流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法

摘要

本案涉及流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法，包括：将采集到的鸡静脉血加入到等体积的分离剂中混合3‑6min；200‑500rpm离心，去上清，得到鸡红细胞；采用磷酸缓冲液洗涤所获得的鸡红细胞；将鸡红细胞分散于保存液中。本案中的鸡红细胞制备方法仅需两步即可完成，可作为很好的产品开发方案；将逐步改变国内流式细胞仪用试剂对进口试剂的依赖，大大降低流式细胞仪的应用成本；与此同时，该试剂的大量生产可推动临床肿瘤倍体检测的方便进行，提高肿瘤治疗质量；所获得的鸡红细胞产品可在常温下可至少保存3个月，4℃下则可保存至少1年以上，且所有试剂均可在带菌条件下进行，从而避免了无菌操作的复杂步骤，降低细胞制备成本。

说明书

技术领域

本发明属于医疗检测用试剂领域，具体涉及一种流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法。

背景技术

流式细胞仪是目前生命科学领域最先进的仪器之一，可高通量的提供细胞多级信息。为保证准确性，流式细胞仪在使用前均需使用标准试剂进行校准，但在实际使用中，流式细胞仪需要采用校准试剂来进行校准与稳定性分析，之后才能进行样品检测。鸡红细胞是早期流式细胞仪校准与稳定性评估的主要试剂之一，即便在更稳定的微球质控品出现后，其仍可被用于流式细胞仪的粗略校准，从而节省微球的用量，降低仪器应用成本。同时，由于鸡红DNA含量稳定为正常人体细胞的1/3，可在流式细胞仪上与人正常细胞或超二倍体细胞峰完全分开，因而可被用于检测肿瘤的诊断及判定预后。然而目前市售的流式细胞仪用鸡红细胞主要来至于进口，价格昂贵且供货周期长。给流式细胞仪的应用来了很多不便。

目前国内外尚无公开的鸡红细胞产品开发方案，有限的文献报道中所提供的制备方法往往倾向于仅采用磷酸缓冲盐溶液洗涤及离心的方法进行，但采用这种手段获得的产品在流式细胞仪上的分辨率较低，仅能用于粗略校准，且受限于不同的实验环境，各研究组的检测结果也有所差别，无法作为产品开发的标准依据。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供了一种流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法，其能够作为一种标准方法，方便而稳定地制备鸡红细胞，从而配合流式细胞仪使用，并可作为产品开发的标准依据。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法，其包括：

将采集到的鸡静脉血加入到等体积的分离剂中混合3-6min；

200-500rpm离心，去上清，得到鸡红细胞；

采用磷酸缓冲液洗涤所获得的鸡红细胞；

将鸡红细胞分散于保存液中。

优选的是，所述的流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法，其中，所述分离剂包括有0.01-0.05M的Na₂HPO₄、0.01-0.05M的NaH₂PO₄、0.5-2wt％的葡萄糖、6-12wt％的右旋糖酐、0.1-0.3wt％的乙二胺四乙酸二钠、0.1-1wt％的甘氨酸、1-3wt％的甘草酸和0.1-0.3wt％的月桂醇聚氧乙烯醚。

优选的是，所述的流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法，其中，所述保存液包括有1-2wt％的甘油、0.1-0.3wt％的叠氮钠、3-5wt％的多聚甲醛、0.1-0.3wt％的曲拉通和0.01-0.03wt％的聚氧乙烯醚。

优选的是，所述的流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法，其中，所述分离剂的pH为7.3-7.5。

优选的是，所述的流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法，其中，所述保存液还包括有0.01-0.03wt％的脱氢乙酸钠。

本发明的有益效果是：

1、本案中的鸡红细胞制备方法仅需两步即可完成，同时所获得的产品可长期保存，因此可很好的作为产品开发方案。

2、逐步改变国内流式细胞仪用试剂对进口试剂的依赖，大大降低流式细胞仪的应用成本。与此同时，该试剂的大量生产可推动临床肿瘤倍体检测的方便进行，提高肿瘤治疗质量。

3、本方法中所获得的鸡红细胞产品可在常温下可至少保存3个月，4℃下则可保存至少1年以上，且所有试剂均可在带菌条件下进行，从而避免了无菌操作的复杂步骤，降低细胞制备成本。

附图说明

图1是采用流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法所获鸡红细胞的400倍显微镜图。

图2是采用流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法所获鸡红细胞的200倍显微镜图。

图3是采用流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法所获的鸡红细胞在常温下保存90天后的流式细胞仪检测结果图；图3表明鸡红细胞即便在保存了90天后，依然具备很好的校准性能。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本案列出一实施例的流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备方法，其包括：

将采集到的鸡静脉血加入到等体积的分离剂中混合3-6min；

200-500rpm离心，去上清，得到鸡红细胞；

采用磷酸缓冲液洗涤所获得的鸡红细胞；

将鸡红细胞分散于保存液中。

其中，分离剂包括有0.01-0.05M的Na₂HPO₄、0.01-0.05M的NaH₂PO₄、0.5-2wt％的葡萄糖、6-12wt％的右旋糖酐、0.1-0.3wt％的乙二胺四乙酸二钠、0.1-1％的甘氨酸、1-3wt％的甘草酸和0.1-0.3wt％的月桂醇聚氧乙烯醚，其余为水。Na₂HPO₄和NaH₂PO₄起到缓冲液的作用，使pH值维持在7.3-7.5之间；葡萄糖在这里的作用是能量试剂，用于给细胞供给能量；右旋糖酐在这里的作用是为了让红细胞沉降，与白细胞分离；乙二胺四乙酸二钠是一种细胞分散试剂；甘氨酸是细胞膜表面蛋白的稳定剂；甘草酸在这里是一种抗氧化剂，其主要用于治疗细胞在分离过程中易发生的过氧化损伤；月桂醇聚氧乙烯醚作为一种抗震保护剂，主要作用在于降低分离过程中存在的切削力损伤。

在上述实施例中，保存液包括有1-2wt％的甘油、0.1-0.3wt％的叠氮钠、3-5wt％的多聚甲醛、0.1-0.3wt％的曲拉通和0.01-0.03wt％聚氧乙烯醚，其余为水。甘油的作用有两点：1)细胞膜保护剂，甘油可以增加溶液粘度，从而降低对细胞的震荡，同时，它降低体系极性，保持细胞膜的流动性和膜上蛋白的稳定性；2)防震剂，其主要用于在运输过程中减小因震荡造成的细胞损坏。叠氮钠在这里是一种抗菌剂与防腐剂；多聚甲醛是一种固定剂，其通过 使细胞膜表面蛋白变性来稳定结构，使细胞的构型不会再发生变化。曲拉通的作用是：1)细胞膜通透剂，其可在细胞膜上制造小孔，方便染色剂进入；2)防震剂，其主要用于在运输过程中减小因震荡造成的细胞损坏。聚氧乙烯醚作用则为稳定细胞骨架及缓解固定剂对细胞的损伤，同时具有稳定染色效果，使流式细胞仪检测结果保持在稳定范围内。

在上述实施例中，分离剂的pH优选为7.3-7.5。

作为本案另一实施例，其中，保存液还优选包括有0.01-0.03wt％的脱氢乙酸钠。脱氢乙酸钠是一种防变质剂，其用于在运输过程中，当冷藏系统发生意外故障时，储藏温度会升高，脱氢乙酸钠可以用于短期内保证细胞不发生变质，但其所能承受的防变质温度上限为40℃，若不添加脱氢乙酸钠，正常的鸡红细胞在40℃下仅能保持5分钟的有效性，而当添加脱氢乙酸钠后，其维持时间可以达到半小时，以此来争取到足够的时间对冷藏系统进行修复或对鸡红细胞进行应急转移处理。但脱氢乙酸钠的用量应被限制，若超出优选的范围，将会抑制曲拉通对细胞膜的通透作用。

将得到的鸡红细胞进行碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，CV值在6％以下的，可用于后续试验。

对比试验：

(1)在上述实施例(未添加脱氢乙酸钠)中，将曲拉通替换为同比例的SDS(十二烷基硫酸钠)或吐温：

保存时间常温4℃曲拉通90d370dSDS75d300d吐温80d320d

(2)在上述实施例(未添加脱氢乙酸钠)中，将多聚甲醛替换为同比例的戊二醛、甲醛或70％冰乙醇：

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。