一种蜂胶软胶囊深加工产品中栀子苷含量的检测方法

摘要

本发明涉及质量控制技术领域，特别涉及一种蜂胶软胶囊深加工产品中栀子苷含量的检测方法。该检测方法包括：将明胶胶囊与水混合，进行超声处理，得到明胶溶液；将明胶溶液与乙酸锌溶液、亚铁氰化钾溶液、无水乙醇混合，静置沉淀，离心，取上清，获得供试液；采用高效液相色谱技术检测供试液中栀子苷的含量。本发明提供的检测方法可将栀子苷从明胶胶囊中充分分离，从而能够准确检测明胶胶囊中栀子苷的含量；本发明检测方法线性、重复性、稳定性良好，精密度高，空白对测定结果基本无干扰，检出限、定量限低，回收率高。

说明书

技术领域

本发明涉及质量控制技术领域，特别涉及一种蜂胶软胶囊深加工产品中栀子苷含量的检测方法。

背景技术

蜂胶中含有丰富而独特的黄酮类、萜烯类物质，对多种细菌、真菌、病毒等有显著的抑制和杀灭作用。可以用来治疗脚气、灰指甲、湿疹、各种溃疡、牙周炎、喉炎、鼻炎、胃炎、泌尿系统感染、感冒、痔疮、腹泻等病原微生物引起的疾病。用量小、见效快，不产生耐药性，不破坏有益菌落。从蜂胶中已分离出数种可以直接抑制、杀灭癌细胞的天然物质(PRCA)，使得蜂胶对肿瘤、息肉有很好的预防和治疗效果。蜂胶中的黄酮类物质含量丰富，具有很好的活血化瘀、软化血管、降血脂、阻止血小板凝聚、改善微循环等作用。对血管硬化、梗塞、血栓、高血脂等有很好的预防和治疗效果。

蜂胶软胶囊是采用优质提纯蜂胶加工溶解后，以适当比例加入色拉油中，在标准GMP车间制成软胶囊，其特点是吸收迅速，便于服用及携带，口感好，易于保存。蜂胶软胶囊采用的胶囊皮为明胶曩材，明胶囊材本身是透明的，而蜂胶内容物很容易出现分层现象，从而影响消费者的感官感受。为了改善消费者的感官感受，明胶囊材中可添加栀子黄进行着色，染成不透明的、均匀的淡黄色。

栀子黄，别名藏花素，俗称黄栀子，属类胡萝卜素系列，它是栀子中的黄色色素，分子式为C₄₄H₆₄O₂₄，相对分子质量976.97。栀子黄可用于果汁型饮料、配制酒、糕点上彩妆、冰棍、雪糕、膨化食品、果冻、面饼、糖果和栗子罐头等。栀子黄色素主要成分包括类胡萝卜素类的藏花素和藏花酸，含有环烯醚萜苷类的栀子苷以及黄酮、绿原酸。根据GB2760-2014规定栀子黄的最大添加量是0.3g/kg，因为栀子苷是栀子黄的主要成分，因此为了控制蜂胶软胶囊曩材中栀子黄的添加量，需要检测曩材中栀子苷的含量。

然而，在实际检测过程中，由于用于溶解栀子苷的有机溶剂无法溶解明胶，又加之栀子苷的含量是微量的，所以很难准确检测到明胶胶囊中栀子苷的含量。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种蜂胶软胶囊深加工产品中栀子苷含量的检测方法。该检测方法可准确检测明胶胶囊中栀子苷的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种明胶胶囊中栀子苷含量的检测方法，包括：

步骤1：将明胶胶囊与水混合，进行超声处理，得到明胶溶液；

步骤2：将明胶溶液与乙酸锌溶液、亚铁氰化钾溶液、无水乙醇混合，静置沉淀，离心，取上清，获得供试液；

步骤3：采用高效液相色谱技术检测供试液中栀子苷的含量。

作为优选，超声处理的温度为40～50℃。

优选地，超声处理的温度为40℃。

作为优选，检测方法中所用试剂的用量比例为：

在本发明提供的实施例中，该检测方法中所用试剂的用量比例为：

作为优选，静置沉淀的温度为2～8℃，时间为1～2h。

优选地，静置沉淀的温度为4℃，时间为2h。

作为优选，离心的转速为5000～8000r/min，时间为3～5min。

在本发明提供的实施例中，离心的转速为8000r/min，时间为5min。

在本发明提供的实施例中，步骤1前还包括前处理步骤，前处理包括：取包含内容物的明胶胶囊，除去内容物，采用第一有机溶剂和第二有机溶剂进行清洗，第一有机溶剂为石油醚和/或乙醚，第二有机溶剂为无水甲醇或无水乙醇。

在本发明提供的实施例中，内容物为蜂胶。

在本发明提供的实施例中，石油醚为石油醚I。

作为优选，步骤2中取上清和获得供试液之间还包括过滤的步骤。

在本发明提供的实施例中，采用0.45μm的有机相滤膜过滤。

作为优选，高效液相色谱的流动相为乙腈水溶液或甲醇水溶液。

作为优选，乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为15:85。

作为优选，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为35:65。

作为优选，流动相的流速为0.8～1.0mL/min。

优选地，流动相的流速为1.0mL/min。

作为优选，高效液相色谱的检测波长为238～240nm。

优选地，高效液相色谱的检测波长为238nm。

作为优选，高效液相色谱的柱温为30～40℃。

优选地，高效液相色谱的柱温为40℃。

作为优选，高效液相色谱的色谱柱为Phenomenex Gemini-NX色谱柱、Phenomenex Synergi Hydro-RP色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱或Inertsil ODS-SP色谱柱。

在本发明提供的实施例中，色谱柱的型号为C18，规格为250×4.6mm，5μm。

本发明提供了一种蜂胶软胶囊深加工产品中栀子苷含量的检测方法。该检测方法包括：将明胶胶囊与水混合，进行超声处理，得到明胶溶液；将明胶溶液与乙酸锌溶液、亚铁氰化钾溶液、无水乙醇混合，静置沉淀，离心，取上清，获得供试液；采用高效液相色谱技术检测供试液中栀子苷的含量。本发明至少具有如下优势之一：

1、本发明提供的检测方法可将栀子苷从明胶胶囊中充分分离，从而能够准确检测明胶胶囊中栀子苷的含量；

2、本发明检测方法线性、重复性、稳定性良好，精密度高，空白对测定结果基本无干扰，检出限、定量限低，回收率高，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明该栀子苷含量检测方法科学有效，能对蜂胶软胶囊的栀子苷含量起到质量控制的目的。

附图说明

图1～5分别为标准序号为STD1～STD5对照品的色谱图，示本发明检测方法的线性关系；

图6示根据标准序号为STD1～STD5对照品中栀子苷的浓度绘制的标准工作曲线；

图7～12为对照品溶液重复测定6次得到的色谱图，示本发明检测方法的精密度；

图13～18为试样重复测定6次得到的色谱图，示本发明检测方法的重复性；

图19～24为对照品溶液在室温下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后得到的色谱图，示本发明检测方法的稳定性；

图25示空白溶液的色谱图；

图26示本发明检测方法的检出限；

图27示本发明检测方法的定量限；

图28～36为序号为1～9样品的色谱图，示本发明检测方法的回收率。

具体实施方式

本发明公开了一种蜂胶软胶囊深加工产品中栀子苷含量的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明检测方法的检测原理：用石油醚和甲醇洗去蜂胶软胶囊的内容物，超声处理，用水加热溶解胶囊材，用乙酸锌溶液、亚铁氰化钾溶液和无水乙醇沉淀蛋白，离心除去沉淀，用高效液相色谱C18柱将栀子苷分离，检测器检测，并用外标法定量。

本发明提供的蜂胶软胶囊深加工产品中栀子苷含量的检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1栀子苷含量的检测

仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪(配VWD或DAD检测器)。

试剂试药：石油醚Ⅰ(AR)；甲醇(AR)；无水乙醇(AR)；乙酸锌(AR)；亚铁氰化钾(AR)；乙腈(色谱纯)；一级用水。

栀子苷对照品来源：中国食品药品检定研究院，批号:110749-201115，纯度:99.7％。

分析步骤：

1、色谱条件：

流动相：乙腈：水＝15：85；

流速：1.0mL/min；

波长：238nm；

柱温：40℃

运行时间：25min

色谱柱：Phenomenex Gemini-NX,C18,250×4.6mm，5μm。

2、对照储备液的配制：

精密称取栀子苷对照品5.09mg，置于50mL棕色容量瓶中，加入流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得储备液。储备液放在4℃的冰箱中储存备用。

3、标准工作曲线绘制：

精密吸取栀子苷储备液100μL，置于25mL棕色容量瓶中，加入流动相定容至刻度，摇匀，即得工作溶液，分别精密吸取工作溶液2μL、5μL、10μL、20μL、30μL，在上述色谱条件下，进行分析测定，绘制标准工作曲线。

4、试样制备：

精密称取蜂胶软胶囊样品4粒(约2.7g)，对半剪开胶囊皮，除去内容物，胶囊皮置于50mL离心管中，加入25mL石油醚Ⅰ震摇10秒，弃去石油醚Ⅰ，重复洗胶囊皮5次；加入25mL无水甲醇震摇10秒，弃去无水甲醇；胶囊皮置另一干净离心管，加10mL水，40℃超声，不时震摇至胶囊皮完全溶解；放冷，加0.5mL乙酸锌溶液(219g/L)和0.5mL亚铁氰化钾溶液(106g/L)，用无水乙醇定容至25mL，摇匀后，放至4℃的冰箱静置沉淀2h；8000r/min离心5min，取上清，经0.45μm的有机相滤膜过滤，即得供试液。精密吸取供试液10μL，在上述色谱条件下，进行分析测定。

5、结果计算：

X＝C×V/M×K

式中：X—样品中栀子苷的含量，mg/kg；

M—样品的质量，g；

K—单位转换系数(K＝1)；

V—样品的稀释倍数，mL；

C—样品溶液中栀子苷的浓度，μg/mL。

6、方法学验证：

(1)线性范围确认：

试验数据见表1：(色谱图见附图1～5)

表1 线性范围确认试验结果

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线如图6所示。

线性试验结论：相关系数R为0.99976，所以用该方法测定栀子苷在浓度为0.0811957μg/mL至1.218μg/mL之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求相关系数R≥0.99】。

(2)精密度试验

试验方法：将栀子苷的对照品溶液按上述色谱条件重复测定6次，计算其峰面积RSD(％)。

试验数据见表2：(色谱图见附图7～12)

表2 精密度试验结果

试验结论：栀子苷重复测定6次峰面积的RSD(％)为2.0％，表明该方法有较好的精密度。

(3)重复性试验：

试验方法：称取6份样品，按上述试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD(％)。

试验数据见表3：(色谱图见附图13～18)

表3 重复性试验结果

试验结论：6份样品栀子苷含量的RSD为1.7％，表明该方法有较好的重复性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤7.5％】。

(4)稳定性试验

试验方法：将栀子苷对照品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后，按上述色谱条件测定峰面积，计算其RSD(％)。

试验数据见表4：(色谱图见附图19～24)

表4 稳定性试验结果

试验结论：栀子苷对照品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后，RSD(％)为2.9％，表明栀子苷对照品溶液在室温下12小时内的稳定性良好。

(5)空白试验

试验方法：不称取样品，按上述试样制备方法处理空白溶液，按上述色谱条件测定空白溶液，与栀子苷对照品溶液的出峰时间对比。

试验结果见图25。

试验结论：空白溶液在栀子苷的出峰时间处均无吸收峰，表明空白对测定结果基本无干扰。

(6)检出限与定量限试验

检出限和定量限色谱图分别见26、27。

分析方法的定量限和检出限由信噪比(S/N)计算。当信噪比(S/N)为3时，检出限为0.024359μg/mL；得到方法的检出限为0.226mg/kg。当信噪比(S/N)为10时，定量限为0.081196μg/mL；得到方法的定量限为0.752mg/kg。

(7)回收率试验：

试验方法：

加标：精密称取约2.7g样品9份(已知样品的栀子苷含量：3.518mg/kg)，分成3组，每组3份，按上述试样制备方法处理样品。在“加10mL水，40℃超声”步骤时，各组分别精密加入栀子苷的储备液15μL、45μL、120μL。

试验数据如表5：(色谱图见附图28～36)

表5 回收率试验结果

测得加入量＝加标样品测得量-样品测得量

回收率(％)＝测得加入量/理论加入量

试验结论：平均回收率为：95.3％，相对标准偏差(RSD)为1.6％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为90—110％】。

结论：

通过对栀子苷的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对蜂胶软胶囊的栀子苷含量起到质量控制的目的。

实施例2栀子苷含量的检测

仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪(配VWD或DAD检测器)。

试剂试药：石油醚Ⅰ(AR)；甲醇(AR)；无水乙醇(AR)；乙酸锌(AR)；亚铁氰化钾(AR)；乙腈(色谱纯)；一级用水。

栀子苷对照品来源：中国食品药品检定研究院，批号:110749-201115，纯度:99.7％。

分析步骤：

1、色谱条件：

流动相：乙腈：水＝15：85；

流速：0.9mL/min；

波长：239nm；

柱温：35℃；

运行时间：25min

色谱柱：PHenomenex Synergi Hydro-RP色谱柱。

2、对照储备液的配制：

精密称取栀子苷对照品5.09mg，置于50mL棕色容量瓶中，加入流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得储备液。储备液放在4℃的冰箱中储存备用。

3、标准工作曲线绘制：

精密吸取栀子苷储备液100μL，置于25mL棕色容量瓶中，加入流动相定容至刻度，摇匀，即得工作溶液，分别精密吸取工作溶液2μL、5μL、10μL、20μL、30μL，在上述色谱条件下，进行分析测定，绘制标准工作曲线。

4、试样制备：

精密称取样品4粒(已知栀子苷含量:3.0mg/kg)，对半剪开胶囊皮，除去内容物，胶囊皮置于50mL离心管中，加入30mL石油醚Ⅰ震摇10秒，弃去石油醚Ⅰ，重复洗胶囊皮5次；加入30mL无水甲醇震摇10秒，弃去无水甲醇；胶囊皮置另一干净离心管，加8mL水，45℃超声，不时震摇至胶囊皮完全溶解；放冷，加0.8mL乙酸锌溶液(219g/L)和0.8mL亚铁氰化钾溶液(106g/L)，用无水乙醇定容至25mL，摇匀后，放至2℃的冰箱静置沉淀1.5h；8000r/min离心5min，取上清，经0.45μm的有机相滤膜过滤，即得供试液(栀子苷的理论浓度为：0.3240μg/mL)。精密吸取供试液10μL，在上述色谱条件下，进行分析测定。

5、结果计算：

X＝C×V/M×K

式中：X—样品中栀子苷的含量，mg/kg；

M—样品的质量，g；

K—单位转换系数(K＝1)；

V—样品的稀释倍数，mL；

C—样品溶液中栀子苷的浓度，μg/mL。

6、含量检测结果：

表6 栀子苷含量检测结果

实施例3栀子苷含量的检测

仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪(配VWD或DAD检测器)。

试剂试药：石油醚Ⅰ(AR)；甲醇(AR)；无水乙醇(AR)；乙酸锌(AR)；亚铁氰化钾(AR)；乙腈(色谱纯)；一级用水。

栀子苷对照品来源：中国食品药品检定研究院，批号:110749-201115，纯度:99.7％。+

分析步骤：

1、色谱条件：

流动相：甲醇：水＝35：65；

流速：0.8mL/min；

波长：240nm；

柱温：30℃；

运行时间：25min

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱。

2、对照储备液的配制：

精密称取栀子苷对照品5.09mg，置于50mL棕色容量瓶中，加入流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得储备液。储备液放在4℃的冰箱中储存备用。

3、标准工作曲线绘制：

精密吸取栀子苷储备液100μL，置于25mL棕色容量瓶中，加入流动相定容至刻度，摇匀，即得工作溶液，分别精密吸取工作溶液2μL、5μL、10μL、20μL、30μL，在上述色谱条件下，进行分析测定，绘制标准工作曲线。

4、试样制备：

精密称取样品4粒(已知栀子苷含量:3.8mg/kg)，对半剪开胶囊皮，除去内容物，胶囊皮置于50mL离心管中，加入15mL乙醚震摇10秒，弃去乙醚，重复洗胶囊皮5次；加入15mL无水乙醇震摇10秒，弃去无水乙醇；胶囊皮置另一干净离心管，加5mL水，50℃超声，不时震摇至胶囊皮完全溶解；放冷，加1mL乙酸锌溶液(219g/L)和1mL亚铁氰化钾溶液(106g/L)，用无水乙醇定容至25mL，摇匀后，放至8℃的冰箱静置沉淀1h；8000r/min离心5min，取上清，经0.45μm的有机相滤膜过滤，即得供试液(栀子苷的理论浓度为：0.4104μg/mL)。精密吸取供试液10μL，在上述色谱条件下，进行分析测定。

5、结果计算：

X＝C×V/M×K

式中：X—样品中栀子苷的含量，mg/kg；

M—样品的质量，g；

K—单位转换系数(K＝1)；

V—样品的稀释倍数，mL；

C—样品溶液中栀子苷的浓度，μg/mL。

6、含量检测结果：

表7 栀子苷含量检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。