACGAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGGGGTCGTTGATGGCAACA

1.1.1.5主要仪器

1.1.2试剂配制

1.1.2.1 0.01M PBS：

分别称取Na₂HPO₄(1.54g)，KH₂PO₄(0.2g)，NaCl(8.0g)，KCl(0.2g)，加入到超纯水中，充分溶解，定容至100ml，调节PH值(7.2-7.4)。高压灭菌，于4℃冰箱保存备用。

1.1.2.2流式染色缓冲液(SB，Stainning Buffer)

1)SB的组成成分为2％FBS，0.1％NaN₃，1倍PBS；

2)将10ml FBS和5ml浓度为10％的NaN₃加入到500ml的PBS中，充分混匀，于4℃冰箱保存备用。

1.1.2.3抗体稀释液：

1)抗体稀释液的组成成分为0.2％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％叠氮钠(NaN₃)以及1倍PBS；

2)将称取的0.2mg BSA和吸取的1ml 10％的NaN₃加入到100ml的PBS中，搅拌，使其完全溶解，于4℃冰箱保存备用。

1.1.2.4 4％多聚甲醛：

1)称取2g多聚甲醛加入到45ml超纯水中，加入1mol/L的NaOH；

2)56℃过夜使其完全溶解；

3)冷却至室温后，加入5ml 10×PBS

4)加入1mol/L的CaCl₂和MgCl₂各50ul；

5)将PH值调至7.3，4℃避光保存。

1.1.2.5流式细胞染色封闭液

1)封闭液的组成成分为BSA和大鼠血清；

2)取800ul的10％BSA加入200ul的大鼠血清，混合均匀，4℃避光保存。

1.1.2.6细胞分选用的缓冲液(0.5％BSA/PBS)：

1)分选用缓冲液组成成分为BSA和1倍PBS

2)配制10％BSA，用1倍PBS稀释20倍，4℃保存备用。

1.1.2.7抗原热修复液：

1)修复液组成成分为柠檬酸钠和柠檬酸；

2)取柠檬酸钠41ml，柠檬酸9ml，加至450ml超纯水中，混匀，常温保存备用。

1.1.3实验方法

1.1.3.1 B16细胞复苏、传代和冻存

1.1.3.1.1细胞复苏：

1)细胞复苏前，细胞房内以及细胞房超净工作台内需紫外照射15-20min；

2)从液氮中取出来需要复苏的细胞，立即放入37℃水浴锅中，不断晃动冻存管1min内使细胞液快速溶解；

3)装有细胞的冻存管在放入超净工作台前，需酒精仔细擦拭，在超净台中打开冻存管，将其中的1ml细胞悬液吸到干净无菌的15ml离心管中，加入加有胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(DMEM+20％FBS)，800rpm离心，5min；由于刚复苏的细胞相对脆弱，所以适当的降低离心时的转速；

4)倒掉上清液，用1ml加有20％FBS的DMEM培养基吹打离心管中沉淀的细胞，使细胞悬浮起来，提前在10cm²培养皿中加入9ml加有20％FBS的DMEM培养基，吸取细胞悬液到培养皿中，前后左右轻轻摇动，使细胞在培养皿中分布均匀；

5)在培养皿上标注好所培养细胞的种类，复苏日期以及培养人姓名，放入CO₂细胞培养箱中培养；

6)24小时内更换新鲜的完全培养基。

1.1.3.1.2细胞传代

1)当B16(B16细胞为贴壁细胞)在培养皿中的汇合度达到了80％-90％时，即可进行细胞传代；

2)用5ml枪吸出培养皿中的培养上清，随后将无菌的1倍的PBS 2-3ml轻轻的加入培养皿中，前后左右轻轻摇动，随后弃掉所加入的PBS，吸取胰蛋白酶1ml，加入培养皿中进行细胞消化，前后左右摇动，将培养皿放回细胞培养箱，1min后取出，加入2-3ml加有10％FBS的DMEM培养基终止消化；用1ml枪将培养皿中的细胞吹打下来，全部细胞悬液吸入到15ml无菌的离心管中，1000rpm，离心，5min；

3)弃掉上清液，加1ml加有10％FBS的DMEM培养基，用1ml枪吹打，使沉淀的细胞完全悬浮起来，根据实验要求，将细胞传到提前加入加有10％FBS的DMEM培养基的培养皿中，前后左右轻轻摇动，使细胞在培养皿中分布均匀；

4)在培养皿上标注好培养细胞的种类，传代日期以及培养人姓名，放入CO₂细胞培养箱中培养。

1.1.3.1.3细胞冻存

1)配制冻存液：90％的FBS+10％的DMSO；

2)收集细胞并进行离心(与传代步骤相同)；

3)将配制好的冻存液(0.5ml)提前加入到冻存管中，用加有10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，吸取0.5ml细胞悬液加入到冻存管中，使DMSO的终浓度保持在5％；

4)在冻存管写明细胞种类与冻存日期；

5)将冻存管放入室温保存的盛有异丙醇的冻存盒中，随后将冻存盒放在-80℃超低温冰箱中过夜，冻存管可于第二天取出，放入液氮中进行长期保存，冻存盒中异丙醇的使用次数不能超过5次，5次使用后需更换新的异丙醇。

1.1.3.2小鼠黑色素瘤模型构建

1.1.3.2.1实验动物

1)FATS基因缺陷小鼠(品系为C57BL/6)由天津肿瘤医院李政教授提供，饲养与天津医科大学实验动物中心，小鼠房等级为SPF级别，饲养环境保持温度为20-25℃，相对湿度40％-60％；FATS基因缺陷小鼠被敲掉的FATS基因序列如SEQ ID NO：1所示；

2)野生型小鼠为C57BL/6无特殊病原体(SPF级)小鼠，8周龄，体重为20g左右，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠饲养于天津医科大学实验动物中心，小鼠房等级为SPF级别，饲养环境保持温度为20-25℃，相对湿度40％-60％。

1.1.3.2.2异位小鼠黑色素瘤模型构建

1)将B16细胞培养于10cm²培养皿中，用加有10％FBS，1％双抗的DMEM培养基培养，培养至对数生长期；

2)收集细胞并进行离心(与传代步骤相同)；

3)弃掉上清液，细胞沉淀用1倍的PBS吹打，1000rpm，离心，5min，弃上清，随后再重复1次；

4)收集到的B16细胞用1倍的PBS重悬，计数，调整细胞浓度至2×10⁶/ml；

5)提前半天时间，用脱毛膏将小鼠右后背部的毛脱去，注射细胞悬液前用75％酒精对小鼠注射部位进行消毒；

6)在每只小鼠的右后背部，注射100μl 2×10⁶/ml的B16细胞(共31只)，即每只小鼠注射B16细胞的数量为2×10⁵/只，进针后或出针前，可稍微改变针头的方向，注射时动作轻缓，出针后轻按针孔片刻，可避免细胞悬液漏出；

7)每天对小鼠的肿瘤生长情况进行观察，并用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长度与宽度，做好记录；

8)荷瘤后20天，麻醉后脱颈处死小鼠，分离小鼠的脾脏与肿瘤，肿瘤组织，照相，称重，并测量其长度与宽度，计算肿瘤的终体积；

9)小鼠的肿瘤体积计算公式为(长×宽²)/2(mm³)

1.1.3.3脾脏以及肿瘤组织单个核细胞的分离

1.1.3.3.1脾脏单个核细胞的分离

1)准备：一次性细胞筛网，1ml注射器，培养皿，平头剪刀，镊子，75％酒精，10倍PBS，1倍PBS，超纯水，无血清1640培养基，加10％FBS，1％双抗的1640培养基；

2)在培养皿中加入4ml无血清1640培养基；

3)取小鼠脾脏组织，放入超净工作台，置于一次性细胞筛网中(浸泡于75％酒精中的器械使用时需用1倍的PBS冲洗，以免杀伤细胞，筛网不可用手触摸网面)，用平头剪刀剪碎脾组织；

4)取1ml注射器的针芯(不可用手触摸针芯顶部，用镊子抽出后再用手拿住中间部分抽出)，将针芯头部轻沾皿中培养基后，研磨筛网中的脾脏组织；

5)研磨完全后，弃掉针芯，用1ml枪吸取皿中1640培养基冲洗筛网，使细胞流入培养皿中，再吸取干净的无血清1640培养基2ml冲洗筛网1次；

6)将培养皿中的细胞悬液转移至15ml无菌离心管中，1300rpm，离心，5min；

7)裂解红细胞：弃上清，涡旋沉淀的细胞，可使细胞松散便于裂解，用900μl的超纯水重悬细胞，然后迅速加入10倍的PBS 100μl，混合后会出现裂解的红细胞团块，将团块挑出，加入无血清1640培养基至5-7ml，1300rpm，离心，5min(视沉淀细胞的多少可成比例加大纯水和PBS的量)；

8)弃上清，用加有10％FBS，1％双抗的1640培养基重悬细胞，培养，备用。

1.1.3.3.2肿瘤组织单个核细胞的分离

1)准备：小鼠单个核细胞分离液，肿瘤消化酶，一次性细胞筛网，1ml注射器，培养皿，平头剪刀，镊子，75％酒精，1倍PBS，加10％FBS，1％双抗的1640培养基；

2)剥离小鼠肿瘤组织，尽量不要破坏肿瘤组织，随后将肿瘤组织置于无菌培养皿中，放于超净工作台，用平头剪剪碎组织至直径约1mm的小块，加入0.05mg/ml肿瘤消化酶(0.05mg/ml的胶原酶IV+0.05mg/ml的透明质酸酶+0.05mg/ml的DNA酶Ⅰ)20ml左右，37℃消化1小时左右；

3)肿瘤组织消化后转移至一次性细胞筛中，用无菌的1ml注射器针芯的头部对其进行研磨，期间加入1倍PBS过滤研磨液，收集滤液至15ml无菌离心管中，1500rpm，离心，5min，重复2次；

4)弃上清，加入4ml 1倍PBS重悬，随后加入等体积的小鼠淋巴细胞分离液，室温离心，提速挡和刹车挡均设为0,2000rpm，室温离心，20min，平稳取出离心管；

5)用5ml枪吸出白膜层上方的液体，仅留取至白膜层上方0.5ml处。用200μl枪吸出离心管中的白膜层，置于干净的无菌15ml离心管中，加入3倍体积的1倍PBS，离心5min，3次，转速分别为2000rpm，1800rpm和1500rpm；

6)弃上清，加入含有10％FBS，1％双抗的1640培养基重悬细胞，培养，备用。

1.1.3.4流式细胞术检测免疫细胞亚群：

1)收取需要检测的细胞，1500rpm，离心，5min；

2)弃上清(弃上清时将流式管在干净的滤纸或卫生纸上轻沾，以免过多的上清液流回)，加入1ml 1倍的PBS，重悬细胞，1500rpm，离心，5min；

3)弃上清，分出空白管，单染管以及同型对照检测管，与检测管一起，加入1倍PBS，使每管内液体量大约在100μl左右；

4)封闭：每管加入25μl的流式抗体封闭液，4℃避光，30min；

5)表面染色：每管按照实验设计分别加入大鼠抗小鼠荧光标记抗体，并按照实验要求，在同型对照管中加入配套的同型抗体，去除检测时的假阳性：

①总T细胞：CD3-PE

②细胞毒性T淋巴细胞(CTL)：CD3-PE/CD8a-APC

③γδT细胞：CD3-PE/γδ-APC

④自然杀伤T细胞(NKT)：CD3-PE/NK1.1

⑤髓系抑制细胞(MDSC):CD11b-FITC/Ly6C-PE/Ly6G-PeCy 7

⑥M1型巨噬细胞：CD11b-FITC/MHC-II-PE/F4/80-APC

CD11b-FITC/CD11c-PE/F4/80-APC

⑦M2型巨噬细胞：CD206-FITC/CD11b-PE/F4/80-APC

⑧活化的细胞毒性T淋巴细胞：CD3-FITC/CD44-PE/CD8-APC

⑨活化的1型辅助性T细胞：CD3-FITC/CD44-PE/CD4-APC

6)4℃避光，30min；

7)每管加入1ml的PBS重悬，1500rpm，离心，5min，洗涤2次；

8)弃上清，每管加入4％多聚甲醛或者固定缓冲液50-100μl固定；

9)流式细胞仪上机检测(可短时间保存于4℃)。

1.1.3.5流式细胞仪检测Treg细胞：

1)收取脾脏或肿瘤细胞(不需要刺激，细胞直接用于流式检测)，分出空白管，单染管，同型检测管以及实验管，表面染色：CD25-FITC/CD3-Pe-Cy 7/CD4-APC

2)4℃避光孵育30min；

3)每管加入1ml染色缓冲液SB，1500rpm离心5min，2次(由于胞内染色破膜会对细胞产生损伤所以要用在PBS加入FBS的SB对细胞加以保护)；

4)弃上清，加入250μl/管Foxp3Cytofix/Cytoperm缓冲液(事先按说明说稀释)，4℃避光透膜，15-20min；

5)每管加入1-2ml的Permeabilization wash缓冲液(商品化为10倍，使用前用超纯水稀释为1倍)，1800rpm，离心，7min，由于透膜后细胞体积变大，容易丢失，所以增加了细胞离心的转速与时间；

6)封闭：每管加入25μl封闭液，4℃避光，30min；

7)加入大鼠抗小鼠荧光抗体Foxp3-PE，并按照说明书在同型管中加入配套的同型抗体，室温避光30min；

8)每管加入1-2ml的Permeabilization wash缓冲液，1800rpm，离心，7min；

9)弃上清，每管加入1ml的SB，1800rpm，离心，7min；

10)每管加入4％多聚甲醛或者固定缓冲液50-100μl固定；

11)流式细胞仪上机检测(可短时间内保存于4℃)。

1.1.3.6流式细胞仪检测细胞毒性T淋巴细胞胞内因子：

1)需要检测的细胞加入三联刺激剂(包括PMA，钙离子霉素和BFA)，置于CO₂细胞培养箱中，刺激4-5小时，收取细胞，1500rpm，离心，5min，弃上清；

2)加入1ml 1倍的PBS，重悬细胞，1500rpm离心，5min；

3)分出空白管，单染管，同型检测管以及实验管，表面染色：

①细胞毒性T淋巴细胞：CD3-FITC/CD8a-APC

②1型辅助性T细胞：CD3-FITC/CD4-APC

4)4℃避光孵育，30min；

5)每管加入1ml染色缓冲液SB，1500rpm离心，5min，2次，弃上清；

6)每管加入250μl/管4％PFA或者固定缓冲液，4℃避光30min或者过夜，固定；

7)离心弃上清，每管加入1ml 1倍的Permeabilization wash缓冲液，1800rpm，离心，7min；

7)弃上清，加入250μl/管1倍的Permeabilization wash缓冲液，4℃避光透膜，15-20min；

8)每管加入1ml的Permeabilization wash缓冲液，1800rpm，离心，7min，弃上清；

9)封闭：每管加入25μl封闭液，4℃避光30min；

10)加入大鼠抗小鼠荧光抗体IFN-γ-PE，并按照说明书在同型管中加入配套的同型抗体，4℃避光，30min；

11)每管加入1-2ml的Permeabilization wash缓冲液，1800rpm，离心，7min；

12)弃上清，每管加入1ml的SB，1800rpm，离心，7min；

13)每管加入4％多聚甲醛或者固定缓冲液50-100μl固定；

14)流式细胞仪上机检测(可短时间保存于4℃)。

1.1.3.7细胞RNA提取

1)将冻存于-80℃冰箱的加有Trizol的细胞取出，室温融化，涡旋15s混合均匀，室温静置，10min；

2)每管中加入200μl氯仿，涡旋后在冰上静置5min(室温亦可以)；

3)4℃，12000rpm，离心，15min，小心取上清，移至新的无RNA酶的1.5ml EP管中(注意不要碰到中间层，用200μl的枪轻吸)；

4)加入与上清同等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，在冰上静置，10min；

5)4℃，12000rpm，离心，10min，弃上清，加入无水乙醇1ml，上下颠倒混匀，4℃，12000rpm，离心，5min，弃上清，用10μl的枪吸出残余液体，室温晾干，约5-10min；

6)根据管底沉淀量，加入无RNA酶水，溶解RNA，可长期保存于-80℃；

7)提取的RNA检测：琼脂糖凝胶(1％)电泳，180V，10分钟；

8)Nanodrop检测RNA浓度，以便后续实验。

1.1.3.8 RNA反转成cDNA

1)反转录使用试剂盒，M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen^TM,by>TM)；

2)主要反转步骤为：测量所提RNA的浓度(Nanodrop)，用以计算反转用量；RNA样品上样量一般为2μg，加入随机引物1μl，dNTP 1μl，无RNA酶水补充至13μl；65℃，5min；取出，加入4μl的5倍First缓冲液，2μl的DTT；37℃，2min；取出，冰上加入MLV酶1μl；25℃，10min；37℃，50min；70℃，15min；cDNA放置在-20℃保存。

1.1.3.9实时定量PCR

1)20μl体系包括：10μl的qPCR mastermix，正反定量引物各0.5μl(10μM)，cDNA 1μl，ROX 0.4μl，超纯水7.6μl；

2)ABI 7500Fast进行实时定量PCR检测。

1.1.3.10组织切片，H&E染色：

1.1.3.10.1石蜡包埋，切片：

1)去黑色素瘤小鼠肿瘤组织，简称直径5mm左右小块；

2)将肿瘤组织放置于包埋盒中，浸泡在4％多聚甲醛中过夜固定；

3)组织脱水：从甲醛中取出包埋盒，流水冲洗30min；随后浸泡于75％酒精，30min；85％酒精，30min；95％酒精，过夜；无水酒精1h 30min；

4)组织透明：常温将包埋盒浸泡于二甲苯中，35min；

5)组织浸蜡：浸蜡温度60℃，将包埋盒浸泡于蜡缸Ⅰ中1-2h，随后换至蜡缸II中，继续浸蜡1h；

6)组织包埋：打开包埋盒，将组织取出，放入预热好的模具中(模具内事先放入少量溶蜡)，包埋盒的盖子放在模具上方，继续添加石蜡，直至包埋盒的盖子也完全浸没于石蜡中；

7)组织冷却：将模具放置4℃冷却，等石蜡完全凝固后，取出模具中包埋好的组织，常温保存；

8)石蜡切片：使用石蜡包埋组织切片机，将肿瘤组织切片，厚度为5μm，随后将切好的蜡片放入45℃的温水中，使其自然展开，展开后用玻璃载玻片将蜡片捞起，轻轻甩掉载玻片上的水，65℃烤片，3-4h，常温保存。

1.1.3.10.2 H&E染色

1)切片脱蜡：石蜡切片放置于二甲苯中1h；

2)切片水化：将切片从二甲苯中取出，放入无水酒精中，2min；95％酒精，2min；85％酒精，2min；75％酒精，2min；蒸馏水冲洗1min；

3)切片染色：将切片放入苏木精中，染色10min；自来水冲洗；0.5％伊红染色1min；自来水冲洗2-5min；蒸馏水冲洗1-3s；镜检染色效果，如不理想可重复染色；

4)切片脱水：将染好的切片放置在75％酒精中，10-30s；85％酒精，10-30s；95％酒精，30s-1min；无水酒精，2-3min；镜检；

5)透明封藏：将脱水后的切片放置入二甲苯中，15min，取出，在二甲苯湿润状态下，滴树胶，加盖玻片(注意不要有气泡)；室温晾干，照相，可长期室温保存。

1.1.3.11组织切片免疫荧光染色：

1)组织包埋切片见1.1.3.10.1；

2)切片脱蜡水化见1.1.3.10.2；

3)在切片上滴加1-2滴的过氧化氢(3％)，室温孵育10min，用于降低内源性过氧化物酶；

4)PBS洗片3次，3min/次；

5)抗原热修复：切片放入预热的抗原修复液中，微波炉高火模式5min，随后解冻模式15min，室温冷却；

6)封闭：封闭用1％的BSA，37℃，30min，倾去血清，勿洗；

7)滴加CD206-FITC/CD31-PE(抗体1：50稀释)，4℃避光，过夜；

8)PBS漂洗3次，5min/次；

9)滴加DAPI；

10)滴加PBS，加盖玻片封片，照相。

1.1.3.12多细胞因子ELISA检测：

黑色素瘤小鼠血清中的IFN-γ，TNF-α，IL-1β，IL-10，NO，IL-2以及IL-12由Bio-Plex细胞因子检测系统进行检测。

1.1.3.13肿瘤组织巨噬细胞分选

1)分离小鼠肿瘤单个核细胞(过程见1.1.3.3.2)；

2)细胞悬液中加入大鼠抗小鼠荧光标记抗体，F4/80–FITC，避光，30min；

3)加入1倍的PBS 1ml，1500rpm，离心，5min；

4)根据细胞数量，用分选缓冲液重悬细胞；

3)ArisIII流式细胞仪对标记了F4/80-FITC的细胞进行分选；

4)分选出的细胞用1倍的PBS洗，1500rpm，5min，加入Trizol混匀，-80℃保存，备用。

1.1.4数据处理与统计分析

本研究全部数据都来自至少三次独立的实验，实验数据均用means±SD表示，均输入Excel建立数据库，分析采用采用spss13.0统计软件。组内比较采用概率计算应用Student’s unpaired t-test,以p<0.05表示差异有统计学意义(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。统计图均由GraphPad Prism Version 5.0(GraphPad Software Inc，San Diego CA)完成。流式数据采用FlowJo 7.6.1software(Tree Star，Inc，USA)进行分析。

1.2结果

1.2.1 FATS基因缺陷后抑制了B16细胞皮下荷瘤小鼠黑色素瘤的发生发展

我们利用黑色素瘤细胞系，B16细胞对C57小鼠进行皮下荷瘤，构建小鼠黑色素瘤模型，来探究FATS基因在黑色素瘤中的作用。

异位小鼠黑色素瘤模型：2×10⁵个B16细胞皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右后背部，包括野生型小鼠(WT)(n＝16)和FATS基因缺陷小鼠(KO)(n＝15)，每日对小鼠进行观察记录出瘤情况并测量肿瘤大小至荷瘤第20天。结果显示，FATS基因缺陷的小鼠相较野生型小鼠，黑色素瘤成瘤率明显降低(图1D，E，P<0.01)，同时肿瘤的生长速度缓慢，野生型小鼠最终所成的黑色素瘤体积显著的大于FATS基因缺陷小鼠的黑色素瘤体积(图1A，B，P<0.01)。相一致的，FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤的最终重量相较野生型小鼠的肿瘤重量也表现出明显的减少(图1C，P<0.01)。这些结果表明，FATS基因缺陷显著的抑制了B16细胞小鼠皮下荷瘤所成的黑色素瘤的发生和发展。

1.2.2 FATS基因缺陷后增加了小鼠黑色素瘤组织中的炎性细胞的浸润

基于以上所得结果，FATS基因缺陷明显抑制了黑色素瘤的生长，我们猜测，FATS基因缺陷也许会影响黑色素瘤的肿瘤微环境。因此，我们进一步对野生型小鼠以及FATS基因缺陷小鼠的肿瘤组织进行了H&E染色，来检测两组小鼠肿瘤组织中对肿瘤生长具有抑制作用的炎性细胞的浸润情况。染色如图2所示，与预期结果相一致，FATS基因缺陷后，B16荷瘤小鼠的黑色素瘤中，肿瘤内部以及肿瘤边缘炎性细胞浸润都明显的增加了。这一结果说明，FATS基因缺陷确实增加了小鼠黑色素瘤中炎性细胞的浸润。

1.2.3黑色素瘤小鼠外周免疫器官中，FATS基因缺陷后影响了免疫细胞的比例

以上结果表明，FATS基因缺陷后抑制了小鼠黑色素瘤的发生发展可能是通过影响肿瘤相关的免疫细胞来实现的，为了验证这一猜想，我们进一步检测了两组黑色素瘤小鼠的外周以及肿瘤组织中的免疫细胞。首先是对黑色素瘤小鼠的外周免疫器官，脾脏进行了检测。B16荷瘤20天后，处死小鼠，分离小鼠脾脏细胞，流式细胞术分析脾脏细胞中的多种免疫细胞的情况。结果如图3A-D所示，FATS基因缺陷小鼠相较野生型小鼠，外周免疫器官中总的T细胞(CD3⁺T细胞)以及γδT细胞(γδ⁺/CD3⁺)的数量明显的增加。虽然自然杀伤(NK)细胞(NK1.1⁺)的数量没有明显的差别(图4A，B)，但是检测NK细胞的活化(NK1.1⁺/CD44⁺)程度(平均荧光强度，MFI)发现，NK细胞活化在FATS基因缺陷小鼠中明显增加(图4C)(CD44阳性是T细胞和NK细胞活化的标志)。除此之外，在抗肿瘤过程中起主要作用的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的比例在FATS缺陷小鼠的脾脏中明显的增加(图5A，B)，并且其活化水平(CD44)显著增加，横型框代表CD44高表达的CTL比例，在FATS基因缺陷小鼠中显著的多于野生型小鼠(图5C，D)。我们也发现，IFN-γ作为细胞杀伤的重要的效应因子，在FATS基因缺陷小鼠脾脏中的CTL细胞中表达增加，同时Th1(CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺)细胞的比例在FATS缺陷小鼠脾脏中也有所增加(图6A，B)。这些结果提示，在黑色素瘤小鼠的外周免疫器官中，FATS基因缺陷后增加了抗肿瘤免疫。

进一步检测脾脏中对肿瘤生长具有促进作用的免疫细胞，调节性T细胞(Treg，CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp⁺)以及髓系抑制细胞(MDSC，CD11b⁺Ly6C⁺Ly6G⁺)，流式结果发现，虽然MDSC的比例没有明显的差别(图7C)，但是Treg的比例在FATS缺陷后有了显著的下降(图7A，B)。这说明FATS基因缺陷对抑制性肿瘤免疫有着抑制作用。

1.2.4黑色素瘤小鼠血清中，FATS基因缺陷增加了促进肿瘤杀伤相关的细胞因子

研究表明，IL-2可以有效的刺激效应T细胞和NK细胞的增殖，是T细胞增殖重要的细胞因子，也是一个重要的生长因子，参与着抗原激活的淋巴细胞的增殖以及免疫记忆的产生。同时，IL-12的产生可以促进T细胞的增殖和NK细胞的活化，诱导Th1细胞极化以及CTL的产生，还可以抑制血管生成。IL-12可由M1型巨噬细胞产生，M1型巨噬细胞也可以分泌IL-1β和TNF-α介导肿瘤细胞的溶解。亦有研究报道，IFN-γ产生的增加可以促进M1型巨噬细胞，也可以抑制血管生成并促进抗肿瘤免疫监视。而抑制免疫的细胞因子(例如IL-10)可由免疫抑制细胞(M2型巨噬，Treg等)产生，对肿瘤起到促进的作用。基于诸多已有的研究，为了深入探究FATS基因在小鼠黑色素瘤中的作用，我们对B16皮下荷瘤的野生型以及FATS基因缺陷小鼠的血清进行了多细胞因子ELISA检测，结果如图8所示，IL-2，IL-12在FATS基因缺陷的黑色素瘤小鼠血清中明显升高，这与FATS基因缺陷后小鼠T细胞比例增加相一致。除此，IL-1β，TNF-α以及IFN-γ也明显增加，进一步的，参与促肿瘤的免疫抑制因子IL-10在FATS基因缺陷小鼠血清中显著减少。这些结果表明，FATS基因缺陷可能影响了黑色素瘤小鼠的免疫细胞的比例和功能，从而对黑色素瘤的发生发展产生了抑制作用，这与我们已得的实验结果相一致。

1.2.5 FATS基因缺陷显著影响了黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中的免疫细胞

以上的研究结果表明，FATS基因可能在免疫调节中具有重要的作用，从而影响了肿瘤的发生发展过程。我们知道，除去外周免疫器官，在肿瘤的发生发展中，起到更为关键作用的，是肿瘤的免疫微环境。目前已知，肿瘤微环境中的免疫细胞可以影响肿瘤的发生，发展，侵袭与最终的结果。免疫细胞从外周迁移进入肿瘤组织，在肿瘤环境中亦会产生一些变化。肿瘤不仅可以通过多种机制逃避免疫系统，还可以改变浸润在肿瘤微环境中的免疫细胞的功能来创造一个有利于肿瘤生长的环境，例如巨噬细胞，在肿瘤环境中可被极化转变为M2型巨噬细胞，丧失杀伤能力(M1型巨噬细胞)，产生免疫抑制作用(对肿瘤杀伤的效应细胞产生抑制)，促进肿瘤的生长。相反的，肿瘤环境中具有抗肿瘤的效应T细胞(例如CTL，Th1)可与具有抗原呈递功能的细胞(例如M1型巨噬细胞)相互作用，导致进一步的增值与活化，同时也反过来促进M1型巨噬细胞，产生抗肿瘤免疫。因此，为了深入全面的探究FATS基因在小鼠黑色素瘤中的作用，我们进一步检测了野生型小鼠和FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤肿瘤微环境中的免疫细胞变化。

B16细胞皮下荷瘤20天后，取两组小鼠的肿瘤组织，分离出单个核细胞，流式细胞术检测多种免疫细胞在FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠黑色素瘤的肿瘤微环境中的情况。

首先，我们对具有肿瘤抑制作用的免疫细胞，CTL，NKT以及γδT细胞的比例变化进行了分析，结果如图9-10所示：与野生型小鼠相比，FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤肿瘤微环境中的总的T细胞(图9A，B)，具有肿瘤杀伤功能的CTL(图9C，D)显著增加，同时，NK(图10A，B)以及γδT(图10C，D)细胞比例也显著的增加，且相较脾脏免疫细胞比例的增加更为明显，除此，NK T细胞的比例(图10右上格)在FATS基因缺陷小鼠中也有了增加。由此可知，FATS基因缺陷增强了黑色素瘤小鼠肿瘤免疫微环境中的肿瘤免疫杀伤。

T细胞的活化在肿瘤过程中至关重要，活化的CTL细胞具有强大的直接肿瘤细胞杀伤能力。我们以上的结果发现，在肿瘤环境中，CTL细胞的比例明显的增加，在分析外周脾脏时我们已经发现，CTL的比例和活化程度都在FATS基因缺陷后有了增加，那么，随后我们思考，CTL的活化是否也在FATS基因缺陷后增强？于是，我们利用CD44染色分析了CTL细胞在肿瘤微环境中的活化程度。结果表明，在黑色素瘤肿瘤微环境中，FATS缺陷小鼠的CTL活化程度明显增加，横型框代表CD44高表达的CTL比例，在FATS基因缺陷小鼠中，CD44基本全部表现出高的表达程度，这说明FATS基因缺陷后极大的活化了CTL细胞(图11A，B)。这一结果证明，FATS基因缺陷使得CTL的活化增强，这与FATS基因缺陷的小鼠所表现出的肿瘤抑制作用相一致。亦有实验研究证明，IFN-γ作为细胞杀伤的重要的效应因子参与肿瘤杀伤和免疫监视，所以我们进一步的，通过检测CTL细胞中的IFN-γ的表达情况分析FATS基因缺陷小鼠与野生型小鼠肿瘤微环境中的CTL对肿瘤细胞的杀伤能力，同时也对Th1(CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺)细胞进行了检测。实验结果显示，在FATS基因缺陷小鼠肿瘤微环境中的CTL细胞表达的IFN-γ显著增加(图12A)，同时Th1(CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺)细胞的比例在FATS缺陷小鼠肿瘤微环境中也了显著增加(图12B)，且比例增高的程度明显高于脾脏中的比例。

此外，我们还分析了黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中对肿瘤生长具有促进作用的免疫细胞，Treg以及MDSC，结果如图13所示，FATS基因缺陷小鼠的黑色素瘤肿瘤微环境中的Treg细胞相较野生型小鼠显著的减少，且减少成都明显多于黑色素瘤小鼠外周免疫器官(图13A，B)，而MDSC的比例没有显著的差异(图13C)。这一结果与脾脏检测结果相一致，显示了FATS基因缺陷对于促进肿瘤的抑制性免疫具有明显的抑制作用。

肿瘤是由恶性细胞以及正常的基质细胞所组成的，微环境中包括了数量众多的巨噬细胞，这些巨噬细胞被称之为肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)。这些巨噬细胞可以通过细胞毒性，细胞溶解或者抗原呈递激活肿瘤杀伤的T细胞来抑制肿瘤的生长。然而，在大多数情况下，TAM会发生某一种改变来协助恶性的细胞生长，侵袭以及逃避凋亡。一些文献已经报道，巨噬细胞在肿瘤微环境中具有非常重要的作用，目前主要的TAM被认为是M2(CD11b⁺F4/80⁺CD206⁺)型的巨噬细胞。M2型巨噬细胞可以促进肿瘤的血管生成，侵袭和转移。它们同时也可以通过产生IL-10来促进免疫抑制。M2型巨噬细胞表达CCL22，招募Treg细胞来抑制CTL的功能。M2型巨噬细胞在维持肿瘤细胞生长，存活和转移中起着至关重要的作用。而与之功能相反的为M1(CD11b⁺F4/80⁺MHC-II⁺)型巨噬细胞，M1型巨噬细胞表达MHC-II分子，表现出吞噬以及抗原提呈的能力，产生iNOS2，IL-1β以及TNF-α等介导肿瘤细胞的细胞溶解，来发挥着细胞杀伤的功能。M1型巨噬细胞产生IL-12，促进肿瘤中T细胞的活化和增殖，抑制血管生成，同时也可以将抗原交叉提呈给CD8+T细胞。M1型巨噬细胞也可以激活Th1型应答。也就是说，M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化最终会导致肿瘤生长的促进。因此，基于巨噬细胞不同亚型在肿瘤中相反的作用，使得在肿瘤微环境中对巨噬细胞亚型的检测显得尤为重要。

我们利用流式细胞染色分析了FATS基因缺陷后黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中的巨噬细胞分型情况。结果如图14显示，FATS基因缺陷的小鼠黑色素瘤肿瘤微环境中M1巨噬细胞的比例显著的增加(图14A，B)，而M2型巨噬细胞比例则显著的减少(图14C，D)。此外，我们用CD206-FITC(CD206为M2型巨噬细胞的重要表面标记)对肿瘤组织切片进行了免疫荧光染色，发现野生型小鼠肿瘤中的CD206显著多于FATS基因缺陷小鼠(图14E)。由此，我们的结果表明，在黑色素瘤肿瘤微环境中，FATS基因缺陷后，具有抑制肿瘤功能的M1型巨噬细胞比例显著升高，而具有促瘤作用的M2型巨噬细胞的比例显著下降，这些结果与FATS基因缺陷小鼠肿瘤生长受抑制的现象相一致。

为了进一步的验证以上所得到的，关于巨噬细胞亚型在肿瘤微环境中显著变化的结果，我们流式分选了肿瘤组织中的巨噬细胞(F4/80阳性)，提取RNA，利用实时定量PCR，检测了M1型和M2型巨噬细胞所表达的重要基因的表达情况，同时也对M1型巨噬细胞极化重要的细胞因子的基因表达进行了检测。结果如图15所示，M1型巨噬细胞所表达基因，IL-12，TNFα和NOS2的基因表达在FATS基因缺陷小鼠的巨噬细胞中增加(图15A)，而M2型巨噬细胞表达基因IL-10，Agr1，Mrc1(CD206)以及CCL22降低(图15B)。除此，我们还发现，FATS基因缺陷小鼠肿瘤组织中巨噬细胞表达VEGF的量明显下降。这些结果都进一步证明，FATS基因缺陷的小鼠巨噬细胞更倾向于分化为具有抑制血管生成，促进肿瘤杀伤的M1型巨噬细胞，并且FATS基因缺陷显著抑制了促进血管生成，促进肿瘤生长的M2型巨噬细胞的转化。

1.2.6 FATS基因缺陷抑制了小鼠肿瘤组织中的血管生成

由于血管生成在肿瘤的生长中有着极为重要的作用，血管的生成可以为肿瘤细胞输送营养，并且协助肿瘤的转移。已有大量的研究报道，M1型巨噬细胞可以分泌IL-12，抑制血管生成，而M2型巨噬细胞则可以通过分泌VEGF促进血管生成，促进肿瘤的生长于转移。我们的实验结果发现，FATS基因缺陷的小鼠肿瘤微环境中主要存在的巨噬细胞为M1型巨噬细胞，比例原大于野生型小鼠，同时巨噬细胞表达的VEGF的量也在FATS缺陷后显著减少。由此，我们猜测，FATS基因缺陷后肿瘤的血管生成是否减少。于是我们利用免疫荧光，检测了FATS基因缺陷小鼠与野生型小鼠肿瘤组织中的CD31的表达情况。与预期相一致，相比野生型小鼠，FATS基因缺陷小鼠肿瘤组织中的CD31显著的减少(图16)，白色箭头所指的红色点为CD31阳性，蓝色背景为DAPI染色显示的细胞核。这一结果说明，FATS基因缺陷后可能通过影响巨噬细胞的极化，从而影响了肿瘤的血管生成，最终对肿瘤的生长产生了抑制作用。

1.3讨论

近些年来，肿瘤免疫在肿瘤中的作用受到了越来越多的关注。肿瘤的免疫治疗可以特异的破坏肿瘤细胞，免疫系统的功能水平与肿瘤的治疗以及预后有着密切的关系。诸多研究结果显示，肿瘤微环境已经成为目前抗肿瘤免疫治疗的重要靶点。

肿瘤微环境由肿瘤实质细胞和肿瘤间质细胞组成，其中，间质细胞中的免疫细胞在肿瘤的发生发展中有着不可或缺的作用。不同的免疫细胞相互作用，例如抗原提呈以及细胞间通过细胞因子协同或抑制，来影响肿瘤的生长。免疫细胞相互协调，发挥着抵抗病原菌与肿瘤的作用，然而，肿瘤却通过改变浸润在肿瘤微环境中的免疫细胞的功能来创造一个有利于肿瘤生长的环境，逃避免疫监视，产生肿瘤细胞的免疫逃逸。

目前研究表明，免疫系统存在着促进肿瘤与抑制肿瘤的双重作用。上文已经提到，NK细胞，中性粒细胞，γδT细胞，NKT细胞，Th1细胞，CTL和以及M1型巨噬细胞，可以对肿瘤产生强的杀伤作用。

NK细胞以及中性粒细胞是固有免疫应答细胞，分别通过穿孔素，颗粒酶以及Fas/FasL以及活性氧等杀伤机制对肿瘤进行直接的抑制。同时，γδT细胞以及NK T细胞也直接或间接的对肿瘤细胞产生杀伤作用，在抗肿瘤免疫中发挥着作用。除此之外，诸多研究证明，T细胞在肿瘤免疫中发挥着至关重要的作用，初始T细胞可以识别抗原提呈细胞表面的MHC分子所提呈的短肽进而分化为不同的效应T细胞。CD4⁺T细胞可以识别MHC-II提呈的抗原肽，CD8⁺T细胞可以识别MHC-Ⅰ提呈的抗原肽。初始的CD4⁺T细胞经抗原提呈后，根据活化过程中微环境里存在的细胞因子不同，分化为不同亚型的效应辅助性T细胞。辅助性T细胞分化过程中所分泌的细胞因子又可以影响NK细胞，CTL细胞的细胞的活化。辅助性T细胞包括Th>

我们的研究结果发现，B16细胞荷瘤后，FATS基因缺陷小鼠的肿瘤发生率低且成瘤后肿瘤生长缓慢(图1)，这提示我们，FATS基因缺陷很可能影响了肿瘤中肿瘤相关的免疫细胞。于是我们全面的分析了野生型小鼠与FATS基因缺陷小鼠外周免疫器官和肿瘤免疫微环境中免疫细胞的变化。与已知的研究结果相一致，FATS基因缺陷小鼠抗肿瘤免疫细胞的比例显著的增加，在肿瘤微环境中增加的最为明显，这就说明，FATS基因缺陷对肿瘤相关的免疫细胞确实存在着重要的影响。FATS基因缺陷小鼠肿瘤浸润的炎性细胞明显增加(图2)，这与流式检测发现的肿瘤中总T细胞比例增加相一致(图9)。进一步的，FATS基因缺陷后，γδT细胞，NK细胞比例增加(图10)。更为重要的，主要的效应T细胞，Th1以及CTL的比例也显著的增加(图9，图12)，同时，T细胞的活化标记CD44以及主要效应细胞因子IFN-γ的比例在CTL细胞中显著的增加(图11，图12)。这些结果提示，FATS基因缺陷显著的增加了肿瘤细胞毒性应答，这与FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤抑制的结果相吻合。

我们进一步的实验发现，FATS基因缺陷小鼠肿瘤微环境中M1型巨噬细胞的数量显著的增多(图14)。近些年来，随着对巨噬细胞分型研究的深入，M1型巨噬细胞肿瘤中的作用被越来越重视。众所周知，肿瘤相关的巨噬细胞是组成肿瘤微环境中的主要细胞之一，对肿瘤的生长有着十分重要的影响作用。研究发现，M1型巨噬细胞表达MHC-II分子，表现出吞噬以及抗原提呈的能力。同时，M1型巨噬细胞可以产生促炎性细胞因子，iNOS2，ROS，RNS，IL-1β以及TNF-α介导肿瘤细胞的细胞溶解，来发挥着细胞杀伤的功能。M1型巨噬细胞产生IL-2以及IL-12，IL-2可以刺激活化的效应T细胞和NK细胞的增殖，是一个重要的生长因子，参与着抗原激活的淋巴细胞的增殖以及免疫记忆的产生，而IL-12能够促进表达IL-12受体的T，NK以及NK T细胞分泌IFN-γ，诱导Th1细胞极化以及CTL的产生，而IFN-γ的增加又可以正反馈调节进一步促使M1型巨噬细胞活性增强，同时IFN-γ可以促进抗肿瘤监视，抑制癌基因活化以及抑制血管生成，也有研究发现，IL-12同样表现出抗血管生成的活性。不仅如此，M1型巨噬细胞也可以将抗原交叉提呈给CD8⁺T细胞。由此，M1型巨噬细胞极化在抗肿瘤免疫中的作用极为重要，有效的结合了抗肿瘤免疫需要的固有免疫与适应性免疫应答。

除去对肿瘤具有杀伤的免疫细胞，肿瘤微环境中也存在着对肿瘤具有促进作用的免疫细胞。M2型巨噬细胞，MDCS，Treg等免疫抑制细胞可以抑制抗肿瘤免疫反应，使得侵袭性的肿瘤细胞逃避免疫监视，对抗肿瘤免疫应答形成了阻碍。

MDSC是由多种未成熟的髓系细胞组成，具有免疫抑制的功能。MDSC可以通过精氨酸酶-1，抑制T细胞的功能。同时，MDSC含有的iNOS能抑制T细胞反应。此外，MDSC也可以通过ROS来抑制T细胞的活化。除此，MDSC干扰IL-2受体信号，阻碍淋巴细胞运输，促进Treg的活化，同时可以产生IL-10和TGF-β，对Treg具有诱导作用。Treg在癌症病人比例增加，研究发现，在肿瘤微环境中有大量的Treg细胞的浸润。Treg细胞表达一系列的抑制分子，例如IL-10，TGF-β，LAG-3，GITR，CTLA-4和PD-1，这些因子可以直接抑制免疫细胞。并且，Treg可以抑制效应T细胞的细胞毒性反应，促进效应T细胞的凋亡。IL-2是活化的效应T细胞存活所必须的，Treg细胞页可以耗尽局部的IL-2，间接的抑制效应T细胞。

与M1型细胞相对，M2型巨噬细胞促进肿瘤的血管生成，侵袭和转移。M2型巨噬细胞表达的CCL22对Treg细胞有招募作用，Treg进一步的抑制CTL的功能，同时，M2型巨噬细胞也可以通过产生TGF-β和IL-10，将T细胞诱导为Treg或者其他不具有抗瘤活性的T细胞亚型。M2型巨噬细胞特异性的表达精氨酸酶-1对T细胞的活化进行抑制。M2型巨噬细胞所表达的精氨酸酶-1(Arg-1)，可以使精氨酸变为鸟氨酸，不再产生NO，降低了巨噬细胞的杀伤功能。M2型巨噬细胞在维持肿瘤细胞生长，存活和转移中起着非常重要的作用。

基于以上理论，我们的实验进一步检测分析了肿瘤免疫微环境中免疫抑制细胞的比例，对FATS基因缺陷调节肿瘤免疫有了更全面的研究。与已有的研究结果相一致，我们的实验结果显示，在FATS基因缺陷小鼠的肿瘤微环境中，虽然MDSC的比例在两组小鼠中没有显著的差异，但是Treg细胞的比例显著的降低(图13)，这说明在FATS基因缺陷小鼠中，促进肿瘤生长的免疫应答被抑制。有趣的是，M2型巨噬细胞的检测发现，FATS基因缺陷小鼠M2型巨噬细胞比例显著的低于野生型小鼠的M2型巨噬细胞，免疫荧光染色也得到了一致的结果(图14)，这一结果提示，FATS基因缺陷小鼠的肿瘤微环境中，存在着巨噬细胞极化的不同，也就是说，FATS基因缺陷可能显著的促进了抗肿瘤免疫的M1型巨噬细胞的极化，抑制了M2型巨噬细胞的极化。

我们知道，肿瘤免疫微环境中，巨噬细胞极化的不同(M1/M2)对肿瘤的发生发展中有着深远的影响。一些研究显示，肿瘤中的巨噬细胞与无菌伤口中的巨噬细胞功能相似，并没有表现出杀伤活性，具有促进生长的作用。随着研究的深入，最近的研究提示，巨噬细胞根据免疫条件的不同，可以极化为不同表型的巨噬细胞，也就是说，微环境的刺激可以使巨噬细胞极化为M1型，也可以极化为M2型巨噬细胞，当肿瘤免疫微环境中的M2型巨噬细胞被调节，转变为M1型巨噬细胞时，肿瘤生长就会受到明显的抑制。在人类肿瘤与不同的小鼠肿瘤模型的研究中均已经发现，将巨噬细胞表型由促肿瘤的M2型转变为抗肿瘤的M1型，可以显著的抑制肿瘤的生长。

在本次研究中，FATS基因缺陷小鼠的巨噬细胞中M1型巨噬细胞表达IL-12，TNF-α，NOS2明显高于野生型小鼠，同时M2型巨噬细胞表达的Arg-1，Mrc1以及CCL22在野生型小鼠中明显高于FATS基因缺陷小鼠(图15)。肿瘤小鼠的血清ELISA检测也发现，M1型巨噬细胞分泌的IL-1β，TNF-α，IL-12以及促进正反馈M1巨噬细胞活化的IFN-γ在FATS基因缺陷小鼠中显著增加，同时，M2型巨噬细胞所分泌的IL-10的含量下降(图8)。这些结果都提示，FATS基因缺陷后，小鼠肿瘤微环境中的巨噬细胞更倾向于极化为对肿瘤有抑制作用的M1杀伤型巨噬细胞，M1型巨噬细胞的增加，M2型巨噬细胞的减少是FATS基因缺陷后抑制黑色素瘤生长的潜在的细胞机制。研究显示，M1型巨噬细胞通过多种机制对血管生成有着显著的抑制作用，而M2型巨噬细胞则会明显的促进血管生成，这也是肿瘤能得以生长的必要因素，我们的结果发现，FATS基因缺陷小鼠肿瘤中巨噬细胞表达VEGF的量显著下降，肿瘤切片CD31染色显示了一致的结果，FATS基因缺陷小鼠肿瘤组织中CD31表达极低(图16)。这也就是说，FATS基因缺陷对黑色素瘤的抑制可能是通过促进M1型巨噬细胞极化，直接杀伤肿瘤细胞，一致肿瘤组织血管生成，并促进细胞毒性T细胞的增殖，对肿瘤进一步的抑制和杀伤。

我们的结果提示，肿瘤效应的T细胞比例的增加与M1/M2型巨噬细胞极化的改变可能是FATS基因缺陷后抑制小鼠黑色素瘤生长的可能原因，为我们进一步的FATS基因影响黑色素瘤的机制研究提供了有力依据。

二、FATS基因缺陷对小鼠黑色素瘤调节作用的细胞与分子机制

2.1对象和方法

2.1.1主要材料、试剂与仪器设备

2.1.1.1主要试剂

2.1.1.2细胞系

B16细胞

2.1.1.3细胞因子

M-CSF美国R&D公司

IL-4 美国R&D公司

IFN-γ 美国R&D公司

2.1.1.4抗体

2.1.1.5引物序列

上游引物下游引物TNF-αGAGGCCAAGCCCTGGTATGCGGGCCGATTGATCTCAGCNOS2GTTCTCAGCCCAACAATACAAGAGTGGACGGGTCGATGTCACIL-12ACAAAGGAGGCGAGGTTCTAACCCTTGGGGGTCAGAAGAGArg1CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAGGGAGCTGTCATTAGGGACATCACCL22CTCTGCCATCACGTTTAGTGAAGACGGTTATCAAAACAACGCCMrc1CTCTGTTCAGCTATTGGACGCTGGCACTCCCAAACATAATTTGARetnlaCCAATCCAGCTAACTATCCCTCCACCCAGTAGCAGTCATCCCAGAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGGGGTCGTTGATGGCAACA

2.1.1.6主要仪器

2.1.2试剂配制

2.1.2.1 0.01M PBS：

分别称取Na₂HPO₄(1.54g)，KH₂PO₄(0.2g)，NaCl(8.0g)，KCl(0.2g)，加入到超纯水中，充分溶解，定容至100ml，调节PH值(7.2-7.4)。高压灭菌，于4℃冰箱保存备用。

2.1.2.2配制CFSE：

1)CFSE是一种荧光染料，可以穿透细胞膜，经常被用来检测细胞的增殖情况本身并不带有荧光的CFSE在标记细胞后，细胞内的醋酶将其分解，从而产生高强度的荧光。这种荧光产物可以与细胞内的氨基结合，并长时间存留与胞内。随着细胞的分裂，CFSE被平均分配至子代细胞中，随之子代细胞的荧光强度下降为母代细胞的一半。因此，CFSE荧光强度的高低直接与细胞分裂的次数相关。

2)将1mg的CFSE溶解于1,800μl的DMSO中，分装并于-20℃进行保存。使用时，可用无血清培养基，1倍PBS或其他缓冲液将其稀释使用(具体浓度根据实验要求而定)。

2.1.2.3抗体稀释液：

1)抗体稀释液的组成成分为0.2％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％叠氮钠(NaN₃)以及1倍PBS；

2)将称取的0.2mg BSA和吸取的1ml 10％的NaN₃加入到100ml的1倍PBS中，搅拌，使其完全溶解，于4℃冰箱保存备用。

2.1.2.4 4％多聚甲醛：

1)称取2g多聚甲醛加入到45ml超纯水中，加入1mol/L的NaOH；

2)56℃过夜使其完全溶解；

3)冷却至室温后，加入5ml 10倍PBS；

4)加入1mol/L的CaCl₂和MgCl₂各50ul；

5)将PH值调至7.3，4℃避光保存。

2.1.2.5细胞磁珠分选用的缓冲液(0.5％BSA/PBS)：

1)分选用缓冲液组成成分为BSA和1倍PBS

2)配制10％BSA，用1倍PBS稀释20倍，4℃保存备用。

2.1.2.6 RIPA裂解液：

1)RIPA的组成成分为50mmol/L的Tris(MW 121.14，PH7.5)，150mmol/L的NaCl，1％TritonX-100,1％脱氧胆酸钠以及0.1％SDS；

2)称取Tris 3.02g，NaCl 4.38g，TritonX-100 5ml，脱氧胆酸钠5g，SDS 0.5g，加超纯水至500ml，调节pH值，至7.5。充分混匀后，保存于4℃备用，长期保存则应存于-20℃；

3)使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。

2.1.2.7蛋白酶抑制剂：

1)蛋白酶抑制剂cooktail，所需母液成分：

①100mmol/L的PMSF：称取17.4mg的PMSF，加入1ml的异丙醇。充分溶解后，分装于1.5ml离心管中，于-20℃保存；

②抑肽素Aprotinin(2mg/ml):保存于4℃；

2)配制：

①PMSF：终浓度为1mmol/L，即母液稀释100倍使用；

②Aprotinin：终浓度为1μg/ml，即母液稀释2000倍使用。

2.1.2.8免疫印迹上样用试剂：

1)浓缩上样缓冲液(4倍)：

将0.8g SDS，0.04g溴酚蓝，4ml甘油以及1.0mol/L的Tris-HCl(PH 6.8)加入到去离子水中，定容至10ml，充分混匀后，分装于1.5ml EP管中，保存于4℃，使用时需稀释为1倍。

2)1.0mol/L的二硫苏糖醇(DTT，10倍浓缩液)：

将3.09g DTT溶解于20ml的0.01mol/L乙酸钠溶液(PH为5.2)中，分装于1.5ml EP管中，保存于-20℃，使用时需稀释为1倍。

2.1.2.9配胶用工作液

1)浓缩胶缓冲液(1.0mol/L Tris-HCl，pH 6.8)

将12.114g Tris(MW121.14)加入到100ml蒸馏水中，充分溶解后，加入浓盐酸将PH值调至6.8，保存于4℃备用；

2)分离胶缓冲液(1.5mol/L Tris-HCl，pH 8.8)：

将18.671g Tris(MW121.14)加入到100ml蒸馏水中，充分溶解后，加入浓盐酸将PH值调至8.8，保存于4℃备用；

3)10％十二烷基硫酸钠(SDS)：

将10g SDS加入到100ml蒸馏水中，充分溶解，如溶解时困难，可于50℃下水浴溶解，保存于室温。长期保存过程中出现沉淀，只需水浴溶解，不影响使用。

4)10％过硫酸铵(AP)：

将0.1g过硫酸胺加入到1ml蒸馏水中，充分溶解，分装于0.2ml EP管中，保存于-20℃。

5)30％丙烯酰胺：保存于4℃。

6)四甲基乙二胺原液(TEMED)：保存于4℃。

2.1.2.10免疫印迹所用缓冲液

1)跑胶缓冲液：

10倍浓缩电泳液缓冲液，称取144g的甘氨酸，30.2g的Tris-base，10g的SDS，充分溶解于超纯水中，定容至1L，室温保存，使用时稀释为1倍。

2)转膜缓冲液：

1倍转膜缓冲液，称取14.4g的甘氨酸和3.02g的Tris-base，充分溶解于超纯水中，定容至800ml，加入甲醇200ml使用。

3)10倍TBS缓冲液：

10倍浓缩TBS缓冲液，称取80g的NaCl和24.2g的Tris-base，充分溶解于超纯水中，定容至1L，使用浓盐酸调节PH值，7.6，室温保存。

4)1倍TBST缓冲液：

吸取100ml 10倍的浓缩TBS缓冲液，加入超纯水，定容至1L，最后加入Tween-20，充分混匀；由于Tween-20较为粘稠，吸取时应非常缓慢，防止产生气泡，溶解时要不断用玻璃棒搅动，以防Tween-20迅速沉于烧杯底部；室温保存备用。

5)封闭液/抗体稀释液(5％脱脂牛奶)：

称取脱脂奶粉5g，充分溶解于100ml的1倍TBST缓冲液中，一周内使用可保存于4℃，长期保存可放于-20℃。

2.1.3实验方法

2.1.3.1异位小鼠黑色素瘤模型构建(具体步骤详见1.1.3.2.2)

1)脱去小鼠右后背部的毛脱去，用75％酒精对小鼠注射部位进行消毒；

2)将B16细胞悬液(2×10⁶/ml)注射到小鼠右后背部(100μl/只)

3)荷瘤后20天，麻醉后脱颈处死小鼠，分离小鼠的肿瘤组织，用于分选巨噬细胞。

2.1.3.2巨噬细胞与T细胞混合细胞培养：

2.1.3.2.1肿瘤组织巨噬细胞分选

1)分离小鼠肿瘤单个核细胞(具体过程详见1.1.3.3.2)；

2)细胞悬液中加入大鼠抗小鼠荧光标记抗体，F4/80-FITC；

3)Aris III流式细胞仪对标记了F4/80-FITC的细胞进行分选；

4)培养在含有10％血清的无菌1640培养基中，备用。

2.1.3.2.2小鼠CD3⁺T细胞分选

1)取正常野生型C57小鼠脾脏，分离单个核细胞(具体过程详见1.1.3.3.1)；

2)细胞计数；

3)细胞中加入磁珠分选缓冲液3-5ml，300g离心，10min，完全吸除上清；

4)加入磁珠分选缓冲液(是加入磁珠的10倍体积)和CD3⁺磁珠(10μl/10⁷个细胞)，混匀，4℃，静置15min，中间取出来混匀一次；

5)加入磁珠分选缓冲液20ml，300g离心，10min，完全吸除上清；

6)每10⁸个细胞加入500μl的分选缓冲液，缓慢滴加到预先用分选缓冲液洗过的分选柱；

7)将分选柱放置在无菌的15ml离心管上，加入2ml含有10％FBS的1640培养基，快速将粘附在柱子上的细胞洗出，计数，洗出的细胞即为CD3⁺的T细胞，培养备用。注：实验全程在冰上进行，可提高分选效率。

2.1.3.2.3 CFSE染色

1)重悬分选的CD3⁺T细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml；

2)每ml细胞中加入2μl CFSE贮存液，混匀，终浓度为10μM；

3)37℃孵育，10min；

4)取出，加入5倍体积的预冷的培养基，终止染色；

5)冰上孵育，5min；

6)1300rpm，离心，5min；

7)用含有10％FBS的1640培养基1300rpm，离心，5min，洗3次；

8)重悬细胞，根据实验需求调整细胞浓度。

2.1.3.2.4巨噬细胞与T细胞混合培养

1)流式分选出的巨噬细胞用丝裂霉素C(5μg/μl)处理，每1×10⁶细胞加入丝裂霉素12.5μl，在细胞培养箱中培养30min；

2)加入含有10％FBS的1640培养基洗3次，细胞计数；

3)与CD3⁺T细胞共培养4天，巨噬细胞与T细胞比例为1：4，培养中间2-3天补液50-100μl；

4)培养结束后收取细胞，与直接固定未经传代的母带T细胞一起，流式细胞仪上机检测CFSE表达情况。

2.1.3.3巨噬细胞与B16细胞混合培养：

2.1.3.3.1肿瘤组织巨噬细胞分选：

具体过程详见2.1.3.2.1

2.1.3.3.2巨噬细胞与B16细胞混合培养

1)流式分选出的巨噬细胞用丝裂霉素C(5μg/μl)处理，每1×10⁶细胞加入丝裂霉素12.5μl，在细胞培养箱中培养30min；

2)加入含有10％FBS的1640培养基洗3次，细胞计数；

3)收B16细胞，计数；

4)巨噬细胞与B16细胞共培养1天，巨噬细胞与B16细胞比例为40：1；

5)培养结束后收取细胞，流式细胞仪上机检测B16细胞的凋亡情况。

2.1.3.4 T细胞增殖实验

1)用抗CD3和CD28的抗体包被48孔板(浓度为抗CD3，5μg/ml；抗CD28，1μg/ml)，4℃过夜；

2)分选CD3阳性T细胞(具体步骤详见2.1.3.2.2)；

3)细胞计数，CFSE染色(具体步骤详见2.1.3.2.3)；

4)培养于包被好的46孔板中，每孔10⁶个T细胞；

5)培养上清为混合了B16培养上清的1640培养基或者是普通1640培养基，培养4天，流式细胞术检测CFSE的表达情况。

2.1.3.4骨髓细胞分离：

1)麻醉后，脱颈处死小鼠，用75％酒精消毒双下肢，固定后剪开皮肤，分离肌肉组织，暴露胫骨，保留两侧关节，将胫骨取出，迅速置于冷的1倍PBS中；

2)去掉骨面上残余的组织，置于超净工作台中，沿关节剪开股两端，暴露出髓腔，用1ml注射器吸取1倍的PBS，将骨髓冲至培养皿中，反复冲洗，直至胫骨全部变为白色；

3)用1ml的枪将骨髓吹散至单细胞状态，随后收集细胞悬液至无菌的15ml离心管中，1000rpm，离心，5min；

4)弃上清，加入1ml 1倍的PBS，1000rpm，离心，5min；

5)弃上清，用含有10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，培养在细胞培养箱中。

2.1.3.5巨噬细胞定向分化：

1)分离出的骨髓细胞加入M-CSF(10ng/ml)培养5天，此时的细胞为M0型巨噬细胞(培养第三天需半量换液)；

2)M1型巨噬细胞极化：M0型巨噬细胞加入IFN-γ(20ng/ml)培养12h，随后加入LPS(100ng/ml)继续培养4h，即为M1型巨噬细胞；

3)M2型巨噬细胞极化：M0型巨噬细胞加入IL-4(20ng/ml)培养16h，即为M2型巨噬细胞。

2.1.3.6巨噬细胞分型检测：

1)收取待检测的细胞，1500rpm，离心，5min；

2)弃上清，加入1ml 1倍的PBS，重悬细胞，1500rpm，离心，5min；

3)弃上清，分出空白管，单染管以及同型对照检测管，与检测管一起，加入1倍PBS，使每管大约100μl；

4)封闭：每管加入25μl的流式抗体封闭液，4℃避光，30min；

5)表面染色：每管按照实验设计分别加入大鼠抗小鼠荧光标记抗体和同型对照抗体：

①M1型巨噬细胞：CD11b-FITC/MHC-II-PE/F4/80-APC

CD11b-FITC/CD11c-PE/F4/80-APC

②M2型巨噬细胞：CD206-FITC/CD11b-PE/F4/80-APC

6)4℃避光，30min；

7)每管加入1ml的1倍PBS重悬，1500rpm，离心，5min，洗涤2次；

8)弃上清，每管加入4％多聚甲醛或者固定缓冲液50-100μl固定；

9)流式细胞仪上机检测(短时间可保存于4℃)。

2.1.3.7细胞凋亡检测

细胞凋亡检测使用的是细胞凋亡检测试剂盒：Annexin Ⅴ/PI assay kit，主要步骤包括：

1)将试剂盒中的Binding缓冲液用超纯水稀释10倍，备用；

2)收细胞，用冷的1倍PBS洗一遍(1500rpm，离心，5min)；

3)弃上清，用1ml稀释的Binding缓冲液重悬细胞，1500rpm，离心，5min；

4)分出空白管和两管单染管；

5)每管加入5μl的Annexin Ⅴ-FITC/APC，室温避光10min；

6)每管加入5μl的PI-PE，室温避光5min；

7)每管加入200μl的Binding缓冲液，流式细胞仪检测(1h之内)。

2.1.3.8细胞RNA提取(具体步骤详见1.1.3.7)

1)将冻存于-80℃冰箱的加有Trizol的骨髓定向分化的M1/M2型细胞取出，室温融化，涡旋15s混合均匀，室温静置10min；

2)每管加入氯仿，静置；

3)离心，取上清，移至新的无RNA酶管中；

4)加入与上清同等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，在冰上静；

5)离心，弃上清，加入无水乙醇，混匀，离心，弃上清，吸出残余液体，室温晾干；

6)加入无RNA酶水，溶解RNA，可长期保存于-80℃；

7)琼脂糖胶，跑胶鉴定；

8)Nanodrop测定RNA浓度。

2.1.3.9RNA反转成cDNA

1)反转录使用试剂盒，M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen^TM,by>TM)；

2)主要反转步骤详见1.1.3.8。

2.1.3.10实时定量PCR

1)20μl体系包括：10μl的qPCR mastermix，正反定量引物各0.5μl(10μM)，cDNA 1μl，ROX0.4μl，超纯水7.6μl；

2)ABI 7500Fast进行实时定量PCR检测。

2.1.3.11细胞蛋白提取

1)收取细胞(不能使用胰蛋白酶)，1200-1300rpm离心，5min，弃上清；

2)加入1ml 1倍的PBS吹打沉淀细胞，转移细胞悬液至1.5ml的EP管中，1300-1500rpm离心，5min，尽量干净的弃掉上清；

3)用加有PMAF和OPE的RIPA裂解液吹打细胞，根据细胞的多少调整RIPA裂解液的用量，冰上静置30min；

4)14000rpm，4℃离心，15min，吸取上清，分装在0.2ml的EP管中。

2.1.3.12蛋白浓度检测

1)标准蛋白稀释10倍使用；

2)取8个0.2ml的EP管：

标准蛋白(μl)01248121620超纯水(μl)2019181612840

3)配工作液：A液：B液为50：1，上下颠倒混匀；

4)在96孔板中加入200μl/孔的工作液，随后在工作液中加入配好的标准蛋白和稀释好的蛋白；

5)37℃放置30min；

6)酶标仪检测OD值(595nm)。

2.1.3.13免疫蛋白印记：

1)10％分离胶的配制(10ml)：

2)12％分离胶的配制：

3)5％浓缩胶的配制(6ml)：

4)电泳：

①蛋白上样：取25-30μg蛋白，加入浓缩上样缓冲液和超纯水(缓冲液最后稀释为1倍)，混匀，99℃变性，5min,取出后加到已经事先装在电泳仪上的免疫印迹胶孔中，倒入跑胶缓冲液；

②打开凝胶电泳仪的电源，设置电压80V(当蛋白跑至分离胶时更换电压至100V)；

③当溴酚蓝染料的前缘跑至分离胶的下缘结束电泳。

5)转膜：

①小心取出凝胶，将其浸泡于转膜缓冲液中；

②剪大于胶块的PVDF膜，在无水甲醇中活化30s后浸泡于转膜缓冲液中待用；

③按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵，夹好转移夹，确保每层之间没有气泡；

④将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，打开电源，89V稳压转移60min。

6)封闭：

把PVDF膜浸入封闭液中，室温摇动1h。

7)洗膜与杂交：

①加入第一抗体：按照单抗说明书，稀释于抗体稀释液中，将有蛋白的PVDF膜放入第一抗体中，4℃摇动过夜；

②用TBST洗膜，5-10min，3次；

③加入第二抗体：辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔或鼠IgG抗体(1：2000稀释)，将有蛋白的PVDF膜放入第二抗体中，室温摇动2h；

④用TBST洗膜，10min，3次。

8)曝光：

①将化学发光试剂盒中的两种试剂按1：1的比例混匀，滴加在保鲜膜上；

②用滤纸将PVDF膜上的TBST吸净，蛋白面朝下，放置在反应液上，30s；在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1min；

③用滤纸吸净膜上的反应液，蛋白面朝上，用保鲜膜包好，放置在压片盒中；

④进入暗室，用感光胶片在压片盒中曝光，曝光时间视具体实验而定；

⑤曝光后的感光胶片在显影液中显影，随后在定影液中定影，用水冲洗晾干；

2.1.3.14 ELISA检测

1)样品制备：收集共培养细胞(T细胞与巨噬细胞)与培养上清，1500rpm离心，取上清；

2)各取100μl的6个标准品，依次加入到包被好的微孔板中，做好标记；

3)将处理过的样品依次加入微孔板中，每孔100μl；

4)在微孔板上覆膜，放置于37℃，孵育60min，弃掉微孔中的液体，并用卫生纸吸净残余液体；

5)用事先按照说明书稀释好的清洗液清晰微孔板5次；

6)每孔加入底物Ⅰ，每孔各50μl，再加入底物II，每孔各50μl，充分混匀，室温下避光，15min；

7)每孔加入终止液50μl，充分混匀，终止反应；

8)酶标仪检测OD值(450nm)。

2.1.3.15 NO检测

1)将标准样品用培养基稀释至1mM(原液为1M)；

2)取9个0.2ml的EP管：

标准蛋白(μl)00.10.20.5124610培养基(μl)10099.999.899.59998969490

3)在96孔板中，加入标准品和样品，每孔各加50μl；

4)以上每孔各加入溶液Ⅰ50μl，溶液II50μl；

5)室温，避光，放置30min；

6)酶标仪检测OD值(540nm)。

2.1.4数据处理与统计

本研究全部数据都来自至少三次独立的实验，实验数据均用means±SD表示，均输入Excel建立数据库，分析采用采用spss13.0统计软件。组内比较采用概率计算应用Student’s unpaired t-test,以p<0.05表示差异有统计学意义(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。统计图均由GraphPad Prism Version 5.0(GraphPad Software Inc，San Diego CA)完成。流式数据采用Modifit以及FlowJo 7.6.1software(Tree Star，Inc，USA)进行分析。

2.2结果

2.2.1 FATS基因缺陷小鼠T细胞体外增殖与野生型小鼠相比没有明显区别

我们的体内研究结果发现，黑色素瘤小鼠的外周免疫器官与肿瘤免疫微环境中，FATS基因缺陷明显增加了CTL细胞的比例，并且CTL的活化与功能都显著的增强(图5，9，11)。同时也发现，巨噬细胞亚型(M1和M2型巨噬细胞)在FATS基因缺陷小鼠与野生型小鼠的肿瘤免疫微环境中的变化显著(图14)。众所周知，M1型巨噬细胞在固有免疫杀伤和适应性抗原呈递中都有不可或缺的作用。由此我们猜测，FATS基因缺陷可能通过增加M1型巨噬细胞比例，减少M2型巨噬细胞比例来影响巨噬细胞的抗原呈递功能从而影响了肿瘤免疫微环境中的T细胞的增值，也可能是FATS基因缺陷小鼠的T细胞本身存在着强的增殖能力，或者这两个因素在黑色素瘤肿瘤的发生发展中均具有重要作用。

为了深入的研究FATS基因可以直接的影响哪一种免疫细胞功能，即FATS基因缺陷抑制黑色素瘤生长的细胞机制，我们首先对野生型小鼠以及FATS基因缺陷小鼠的T细胞进行了增殖检测。我们分离出野生型以及FATS基因缺陷小鼠的CD3⁺T细胞，CFSE染色后，用B16细胞培养上清或者含有10％FBS的1640培养基培养，4天后用流式细胞术检测T细胞的增殖情况。如图17所示，无论使用普通培养基还是B16细胞培养上清培养，FATS基因缺陷小鼠的T细胞的增殖指数(PI)与野生型小鼠均没有明显的差别，这一结果提示，FATS基因缺陷可能并没有直接导致T细胞的增殖能力的增强，也就是说，FATS基因缺陷后对黑色素瘤的抑制作用可能是通过影响巨噬细胞分型转变来实现的。

2.2.2 FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤中巨噬细胞促进了T细胞的增殖

研究表明，M1型巨噬细胞表达MHC-II，具有抗原提呈的能力，参与固有以及适应性免疫，促进肿瘤效应T细胞的增殖；相反的，M2型巨噬细胞在促进肿瘤的生长有着重要的作用，其比例的增加会抑制T细胞的增殖。由于我们发现，虽然在肿瘤微环境中，FATS基因缺陷后T细胞的比例显著的增加，但是FATS基因缺陷的T细胞在体外增殖实验中却没有表现出强的增殖能力，与野生型T细胞差别不大(图17)，于是我们进一步检测了肿瘤微环境中巨噬细胞的提呈能力，探究FATS基因缺陷的巨噬细胞是否是引起T细胞在肿瘤环境中增多的一个原因。我们将流式分选出的两组小鼠肿瘤组织中的巨噬细胞与标记了CFSE的没有荷瘤野生型小鼠的CD3⁺T细胞进行共培养。培养4天后流式检测T细胞的增值情况。实验结果显示，相比野生型小鼠肿瘤微环境中的巨噬细胞，FATS基因缺陷小鼠肿瘤微环境中的巨噬细胞更加显著的促进了T细胞的增值(图18A)，同时，我们对培养上清中的IL-2进行了检测，发现与FATS基因缺陷巨噬细胞共培养的上清中，IL-2的表达增高(图18B)，这也进一步验证了T细胞增殖在与FATS基因缺陷的巨噬细胞共培养后增加。这些结果表明，FATS基因缺陷小鼠的肿瘤微环境中的巨噬细胞相较野生型小鼠，表现出了强大的抗原呈递能力，也进一步说明，FATS基因缺陷后，肿瘤微环境中的巨噬细胞主要为促进T细胞增殖的M1型巨噬细胞。

2.2.3 FATS基因缺陷小鼠肿瘤中的巨噬细胞对B16细胞具有更强的直接杀伤作用

我们知道，M1型巨噬细胞除去抗原呈递，促进T细胞增殖功能外，在固有免疫中亦有着重要的作用，它们可以产生NO，对细胞进行直接的杀伤。而M2型巨噬细胞不产生NO，对细胞不再具有杀伤作用。基于我们已经得到的实验结果，我们进一步检测了FATS基因缺陷后，巨噬细胞是否表现出M1型的细胞杀伤能力。我们用流式分选出野生型以及FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤组织中的巨噬细胞，并将它们与B16细胞共培养，1天后检测B16的凋亡。结果如图19所示，与FATS基因缺陷的巨噬细胞共培养的B16细胞凋亡增加(图19A，B)，同时我们对共培养上清中的NO进行了检测，相一致的，FATS基因缺陷巨噬细胞共培养上清中NO的含量显著的增加(图19C)，进一步说明，FATS基因缺陷的巨噬细胞具有更为强大的细胞杀伤能力，也就是说明，FATS基因缺陷的巨噬细胞更偏向于具有杀伤能力的M1型巨噬细胞这与我们的体内结果相统一。

2.2.4 FATS基因缺陷促进了骨髓细胞向M1型巨噬细胞分化，同时抑制了M2型巨噬细胞分化

我们以上的实验结果表明，FATS基因缺陷可能直接影响了巨噬细胞的分型，即抑制了M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化，来影响肿瘤免疫的。为了进一步验证我们的实验结果，我们在体外实验中，研究FATS基因缺陷是否对巨噬细胞的极化产生直接的影响。我们分离出野生型小鼠以及FATS基因缺陷小鼠的骨髓细胞，加入M-CSF对其进行巨噬细胞的定向分化，分化第7天，加入IFN-γ和LPS或者IL-4使其进一步向M1型或者M2型巨噬细胞极化，16个小时后收集细胞，流式细胞染色或者定量检测，全面的分析了FATS基因缺陷对M1以及M2型巨噬细胞分化的影响。

首先，我们利用流式细胞术检测野生型小鼠与FATS基因缺陷小鼠中，M1以及M2型巨噬细胞的比例。如图20所示，M0型巨噬细胞在向M1型巨噬细胞极化后，FATS基因缺陷小鼠M1型巨噬细胞的比例远高于野生型小鼠的M1型巨噬细胞的比例(图20A，B)，这一结果提示，FATS基因缺陷后，巨噬细胞明显倾向于分化为M1型巨噬细胞。此外，与预期相一致的，在M2型巨噬细胞极化中，FATS基因缺陷则表现出M2型巨噬细胞极化的明显受抑，FATS基因缺陷小鼠M2型巨噬细胞的比例显著少于野生型小鼠的M2型巨噬细胞比例(图20C，D)。这一结果非常明显的提示，FATS基因缺陷可以直接对巨噬细胞产生影响，显著的促进了M1型巨噬细胞的极化，抑制了M2型巨噬细胞的极化。

同时，我们也对野生型小鼠和FATS基因缺陷小鼠的M1以及M2型巨噬细胞的基因表达水平进行了实时定量PCR检测。结果如图21，22所示，与流式结果相一致，M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化后，FATS基因缺陷小鼠的M1型巨噬细胞中，重要细胞因子，IL-12，TNF-α以及NOS2的mRNA表达明显的高于野生型小鼠(图21)。而在M0型向M2型巨噬细胞极化后，FATS基因缺陷小鼠的巨噬细胞表达M2型细胞因子，Arg1，Mrc1，Retnla以及CCL22的mRNA水平明显低于野生型小鼠(图22)。这些结果表明，在M0型巨噬细胞极化的过程中，FATS基因缺陷使得巨噬细胞显著易于分化为M1型巨噬细胞，同时抑制了M2型巨噬细胞的分化，这与我们先前得到的体内研究的结果相一致。

2.2.5 FATS基因缺陷促进了M2型巨噬细胞的凋亡

以上实验中，我们发现，FATS基因缺陷小鼠的M2型巨噬细胞显著的减少，为了更加全面的探究FATS基因对M2型巨噬细胞的影响以及潜在的机制，我们继续检测了野生型小鼠以及FATS基因缺陷小鼠在巨噬细胞定向分化为M2型巨噬细胞中的细胞凋亡。我们分离小鼠骨髓细胞，加入M-CSF诱导巨噬细胞定向分化，最后加入IL-4诱导M2型巨噬细胞极化，收集M2型巨噬细胞，流式检测其凋亡水平以及免疫印迹检测细胞凋亡相关信号表达水平。流式结果显示，FATS基因缺陷后，在诱导M2型巨噬细胞极化过程中，细胞的凋亡显著的增加(图23A，B)，无论是早期凋亡还是晚期凋亡，FATS基因缺陷的小鼠M2型巨噬细胞都显著高于野生型小鼠。这一结果显示了，FATS基因缺陷促进了M2型巨噬细胞的凋亡，这可能是FATS基因缺陷小鼠中M2型巨噬细胞比例减少的一个原因。进一步的，我们检测了两组小鼠中，M2型巨噬细胞中凋亡相关信号的表达，与流式结果相一致，FATS基因缺陷小鼠的M2型巨噬细胞中，Cleaved-caspase3蛋白的表达量相较野生型小鼠增加，同时具有抑制细胞凋亡的蛋白，Bcl2在FATS基因缺陷的巨噬细胞中受到抑制(图23C)。这些结果提示了，FATS基因缺陷促进了M2型巨噬细胞的凋亡，从而减少了M2型巨噬细胞的比例，这与体内实验中检测的肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的比例减少以及体外实验中M2型巨噬细胞极化后减少相一致。

2.2.6 FATS基因缺陷促进了巨噬细胞中NF-κB信号通路的激活

我们的研究证实，FATS基因缺陷促进M2型巨噬细胞的凋亡，导致M2型巨噬细胞比例的下降，同时我们也发现了在FATS基因缺陷时，M1型巨噬细胞的比例显著的增加，为了深入探究我们体内体外实验所得到结果的可能的机制，我们进一步检测了M0型巨噬细胞以及腹腔富集的巨噬细胞中分化相关的信号通路。我们提取骨髓定向分化过程中M0型巨噬细胞的蛋白，细胞免疫印迹检测了巨噬细胞向M1型巨噬细胞定向分化的重要信号通路，NF-κB信号通路。结果如图24所示，NF-κB信号通路中，p65的表达在FATS基因缺陷后被明显激活，同时与p65结合抑制其进入细胞核的IκBα信号的表达受到了抑制(图24A，B)。这一结果表明，FATS基因缺陷后激活了巨噬细胞中NF-κB信号通路，促进了M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞的分化，从而增加了M1型巨噬细胞的比例。

2.3讨论

我们在体内实验中对黑色素瘤小鼠的肿瘤微环境里免疫细胞的分析中发现，FATS基因缺陷抑制了促进肿瘤的免疫抑制细胞，同时促进了对肿瘤具有杀伤的效应免疫细胞。众所周知，肿瘤微环境中的免疫细胞通过抗原提呈，分泌多种细胞因子等机制相互协同或抑制，从而对肿瘤产生影响，其中巨噬细胞(M1型巨噬细胞)以及效应的T细胞(CTL，Th1)对于肿瘤的杀伤和生长抑制有着重要的作用。我们注意到，FATS基因缺陷后，黑色素瘤小鼠中具有主要细胞杀伤效应作用的Th1，CTL以及同时具有固有杀伤和抗原呈递功能的M1型巨噬细胞的比例显著增加。这些结果让我们提出一个疑问，FATS基因缺陷是直接对T细胞增殖产生影响还是通过巨噬细胞间接影响T细胞的比例？于是我们对FATS基因缺陷的T细胞进行了体外增殖检测，结果发现，T细胞的增殖并没有在FATS基因缺陷后增加(图17)，接下来，我们用黑色素瘤小鼠中的巨噬细胞与T细胞共培养检测T细胞增殖，结果却发现，FATS基因缺陷的巨噬细胞显著的促进了T细胞的增殖，T细胞增殖指数增加，同时培养上清中T细胞增殖所必须的细胞因子，IL-2的量也在FATS基因缺陷小鼠巨噬细胞混合培养上清中显著增加(图18)，由此，我们推测，FATS基因缺陷直接产生影响的细胞可能是巨噬细胞，也就是说，FATS基因缺陷可能是通过改变巨噬细胞的极化，进一步的，激活了效应T细胞并影响肿瘤免疫微环境中免疫细胞的比例。

随后，我们的体外实验结果发现，骨髓定向分化过程中，FATS基因缺陷的骨髓细胞在同样的极化条件下，比野生型小鼠更易于极化为M1型巨噬细胞，并抑制M2型巨噬细胞(图20)。同时基因的检测也得到了一致的结果，M1型极化条件下，FATS基因缺陷的巨噬细胞更高的表现M1型特异性的标记(图21)，其中包括分泌产生的IL-12，对T细胞的增殖和存活有着重要的作用；而在M2型巨噬细胞极化条件下，M2型巨噬细胞特征的因子Arg-1，CCL22，Mrc1以及Retnla的表达在FATS基因缺陷巨噬细胞中明显抑制(图22)，其中CCL22招募Treg抑制肿瘤效应细胞，对肿瘤的生长有着促进作用。这些与我们体内实验分析肿瘤微环境中免疫细胞比例变化得到的数据在理论上完全吻合。

我们知道，M1型巨噬细胞除去提呈促进T细胞增殖的功能外，也在固有免疫中起着关键作用，对肿瘤有着直接的杀伤作用。我们进一步的对FATS基因缺陷小鼠肿瘤组织中巨噬细胞的杀伤作用进行检测，与预期相一致，FATS基因缺陷小鼠肿瘤微环境中的巨噬细胞对B16细胞的杀伤明显强于野生型小鼠肿瘤中的巨噬细胞(图19)。这一结果提示，FATS基因缺陷后黑色素瘤的肿瘤微环境中的巨噬细胞以M1/杀伤型巨噬细胞居多，使得杀伤肿瘤细胞的免疫应答显著强于野生型小鼠。这也进一步验证了，在FATS基因缺陷小鼠中，巨噬细胞的极化发生了改变，M1型巨噬细胞极化增加直接影响着肿瘤的免疫杀伤。

巨噬细胞的极化是非常复杂的。研究指出，脂肪组织相关巨噬向M1型极化中需要JNK信号。激活AKT1和2激酶调节PI3K信号。基因消融实验显示，AKT 1和2在调节巨噬细胞M1和M2型上具有相互作用。JAK/STAT信号对M1型巨噬有强的诱导作用，但是要是巨噬细胞完全极化为M1型巨噬需要激活TLR-4以及IFN-γ信号通路。亦有研究发现，二甲双胍可以通过Notch信号通路促进M1型巨噬细胞，抑制M2型巨噬细胞可以抑制肝癌细胞的生长。

有研究表明NF-κB信号通路对巨噬细胞的极化有着重要的作用。Duygu Sag等人证明Abcg1基因缺陷可以激活NF-κB信号通路，促进M1型巨噬细胞极化，同时也将黑色素瘤中的巨噬细胞从促进肿瘤的M2型转变为抑制肿瘤的M1型巨噬细胞，最终导致了黑色素瘤的生长的显著抑制。

NF-κB是一种核转录因子，可以调控多种基因的表达。NF-κB信号通路中，IκB家族成员(IκBα，Iκβ等)与p65(p65是NF-κB信号通路中的关键成员)结合，使p65处于没有活性状态。各种激活信号通过对IκB降解来激活NF-κB信号通路。我们对骨髓定向分化的巨噬细胞进行WB检测，发现FATS基因缺陷小鼠M0型巨噬细胞中p65表达增加，IκBα的表达下调，即NF-κB信号在FATS基因缺陷小鼠中要强于野生型小鼠(图24)，这提示FATS基因缺陷可以通过激活NF-κB信号通路来促进M1型巨噬细胞极化。

与此同时，我们发现了在M2型巨噬细胞极化条件极化后，FATS基因缺陷小鼠M2型巨噬细胞的凋亡比例增加，WB检测后发现凋亡信号(cleaved-caspase-3)增加，而抑制凋亡的信号(Bcl2)表达下降(图23)，这说明FATS基因缺陷促进了M2型巨噬细胞的凋亡，但是我们也发现，凋亡的比例增加并没有M2型巨噬细胞比例减少显著，这也提示，FATS基因缺陷小鼠M2型巨噬细胞的减少可能并不仅仅由于凋亡数目的增加，也由于巨噬细胞更倾向于M1型巨噬细胞极化，抑制M2型巨噬细胞极化引起。

三、FATS-KO小鼠骨髓来源巨噬细胞过继治疗实验

3.1对象和方法

3.1.1实验方法

3.1.1.1小鼠黑色素瘤皮下移植瘤模型构建

1)将B16细胞培养于10cm²培养皿中，用加有10％FBS，1％双抗的DMEM培养基培养，培养至对数生长期；

2)收集细胞并进行离心。

3)弃掉上清液，细胞沉淀用1倍的PBS吹打，1000rpm，离心，5min，弃上清，随后再重复1次；

4)收集到的B16细胞用1倍的PBS重悬，计数，调整细胞浓度至2×10⁶/ml；

5)提前半天时间，用脱毛膏将小鼠右后背部的毛脱去，注射细胞悬液前用75％酒精对小鼠注射部位进行消毒；

6)在每只小鼠的右后背部，注射100μl 2×10⁶/ml的B16细胞(共31只)，即每只小鼠注射B16细胞的数量为2×10⁵/只，进针后或出针前，可稍微改变针头的方向，注射时动作轻缓，出针后轻按针孔片刻，可避免细胞悬液漏出；

7)每天对小鼠的肿瘤生长情况进行观察，并用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长度与宽度，做好记录；

8)荷瘤后20天，麻醉后脱颈处死小鼠，分离小鼠的脾脏与肿瘤，肿瘤组织，照相，称重，并测量其长度与宽度，计算肿瘤的终体积；

9)小鼠的肿瘤体积计算公式为长×宽²/2(mm³)

3.1.1.2小鼠骨髓细胞分离：

1)麻醉后，脱颈处死小鼠，用75％酒精消毒双下肢，固定后剪开皮肤，分离肌肉组织，暴露胫骨，保留两侧关节，将胫骨取出，迅速置于冷的1倍PBS中；

2)去掉骨面上残余的组织，置于超净工作台中，沿关节剪开股两端，暴露出髓腔，用1ml注射器吸取1倍的PBS，将骨髓冲至培养皿中，反复冲洗，直至胫骨全部变为白色；

3)用1ml的枪将骨髓吹散至单细胞状态，随后收集细胞悬液至无菌的15ml离心管中，1000rpm，离心，5min；

4)弃上清，加入1ml 1倍的PBS，1000rpm，离心，5min；

5)弃上清，用含有10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，培养在细胞培养箱中。

3.1.1.3小鼠骨髓来源巨噬细胞定向分化：

1)分离出的骨髓细胞加入M-CSF(10ng/ml)培养5天，此时的细胞为M0型巨噬细胞(培养第三天需半量换液)；

2)M1型巨噬细胞极化：M0型巨噬细胞加入IFN-γ(20ng/ml)培养12h，随后加入LPS(100ng/ml)继续培养4h，即为M1型巨噬细胞；

3)M2型巨噬细胞极化：M0型巨噬细胞加入IL-4(20ng/ml)培养16h，即为M2型巨噬细胞。

3.1.2具体方法

选取10只C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，体重18-20g，皮下注射B16细胞，2×10⁵/只，构建小鼠皮下黑色素瘤移植瘤模型(具体步骤见3.1.1.1)，然后将小鼠随机分成两组，每组各5只。分别在小鼠荷瘤第2天和第7天，通过尾静脉注射的方式分别将野生型小鼠和FATS基因敲除小鼠骨髓来源的定向分化为M0型的巨噬细胞,过继输注到小鼠体内，注射前用LPS刺激12个小时，连续监测小鼠肿瘤大小。荷瘤16天后，将处死小鼠，分离肿瘤组织，称量肿瘤重量。然后利用小鼠肿瘤组织浸润单个核细胞分离液分离肿瘤组织中的单个核细胞，流式检测肿瘤中巨噬细胞的比例及M2型巨噬细胞的比例。

3.2结果

3.2.1 FATS基因缺陷的骨髓来源巨噬细胞过继治疗能明显抑制肿瘤生长

以上的研究结果提示，FATS基因缺陷的巨噬细胞可能在肿瘤的生长中具有中具有重要的杀伤能力，从而抑制肿瘤的生长。为了进一步证实FATS基因缺陷或低表达的巨噬细胞具有抑制黑色素瘤的生长作用，我们将野生型以及FATS基因缺陷的巨噬细胞或者沉默FATS基因以及对照的野生型巨噬细胞尾静脉注射到B16细胞荷瘤的小鼠体内对黑色素瘤进行过继治疗。结果发现，FATS基因缺陷的巨噬细胞过继治疗后，显著抑制了黑色素瘤的生长(图25A)，肿瘤最终的体积显著减小(图25B)，同时肿瘤的肿瘤也明显的下降(图25C)。

四、FATS-siRNA转染WT小鼠骨髓来源巨噬细胞进行过继治疗实验

4.1对象和方法

4.1.1主要材料、试剂与仪器设备

4.1.1.1主要试剂

Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染美国Invitrogen公司

试剂

FATS-siRNA 广州瑞博公司合成

4.1.2实验方法

4.1.2.1骨髓细胞向巨噬细胞定向诱导分化。

主要材料：2-3只C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，体重18-20g；PBS；RPMI1640完全培养基；10cm细胞培养皿。

骨髓细胞向巨噬细胞定向分化的培养基：1640完全培养基20ng/ml M-CSF

方法：脱颈处死小鼠，取股骨和胫骨，酒精浸泡2分钟→超净台，无菌PBS漂洗→1ml注射器冲出骨髓细胞，1500rpm离心，5min，弃上清，PBS洗一遍，RPMI1640完全培养基重悬计数→1.5×106细胞/皿，加入定向分化的培养基，培养5-6天→弃去未贴壁细胞，细胞刮子收获贴壁细胞，即为巨噬细胞，计数，调整细胞浓度为2.5×106个/ml，备用。(中间需添加5ml完全培养基带M-CSF)

4.1.2.2.巨噬细胞转染FATS-siRNA

主要材料：FATS-siRNA(广州瑞博公司合成，其对应的DNA序列如SEQ ID NO:2)；Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染试剂；PBS；RPMI1640完全培养基；12孔板。

方法：上述收获的巨噬细胞，5×10⁶个/孔，接种到12孔板中，细胞汇聚60-80％→参照下表，用RPMI1640完全培养基，分别稀释FATS-siRNA与Lipofectamine>

稀释FATS-siRNA与Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染试剂

1:1混合，室温静置5分钟,

siRNA-脂质混合液配制及细胞转染

混合液与细胞共孵育1-3天→镜下检测转染效率→定量PCR，进一步检测转染是否成功.

4.1.2.3巨噬细胞向M1型定向诱导极化

转染FATS-siRNA 24小时后，加入LPS(1μg/ml)诱导巨噬细胞向M1型极化，12小时后，收集细胞，计数，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，流式检测，确定巨噬细胞表型。注：空载体-巨噬细胞作为对照。

4.1.2.4 M1型巨噬细胞过继治疗肿瘤

动物：C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，体重18-20g。

肿瘤模型：B16小鼠黑色素瘤细胞2×10⁵/只小鼠皮下注射荷瘤。

方法：分别于小鼠皮下注射荷瘤后1、7天，将FATS-siRNA巨噬细胞1×106/只小鼠尾静脉注射过继治疗，16天后，处死小鼠。荷瘤期间，隔天监测肿瘤大小。注：转染NC-siRNA巨噬细胞作为对照。

4.2结果

4.2.1过继输注FATS-siRNA转染的骨髓来源的巨噬细胞能明显抑制肿瘤的生长

通过应用siRNA沉默野生型巨噬细胞中的FATS基因，我们将FATS/NC-siRNA转染到野生型的巨噬细胞中，随后用这两种巨噬细胞对黑色素瘤小鼠进行过继治疗，结果如图26所示，FATS基因沉默的巨噬细胞治疗后显著的抑制了黑色素瘤的生长。这些结果证实，巨噬细胞缺陷或者沉默FATS基因后对小鼠黑色素瘤具有治疗作用。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。