一种含EGFR酪氨酸激酶的低剂量药物组合物及其在制备预防肿瘤转移药物中的应用

摘要

一种含EGFR酪氨酸激酶的低剂量药物组合物及其在制备预防肿瘤转移药物中的应用。本发明提供一种低剂量的抗肿瘤转移的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含物质的量比为10:1‑5的熊果酸与吉非替尼。通过将具有靶向作用的吉非替尼与高效低毒的抗肿瘤天然产物熊果酸进行联合用药，证明其对癌细胞的具有良好的抗肿瘤转移作用，可望获得较为安全可靠的新型候选药物。

说明书

技术领域

本发明属于抗肿瘤转移药物领域，具体地，本发明涉及一种低剂量用于具有抗肿瘤转移的药物组合物。

背景技术

熊果酸即3β-羟基-熊果-12-烯-28-酸（3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid，简称UA），又名乌索酸、属于a-香树脂醇（a-amyrin）型五环三萜类化合物，其相对分子量为456.68，分子式为C₃₀H₄₈O₃，结构如式Ⅰ所示是自然界中分布较广的天然活性化合物，主要以游离或糖苷的形式存在其广泛分布于枇杷叶、熊果、山楂、白花蛇舌草等多种天然植物中，也是许多传统中药的主要活性成分之一，具有广泛的药理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化等其中以抗癌活性最为显著，不仅对多种致癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细胞在体内、外均有抑制作用。因其副作用小，毒性低，显示出较大的临床应用潜力。近年来国内外对UA的抗肿瘤研究日趋深入，并发现其在肿瘤预防、治疗以及防止晚期复发转移等方面有着独特的优势及潜在的应用前景。专利N201510097801.9公开了一种含有熊果酸和环磷酰胺的药物组合物，所述组合物既可以增强单组分的抗肿瘤药效，也能降低其对正常组织的毒性，从而提高肿瘤治疗的效果，在肿瘤治疗领域具有很大的应用前景。专利N03150714.X公开了熊果酸对人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人淋巴瘤细胞、人成淋巴细胞白血病和人急性成淋巴细胞白血病、人急性早幼粒白血病及人慢性髓性白血病都有细胞毒效应。

吉非替尼（化学名：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉丙氧基)喹唑啉-4-胺），英文名：Gifitinid，结构如式Ⅱ所示,是一种选择性表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，适用于表皮生长因子受体酪氨酸激酶（EGFR TK）基因具有敏感突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的三线、二线甚至一线治疗。吉非替尼为难溶性药物，其在水溶液中的溶解性呈pH依赖性，即在pH越低的水溶液中溶解度越大，在pH值7左右的水中几乎不溶；，吉非替尼对部分EGFR存在突变的患者具有一定的治疗作用，但是，病人一般在1-2年内会发生复发或者转移，或者产生新的突变而对吉非替尼产生耐药，所以，即使使用吉非替尼（酪氨酸激酶抑制剂）治疗仍然不能提高非小细胞肺癌患者的五年总生存期。专利N201210566665.X公开了一种含有吉非替尼的片剂，它其能持续、平稳释放有效成分、对既往接受过化学治疗的局部晚期肺癌或转移性非小细胞肺癌达到良好的治疗效果。

以不同癌细胞系作为研究对象，通过将熊果酸和吉非替尼联合用药，对不同癌细胞系进行体外抗癌活性测试，结果表明，熊果酸和吉非替尼的的联合使用在低剂量的条件下对癌细胞特别是非小细胞肺癌的增殖迁移、侵袭等具有显著的抑制作用，且呈浓度和时间依赖性的抑制癌细胞的增殖。

发明内容

本发明的目的就是提供一种低剂量的抗肿瘤转移的药物组合物，通过将具有靶向作用的吉非替尼与高效低毒的抗肿瘤天然产物熊果酸进行联合用药，考察其联合用药后对癌细胞的抗转移作用，可望获得较为安全可靠的新型候选药物。

一种低剂量具有抗肿瘤转移的药物组合物及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用，其特征在于该药物组合物包含物质的量比为10:1-5的熊果酸与吉非替尼，两者联用可以起到协同抗癌转移的效果。

附图说明

图1.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h对A549细胞增殖的抑制结果；

图2.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h对H1975细胞增殖的抑制结果；

图3.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h对H1650细胞增殖的抑制结果；

图4.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h对A549细胞侵袭能力的抑制结果；

图5.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h对A549细胞侵袭的抑制率；

图6.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h对H1975细胞侵袭的抑制率；

图7.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h后对A549细胞迁移能力的抑制结果；

图8.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h对A549细胞迁移的抑制率；

图9.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h对H1975细胞迁移的抑制率；

图10. 熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用对H1975细胞RGD、ICAM-1、EGFR、VCAM-1蛋白表达水平的影响；

图11. 熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用对H1975细胞RGD、ICAM-1、EGFR、VCAM-1蛋白表达的情况。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例 1

熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24 h对不同肺癌细胞系的增殖抑制作用：采用标准MTT比色法测定了熊果酸和吉非替尼不同联合比例对不同肺癌细胞系的增殖抑制活性，结果如图1-3所示。

如图1-3所示，当熊果酸（10 μM）和吉非替尼（1-5 μM）在低浓度范围内联合用药24h后，其对癌细胞无明显增殖抑制作用且对正常细胞的毒副作用小，因此后续我们选择将安全有效的低剂量浓度（无明显细胞杀伤作用）的熊果酸和吉非替尼联用，继续研究其对肺癌细胞侵袭及转移的抑制能力，以探索其在抗肿瘤转移领域应用的潜力。

实施例2

熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用对A549细胞株侵袭能力的影响

A549细胞先加无血清无酚红培养基饥饿过夜，消化、离心收集的细胞含不同药物浓度的空白培养基悬浮。取12孔板，在小室的上室中加入500 μL含不同药物浓度的细胞悬浮液(约5×10⁵/孔)，下室加500>

实验结果如图4、5所示熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用24 h后对A549细胞株侵袭能力的检测，结果表明, 空白对照组、UA=10 μM和吉非替尼（5 μM条件下）单独使用组，穿过微孔滤膜的细胞数明显高于熊果酸和吉非替尼联合用药组，细胞的侵袭能力减弱，侵袭能力明显受到了抑制。

实施例3

熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用对H1975细胞株侵袭能力的抑制率，步骤同实施例2，结果如图6所示。

实验结果如图6所示熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用24 h后对H1975细胞株侵袭能力抑制率的检测，结果表明, 空白对照组、UA（10 μM条件下）和吉非替尼（5 μM条件下）单独使用组，大约在百分70-80%的H1975细胞侵袭透过小室，当两者联合给药的时候，大约只有百分35%的H1975侵袭透过小室，两者联用明显降低了H1975细胞的侵袭能力。

实施例4

熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用对A549细胞株迁移能力的影响

取对数生长期的细胞(约3×10⁶/孔)接种于该板中，置于37℃,5%>2 的培养箱中培养24 h,待细胞接近融合后，用白色枪头在孔板的1/4、1/2、3/4处垂直的划三条平行线，用PBS清洗细胞3次，在荧光显微镜下拍划痕宽带，记录下所拍图片的坐标轴。加入含不同药物浓度的培养基，置于37℃,5%>2>

实验结果如图7、8所示，熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用24 h后对A549细胞株细胞迁移抑制率检测，结果表明：在0 h，给药干预组与空白对照组对比迁移距离无明显影响，经给药24 h后，空白对照组细胞发生了很明显的迁移，划痕宽带变窄；当UA浓度为10 μM的条件和吉非替尼在5 μM的条件下细胞也都明显的发生了迁移；但当两者联合使用后，在吉非替尼在5 μM的情况下，划痕宽带明显比单用吉非替尼大。因此两者联合用药，能协同抑制细胞的迁移能力，划痕宽度与空白对照组相比差异明显且具有统计学意义（P<0.01）。

实施例5

熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用对H1975细胞株迁移能力的抑制率，步骤同实施例4，结果如图9所示。

实验结果如图9所示，熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用24 h后对H1975细胞株细胞迁移抑制率检测，结果表明：在0 h，给药干预组与空白对照组对比迁移距离无明显影响，经给药24 h后，空白对照组细胞划痕宽带变窄，细胞明显的发生了迁移；当UA浓度为10 μM的条件和吉非替尼在5 μM的条件下细胞也都明显的发生了迁移，但迁移距离没有空白对照组的明显；但当两者联合使用后，在吉非替尼在5 μM的情况下，划痕宽带明显比单用吉非替尼和熊果酸大。因此两者联合用药，能协同抑制细胞的迁移能力，划痕宽度与空白对照组相比差异明显且具有统计学意义（P<0.01）。

实施例6

熊果酸和吉非替尼单独使用以及联合使用对H1975细胞RGD、ICAM-1、EGFR、VCAM-1蛋白表达水平的影响

将细胞接种至6孔板，待细胞达80％以上加不同药物干预细胞24 h后，弃去培养液，用预冷的PBS漂洗细胞2次，向6孔板中的每孔加入新鲜配制的细胞裂解液 RIPA（radioimmunopre-cipitation assay）200 μL[1 mL RIPA中加入10 μL蛋白酶抑制剂、10 μL磷酸酶抑制剂和5μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）]，冰上放置30 min，每5 min摇晃一次，12000×g 4℃离心15 min，取上清液，制备总蛋白；采用二喹啉甲酸（bicincho-ninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以β-actin水平作为等量蛋白质上样，取20 μg蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，然后将分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene, PVDF）膜上，室温下用含5％脱脂奶粉的TBST封闭1 h，加入一抗4℃反应过夜，次日用TBST室温下洗膜3次（10 min/次），再加入HRP标记的二抗（1:5000稀释）在室温下孵育1 h，用TBST在室温下再次洗膜3次（10 min/次），最后电化学发光显影。采用图像分析软件Image J对条带进行灰度值分析，结果如图10、11所示。

实验结果如图10、11所示，空白对照组不影响RGD、ICAM-1、EGFR、VCAM-1蛋白水平的表达；UA浓度0 μM和吉非替尼在5 μM的条件下，对RGD、ICAM-1、EGFR、VCAM-1蛋白表达水平的影响不大；但当两者联合给药，就能起到协同增效的作用，能够明显的抑制RGD、ICAM-1、EGFR、VCAM-1蛋白表达水平，通过下调RGD、ICAM-1、EGFR及VCAM-1的水平进而抑制癌细胞的增殖、抑制细胞的转移。